Герасименко В.Г., Герасименко М.О., Цвіліховський М.І. та ін. Біотехнологія

Подождите немного. Документ загружается.

5.1.2. Плазміди і віруси як донорні переносники генетич<

ної інформації

У молекулярній біології і генетичній інженерії як вектор

(переносник) генів, що не мають аналогів у ДНК клітиніреци

пієнта, і тому не здатні брати участь у гомологічній рекомбіна

ції, найчастіше використовують плазміди і фаг

λ. Плазміди — це

невеликі кільцеві молекули позахромосомної ДНК, що, на від

міну від класичних генів, знаходяться в цитоплазмі бактеріаль

них клітин і клітин деяких дріжджів. У зв’язку з цим плазміди

часто називають екстрахромосомними генетичними елемента

ми. Автономне існування плазмід пов’язане з тим, що механіз

ми, які лежать в основі їхньої реплікації, незалежні від механіз

мів, що регулюють розмноження бактеріальної хромосоми.

Плазміди мають здатність вбудовуватися в геном клітинихазя

їна і знаходитися нескінченно довго в інтегрованому з ДНК бак

терії стані. У цьому випадку генетичний матеріал плазміди по

водиться подібно хромосомним генам бактерії, у які вона

вмонтувалася. Відомі сьогодні плазміди розрізняються між со

бою розмірами, що є наслідком неоднакового обсягу генетичної

інформації, що міститься у них; різними механізмами регуляції

їхньої реплікації, що залежать від розходжень у ферментних си

стемах, що забезпечують ці механізми. Залежно від молекуляр

ної маси плазміди поділяються на дрібні (середня молекулярна

маса 5x10

) і великі (приблизно встановлена гранична молеку

лярна маса 150–10

— 170–10

До складу молекули плазмідної ДНК входить від 2250 до

400 тис. пар нуклеотидів. У клітинах бактерій кращою є конфі

гурація ДНК у вигляді дволанцюгових ковалентно закритих

кільцевих надспіральних і дволанцюгових відкритих кільцевих

молекул ДНК. Конфігурація дволанцюгової ковалентно закри

тої кільцевої структури, що при скручуванні перетворюється у

надспіраль, характеризується високою стійкістю і зберігається

в конформаційно зміненому стані навіть при впливі несприят

ливих факторів (наприклад, лужних розчинів). Плазміди в бак

теріальних клітинах найчастіше знаходяться у вигляді кова

лентно закритих кільцевих надспіральних структур і відкритих

кільцевих молекул ДНК. Відкриті кільцеві молекули утворю

ються внаслідок розриву фосфодиефірних зв’язків в одному з

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

130

ланцюгів. Вони не утворюють надспіральної структури, знахо

дяться в релаксованому (розслабленому) стані, менш стабільні

при впливі несприятливих факторів, а в лужних розчинах дво

ланцюгова структура швидко деградує через розрив водневих

зв’язків.

У бактеріальній клітині одночасно можуть знаходитися

плазміди одного чи різних типів. Кількість копій дрібних плаз

мід буває, як правило, більше десяти; великі плазміди в більшо

сті випадків представлені однією чи двома копіями з розрахун

ку на одну бактеріальну клітину. Визначено, що на долю

плазмід припадає близько 1–10% клітинної ДНК. Так, якщо ви

ходити з того, що в клітині Е.соlі міститься 10 дрібних плазмід,

молекулярна маса кожної з яких 5·10

, а молекулярна маса

хромосомної ДНК 2·10

, то в плазмідах виявляється зосередже

но 2 % клітинної ДНК. Обсяг інформації, зосереджений у дріб

них плазмідах, дозволяє їм кодувати молекули двох великих

білків; у великих плазмідах можливості, що кодують, достатні

для більш ніж 200 великих білків. Наявність деяких загальних

ознак з помірними фагами дає підставу припускати існування

однієї і тієї самої молекули ДНК у різних фазах — плазмідній і

фаговій. Відомо, наприклад, що фаг

λ найчастіше функціонує,

убудовуючи свою молекулу ДНК у хромосомну ДНК бакте

ріальної клітини; фагова ДНК може також відтворюватися ав

тономно, як розмножуються плазміди. Крім бактерій, дрібні

кільцеві молекули ДНК (діаметр 1,1–2 мкм) зустрічаються в

цитоплазмі клітин еукаріот (дріжджах, Neurospora, Еuglena,

трипаносомах, у клітинах тютюну, дрозофіли, шпорцевої жаби,

а також у культурах клітин мишей, мавп, людини). На сьогодні

вивчені фізикохімічні властивості цих ДНК, однак їх похо

дження і біологічна роль поки не визначені.

У 50і роки ХХ ст. зусиллями Д. Ледерберга була виявлена

екстрахромосомна генетична структура бактерій, що спочатку

була відома як фактор фертильності, кон’югації, генетичного

перенесення. Для позначення цієї структури був запропонова

ний символ F. Клітини, що є носіями цього фактора, стали нази

вати клітинами F

; у тих випадках, коли в клітині названий фак

тор був відсутній, її позначали F

–

. Крім того, стало відомо, що

при кон’югації бактерії двох штамів, клітини, що містять фактор

Розділ5.Основиенетичноїінженерії

131

F, завжди виступають як донор генетичного матеріалу, клітини

–

— як реципієнт. Передача генетичного матеріалу від клітини

донора до клітиниреципієнта відбувається за рахунок кон’юга

ції (аналог статевого процесу в бактерій), а структурою, що має

властивості статевого фактора, виявився фактор F. Останній у

зв’язку з його екстрахромосомною (цитоплазматичною) локалі

зацією, за пропозицією Ледерберга Д., стали називати плазмі

дою. У такий спосіб було встановлено, що плазміда F зумовлює

тільки одну властивість бактерій, що є її носіями, — виступати

як донор генетичного матеріалу. Виявлені іншими дослідника

ми позахромосомні фактори, подібні з Fплазмідами (плазміди

∆, T, FP, P), надають утримуючим їх клітинам здатність донорів

генетичного матеріалу, а також мобілізують перенесення у клі

тиниреципієнти інших некон’югованих плазмід.

Плазміди детермінують стійкість бактеріальних клітин до

одного чи одночасно до декількох ліків і останнім часом широ

ко розповсюджені; їхніми носіями є майже усі види патогенних

для людини і тварини бактерій.

Синтез коліцинів клітинами Е.соli знаходиться під контро

лем плазмід Соl. Розрізняють кілька видів коліцинів А, В, С, D,

Е та ін. Серед деяких з названих коліцинів, у свою чергу, виді

ляють такі варіанти як, наприклад, коліцин Е1, Е2, Е3. Тому в

назвах відповідних плазмід, крім символу Соl, зазначаються

назва синтезованого кишковою паличкою відповідного виду і

варіанта коліцину — СоlЕ1, СоlЕ2 і т.д. Синтез подібних за біо

логічним значенням з коліцинами речовин (піоцинів) детермі

нується плазмідами, що містяться в псевдомонадах; стафілоко

кові плазміди контролюють синтез стафілококцину, плазміди

картопляної палички — мегацину і т.д. Загальною властивістю

усіх бактеріоцинів є їх висока біологічна активність. Для галь

мування життєдіяльності бактеріальної клітини достатньо

декількох молекул бактеріоцину (висока ефективність поши

рюється лише на бактерії аналогічного чи близького виду).

Коліциногенні (бактеріоциногенні) плазміди і детерміновані

ними ефекти поширені серед бактерій, але не так часто, як

Rплазміди.

Деякі плазміди (Ent, Hly, K88, K99) локалізуються тільки в

клітинах ентеропатогенних штамів Е.соlі. Так, низькомолеку

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

132

лярний термостабільний і високомолекулярний термостабіль

ний ентеротоксини синтезуються під контролем плазмід Еnt.

Залежно від того, чи одна з двох плазмід знаходиться у клітині

чи їхній комплекс, клітини кишкової палички синтезують один

із двох названих ентеротоксинів, або обидва види ентеротокси

нів одночасно. Синтез

α і βгемолізинів (білкових речовин, що

викликають гемоліз еритроцитів) ентеропатогенними клітина

ми кишкової палички детермінується плазмідами Нlу

α і Н1уβ

відповідно. Вони, як і плазміди Еnt, можуть знаходитися у клі

тині як поодинці, так і обидві одночасно. У зв’язку з цим кліти

на синтезує один із двох названих ентеротоксинів, або обидва

види одночасно. Спільне перебування у клітині плазмід К88

і К99, що контролюють синтез поверхневих антигенів 88 і 99, з

плазмідами Еnt підвищує патогенність таких клітин бактерій. У

клітинах багатьох штамів Рsеudоmonas рutіdа локалізовані

плазміди, кожна з яких детермінує біосинтез ферменту для ути

лізації якогось одного класу вуглеводнів. Так, плазміди

SАL розщеплюють саліцилову кислоту, ХYL — ксилол і толуол,

NАN — нафталін, САМ — камфору, ОСТ — октан, гексан і де

кан. Усі названі плазміди вдається ідентифікувати за контро

льованими ними ознаками, які виявляються фенотипічно.

Плазміди, існування яких у клітинах бактерій фенотипічно не

виявляється (а для їхньої ідентифікації необхідне застосування

біохімічних методів), називаються критичними. Ці плазміди ще

мало вивчені.

Перш ніж плазміди стали використовувати як незамінні

об’єкти молекулярної біології і генетичної інженерії, були вив

чені їхня загальна і спеціальна функції. У всіх видів плазмід

виявлені такі загальні функції, як здатність реплікуватися (rер),

несумісності (inс), перенесення (tra — від англ. transfer — пере

несення).

Плазміди — це молекули ДНК, тому за рахунок реплікації

регулярно збільшується кількість плазмідних копій і вони рів

номірно розподіляються між нащадками бактеріальної клітини,

що ділиться. Найкраще вивчено механізм реплікації дрібної

плазміди СоlЕ1, що представлена у клітині, як правило, вели

ким числом копій (Зенгбуш П., 1982). У процесах ініціації й

елонгації беруть участь продукти хромосомних генів, а для реплі

Розділ5.Основиенетичноїінженерії

133

кації СоlE1 необхідні ДНКполімераза III і ДНКполімераза І.

Останній фермент у реплікації хромосомної ДНК кишкової па

лички участі не бере, а використовується там у репараційних

цілях. Висловлюється думка про те, що тільки початок репліка

ції плазміди СоlЕ1 детермінується її генним апаратом, інші

функції, що забезпечують реплікацію плазміди, реалізуються за

участю хромосомного апарату бактеріальної клітини. У деяких

плазмід, що у клітині знаходяться в невеликій кількості (1–2 чи

трохи більше копій на хромосому), існує власний, незалежний

від хромосоми апарат, що забезпечує реплікацію. До таких плаз

мід насамперед належать фактори F, R1, рSCIO1 та інші.

Про реальне існування процесу реплікації плазмід свідчать

непрямі дані, до яких насамперед варто віднести той факт, що

кількість плазмід з розрахунку на хромосому бактеріальної клі

тинихазяїна завжди є величиною постійною. З іншого боку, як

що припустити, що процес реплікації невластивий плазмідам,

то при будьякій первісній кількості плазмід у бактеріальній

клітині, що ділиться, завжди має настати момент, коли ця бак

теріальна клітина звільниться від плазмідних структур. Нас

правді такий феномен зникнення плазмід із плазмідвмісних

клітин поки що ніким не був установлений. Є інші приклади,

що підтверджують факт розмноження плазмід.

Молекулярний механізм розмноження плазмід дотепер ціл

ком не вивчений. Наявні гіпотези, що допускають існування по

зитивного і негативного контролю розмноження плазмід, не в

змозі пояснити існуючі факти. Так, наприклад, гіпотеза позитив

ного контролю базується на тому, що розмноження плазмід F і

′ знаходиться під контролем власної генетичної системи, пред

ставленої тільки двома генами, один з яких здійснює контроль

синтезу білкового продукту, що виступає як ініціатор процесу

реплікації, а другий ген є оператором реплікації (реплікатором).

Схема генетичного контролю розмноження плазмід F чи F

′ пе

редбачає, що розмноження настає в той момент, коли немає об

межень для функціонування ініціатора (білкової субстанції) і

реплікатора. Разом з тим установлено, що в процесі ініціації

синтезу ДНК плазміди СоlЕ1 реплікація не припиняється, нез

важаючи на присутність такого інгібітора білкового синтезу, як

хлорамфенікол.

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

134

Точку зору про наявність у плазмід власної системи реплі

кації поділяють багато фахівців, однак функціональна актив

ність цієї системи знаходиться залежно від рівня життєдіяльно

сті бактеріальної клітини. Так, перебування бактеріальної

культури в несприятливих для її розмноження умовах супро

воджується збільшенням кількості плазмід у бактеріальній клі

тині. Крім того, на залежність розмноження плазмід від метабо

лічної активності бактерії вказує факт можливої участі РНК як

запалу при реплікації плазмідної ДНК.

Пізнання механізму розмноження плазмід не є приватним

питанням. Його значення в тому, що на прикладі реплікації

плазмідної ДНК вивчаються фундаментальні механізми реплі

кації генетичного матеріалу взагалі, що має практичне засто

сування при розробці методів подолання лікарської стійкості

бактерій, а також обмеження поширення бактерій, що є носіями

Rплазмід.

Функція несумісності (inс) плазмід — це біологічне явище,

що виявляється при забарвленні, і означає, що дві однакові

плазміди не можуть стабільно існувати в одній клітині; потра

пивши при схрещуванні з клітинидонора в клітинуреципієнт

плазміда витісняє подібну плазміду («резидента»), або сама ви

тісняється нею. Молекулярний механізм несумісності поки що

нез’ясований.

Поряд з несумісністю при вивченні взаємодії бактерій було

встановлене близьке до цього явище, що одержало назву поверх

невого виключення. Схрещування клітиндонорів і клітинреци

пієнтів, що є носіями подібних плазмід F, R чи Соl, незмінно су

проводжується несприйняттям реципієнтною клітиною

плазмідного матеріалу з клітинидонора. Хоча є досить перекон

ливі дані, що вказують на існування плазмідного генного кон

тролю поверхневого виключення, молекулярний механізм цього

явища дотепер однозначно не встановлений. Що стосується не

сумісності плазмід, то ні гіпотеза конкуренції плазмід за мем

бранний сайт (ділянка) реплікації, ні гіпотеза негативного кон

тролю розмноження не можуть цілком пояснити моле

кулярний механізм цього явища. Однак немає також підстав за

перечувати взаємозв’язок механізму несумісності і механізму

розмноження, що контролює кількість плазмід в одній бакте

Розділ5.Основиенетичноїінженерії

135

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

136

ріальній клітині. Відкрите явище несумісності плазмід покладе

но в основу їхньої класифікації. Висловлене припущення про фі

логенетичне споріднення плазмід, що належать до однієї групи,

було підтверджено наступними дослідженнями. Установлено,

що плазміди, які належать до однієї групи несумісності, характе

ризуються спільністю молекулярної будови їхньої ДНК; прина

лежність плазмід до однієї групи корелює з лікарською стійкі

стю бактерій. Класифікація плазмід за принципом несумісності

дає можливість вивчити шляхи їхнього розповсюдження від од

них бактерій до інших, а також шляхи поширення бактерій, що

містять плазміди, у яких вони відіграють роль маркерів. Остан

ня обставина дозволяє проводити плазмідний моніторинг. Усе

це підвищує ефективність вивчення екології, епідеміології та

епізоотології плазмід і бактерій, що утримують плазміди.

Функція перенесення (trа) є властивістю плазмід. Однак це

властиве тільки великим плазмідам, з яких найбільш вивчена F

Е.соlі. Молекулярна маса цієї плазміди досягає 65 млн, а кіль

кість пар азотистих основ — 24 тис. Фактор перенесення (опе

рон перенесення, фактор F, плазміда F) містить 21 цистрон.

Процес перенесення, що складається з декількох етапів, почина

ється з того, що у певному місці плазміди, яке називається стар

товою точкою перенесення (оriТ), відбувається розрив одного з

ланцюгів ДНК. Потім цей ланцюг переноситься у клітинуак

цептор. На одноланцюгових структурах ДНК, що залишилися в

донорській клітині, а також на перенесених у клітинуакцептор,

реплікуються комплементарні ланцюги.

Фактор F, як і інші плазміди, може включатися в бактеріаль

ну хромосому за типом незаконної рекомбінації у визначених

місцях. Незаконна рекомбінація — це процес, в основі якого ле

жить обмін негомологічними ділянками ДНК. Перебування

фактора F в інтегрованому з хромосомою стані (стан Нfr), є од

нією з альтернативних форм існування плазміди, а хромосоми

Е.соlі, у які включений фактор F, набувають здатності до перене

сення в клітини придатного реципієнтного штаму, і цей процес

при інтеграції плазміди F із хромосомою Е.соlі здійснюється з

високою частотою. При впливі на бактеріальну клітину УФви

проміненням частота включення плазміди F у хромосому цієї

клітини підвищується.

З відомих спеціальних функцій, що кодуються окремими

плазмідами, варто назвати плідність (здатність плазмід перено

сити генетичний матеріал шляхом кон’югації), стійкість до

одного чи кількох антибіотиків (фактори R

плазміди R), важ

ких металів (Сd

, Нg

), ультрафіолетового випромінювання,

здатність до утворення бактеріоцинів (речовин, при дії яких на

клітини настає їх загибель) і антибіотиків (метиленоміцину, ак

тинородіну та ін.), токсинів і поверхневих антигенів (ентерото

ксинів гемолізину, антигену К88 та ін.), індукцію пухлин у

рослин (плазміда Ті з Аgrоbасtеrіum tumefaciens викликає утво

рення корончатого гала), метаболізм незвичайних джерел

вуглецю (багато штамів Рseudomonas putida містять плазміди,

що кодують ферменти для утилізації вуглеводнів), участь у спо

руляції стрептоміцетів.

Носіями такої спеціальної функції, як стійкість до антибіо

тиків і деяких інших груп лікувальних препаратів, є фактори R

чи плазміди R (від англ. resistance — стійкість). Механізм стій

кості обумовлюється тим, що плазмідні гени кодують синтез

спеціальних ферментів; останні інактивують антибіотики шля

хом їхнього розщеплення або шляхом модифікації ацетилюван

ням, аденіліруванням, фосфорилюванням. Крім того, деякі

антибіотики (тетрациклін) і сульфаніламіди не спричиняють

властивого їм антибактеріального ефекту через детерміновані

зміни в бактеріальній мембрані.

Гени r, що зумовлюють лікарську стійкість, можуть бути в

плазмідних факторах R об’єднані. Тоді формується ознака мно

жинної лікувальної стійкості. У результаті інтенсивної хіміоте

рапії проти бактеріальної дизентерії один зі штамів збудника

цього захворювання Shigella dysenteriae стійкий одночасно до

всіх чотирьох використаних у лікувальних цілях лікарських

препаратів — хлорамфеніколу, стрептоміцину, тетрацикліну і

сульфаніламідів. Явище множинної стійкості до ліків сьогодні

широко розповсюджене в патогенних і непатогенних бактерій

(Е.соlі, Salmonella). Японські дослідники установили, що 65 %

штамів Shigella і 50 % штамів усіх інших кишкових бактерій, от

риманих від хворих чи тих, що перехворіли на дизентерію, вия

вилися стійкими до застосованих в лікувальних цілях антибіо

тиків (стрептоміцину, хлорамфеніколу і тетрацикліну), а також

Розділ5.Основиенетичноїінженерії

137

до сульфаламідів. У плазмідах, поряд з декількома генами r, що

детермінують множинну лікарську стійкість, міститься також

фактор перенесення цієї стійкості RTF. Гени фактора RTF ма

ють багато схожого з генами загального фактора перенесення F

Е.соlі і забезпечують кон’югацію і реплікацію. Плазміди R часто

є носіями ділянки RTF. У такому випадку вони при спільному

культивуванні можуть передаватися іншим видам бактерій, що

свідчить про трансмісивне походження сутності ознаки мно

жинної лікарської стійкості. Найчастіше ділянка RTF, що забез

печує кон’югацію бактерій і реплікацію ДНК, а також детермі

нанти r знаходяться в одній молекулі ДНК. Натомісь відомо

чимало випадків (наприклад, у бактерій Salmonella і Proteus),

коли ці функціональні утворення знаходяться в різних молеку

лах. У природних умовах бактеріальні популяції, що є носіями

плазмід, у яких фактори RTF і детермінанти r зосереджені в од

ній молекулі ДНК плазміди, просторово роз’єднані від тих бак

теріальних штамів, у яких RTF і r знаходяться в різних плазмі

дах. Якщо плазміди є носіями тільки одного гена r і в них

відсутній набір генів, що забезпечують функцію RTF, вони ха

рактеризуються невеликим розміром, забезпечують стійкість

тільки до якоїсь однієї лікарської речовини і наявний ген лікар

ської стійкості не може бути переданий кон’югативним шляхом.

Так, плазміда RpSClOl завдовжки 8,2 kb (маленька плазміда)

має стійкість тільки до однієї лікарської речовини (антибіотика

тетрацикліну), але ця ознака стійкості не може бути переданою

за допомогою кон’югації (відсутність ділянки RTF). У природ

них умовах ген r, що детермінує ознаку стійкості до однієї лі

карської речовини, скажімо, антибіотика, має здатність до взає

модії з плазмідами, що кодують стійкість до іншого антибіотика

чи сульфаніламідного препарату. Об’єднання гена (чи генів)

стійкості r до лікарських речовин (зазвичай до хімічних сполук)

із плазмідами, що є носіями генів ділянки RTF, в остаточному

підсумку приводить до виникнення плазміди, у якій комбінація

RTF–r сприяє її швидкому поширенню в бактеріальній популя

ції. Хоча існують відповідні механізми контролю (зокрема,

репресія функціональної активності RTF–r) за рахунок мутант

них форм, де цей контроль ослаблений або відсутній, перенесен

ЧастинаI.Заальнабіотехнолоія

138

ня генів r у природних популяціях досить широко розповсюдже

ний. Наприклад, у США (штат Атланта) був зареєстрований

стійкий до дії антибіотика пеніциліну штам Neisseria gonorrhoe

ae, що є збудником гонореї. Для лікування захворювання, викли

каного пеніциліностійким штамом, дозу антибіотика довелося

збільшити в 24 рази (з 200 тис. до 4,8 млн одиниць). Різке зни

ження активності пеніциліну зумовлюється появою гена r, що

детермінував синтез пеніцилінази. Фермент розщеплював пені

цилін і тим самим інактивував його.

Факт мікробної стійкості до дії пеніциліну був встановлений

у Haemophilus influenzae — збудника менінгіту. Відомі й інші

приклади міграції генів лікарської резистентності. Так, було вста

новлено, що ген, який обумовлює стійкість бактерій до тетраци

кліну, може переходити з плазміди R у фаг, що розмножується в

клітинах Salmonella, а потім у хромосому Salmonella, із хромосо

ми — у фаг

λ і далі в trpоперон Е. соlі, а потім знову у фаг λ. Про

стежений також шлях міграції гена стійкості до хлорамфеніколу.

Встановлене японськими дослідниками під керівництвом

Митсухаши С. явище хромосомної міграції генів стійкості до

деяких хімічних речовин було підтверджено в лабораторіях

інших країн світу. Здатні до міграції генетичні елементи прока

ріот, що кодують стійкість до певних хімічних сполук, були наз

вані транспозонами, а для їхнього позначення стали використо

вувати символ Тn. З відомих нині транспозонів найбільш

вивчені виділені з різних плазмід Tn1, Тn2, Тn3, що зумовлю

ють стійкість до ампіциліну; Тn4 зумовлює стійкість відразу

до декількох хімічних сполук — стрептоміцину, ампіциліну і

сульфаніламідів, Тn5 і Тn6 — до антибіотика канаміцину, Тn7 —

до триметопріму і стрептоміцину, Тn9 — до хлорамфеніколу,

Тn10 — тетрацикліну. До складу транспозонів входить близько

2600–5200 пар нуклеотидів.

При з’ясуванні причин високої здатності транспозонів до

міграції на їхніх кінцях були виявлені повторювані нуклеотидні

послідовності. Крім того, ще раніше було відомо, що деякі плаз

міди R містять неодноразово повторювані нуклеотидні послі

довності (інвертовані повтори), що містять 800–1400 пар ну

клеотидів. Характерною рисою повторюваних послідовностей є

Розділ5.Основиенетичноїінженерії

139