Дромашко С.Е. Генетика и вирусология

Подождите немного. Документ загружается.

Филадельфийская компания Acuity Pharmaceuticals проводит

клинические испытания экспериментального метода лечения макулярной

дегенерации сетчатки с помощью РНК-интерференции. Больному

непосредственно вxглаз вводят короткие фрагменты рибонуклеиновой

кислоты, которые заглушают ген, обусловливающий аномальное разрастание

капилляров.

Американская фармацевтическая фирма Sirna начала клинические

испытания первого лекарства, механизм действия которого основан на РНК-

интерференции (пока оно называется «Sirna-027»). «Sirna-027» – это

специфическая микро-РНК, которая запускает механизм разрушения

информационной РНК, обеспечивающей синтез рецептора фактора роста

эндотелия сосудов. Для терапевтического применения микро-РНК химически

модифицирована особым образом, поскольку «обычные» РНК, введенные в

организм, плохо проникают в клетки и быстро разрушаются.

Рисунок 7 – Одна из искусственных молекулярных конструкций для

доставки генетического материала в клетку, разработанная в

Калифорнийском университете в Санта-Барбаре. Водоотталкивающие

шарообразные липидные молекулы связываются с окаймляющими их

молекулами ДНК или РНК в единый комплекс

Сегодня, кроме макулярной дегенерации сетчатки, фирма «Sirna»

выполняет программы (пока на доклинических стадиях) по раку, гепатитам В

и С, диабету, астме, болезни Хантингтона (прогрессирующая дегенерация

нервных клеток, приводящая к инвалидности) и облысению (это пока тоже

неизлечимое явление). Главная проблема в области клинического применения

микро-РНК – не конструирование самих молекул, специфических для

определенных генов-мишеней, а их доставка в клетку (рисунок 7). В отличие

от многих обычных лекарств молекулы РНК сравнительно большие и

обладают физико-химическими свойствами, которые мешают им проходить

через внешнюю мембрану клетки.

Решением этой проблемы занимается целая отрасль современной науки

(drug delivery). Применяются две стратегии: во-первых, использование

«готовых» систем доставки РНК или ДНК в клетку, получаемых из

некоторых вирусов, а во-вторых, создание искусственных конструкций из

молекул (например, липосом).

Теперь – о лечении СПИДа. Если удастся тем или иным способом

доставить siRNA, обладающую способностью связываться с каким-либо

участком РНК-генома ВИЧ, можно попытаться не допустить его встраивания

в ДНК клетки хозяина. Можно также воздействовать на различные этапы

размножения ВИЧ в уже зараженной клетке. Последний подход не обеспечит

излечения, однако существенно уменьшает скорость размножения вируса и

дает иммунной системе больного шанс "отдохнуть" от вирусной атаки и

самой попытаться расправиться с остатками заболевания.

Рисунок 8 – Этапы развития ВИЧ

На рисунке 8 крестиками отмечены те два этапа размножения ВИЧ в

клетке, которые, как надеются, можно заблокировать с помощью siRNA

(этапы 4–5 – встраивания вируса в хромосому – и этапы 5–6 – сборка вируса и

выход из клетки).

Сегодня, правда, эта возможность относится, скорее, к области теории.

На практике терапия siRNA встречается с затруднениями. Например, в случае

антивирусной терапии именно высокая специфичность siRNA может сыграть

злую шутку: вирусы обладают способностью быстро мутировать, т.е.

изменять состав своих нуклеотидов. Особенно преуспел в этом ВИЧ, частота

изменений которого такова, что у человека, заразившегося одним подтипом

вируса, через несколько лет может быть выделен абсолютно непохожий на

него подтип. В этом случае измененный штамм ВИЧ автоматически станет

нечувствительным к siRNA, подобранной в начале терапии.

Учитывая эти затруднения, предлагаются альтернативные варианты

противовирусной siRNA-терапии. В случае ВИЧ, например, показано, что

блокирование одной из молекул-рецепторов на клеточной поверхности,

необходимых для прикрепления вируса к клетке (CCR5, этап 6b на рисунке

8), также может предотвращать заражение ВИЧ. Преимуществом данного

подхода является то, что ген CCR5 и соответственно его мРНК, отличаются

(по сравнению с ВИЧ) гораздо большей стабильностью своего состава, а

значит, подобрать для нее эффективную siRNA гораздо легче.

РНК-интерференция широко используется также в научных целях в

функциональной геномике для анализа функций различных генов. После

описания нуклеотидных последовательностей геномов многих животных и

человека перед наукой встала очередная глобальная задача: выяснить роль

каждого гена. Одним из основных инструментов, применяемых генетиками

для решения этого вопроса, является "выключение" гена. Действительно,

чтобы хотя бы в первом приближении оценить функцию гена, нужно

посмотреть, как поведет себя клетка без него, какие биохимические процессы

при этом нарушатся.

Если раньше на поиски удачного способа блокировки гена и приведение

его в действие требовалось от нескольких месяцев до года, то с помощью

метода siRNA, или генного нокдауна, практически с любым геном любого

организма, последовательность нуклеотидов которого известна, эту

процедуру можно проделать в 1–2 недели, значительно повысив

специфичность блокирования. При этом инъекция двухцепочечных

фрагментов РНК, комплементарных участку информационной РНК,

возможна на различных этапах клеточного цикла. Например, таким способом

было систематически инактивировано 5690 генов C.elegans для определения

генов, регулирующих продолжительность жизни.

В Институте цитологии и генетики СО РАН в Новосибирске установлена

возможность сиквенс-специфического подавления экспрессии гена-мишени

короткой синтетической интерферирующей РНК в головном мозге

млекопитающих in vivo. Результаты исследований открывают новые

возможности изучения функции генов в центральной нервной системе и

применения РНК-интерференции для воздействия на патологические

процессы в головном мозге.

Согласно этому, ранее неизвестному механизму стресс, терапия или

даже материнская забота низкого качества, изменяющие экспрессию

нейрогена в раннем онтогенезе, способны предрасполагать к развитию

психопатологии.

Но не все получается так гладко в связи с использованием методов

siRNA. Основная проблема состоит в том, что не все гены подвержены РНК-

интерференции, а в норме в организме животных дцРНК вообще не

образуется, кроме того, до сих пор неизвестны ферменты, которые могли бы с

ней взаимодействовать.

Вопросы для проверки усвоения материала

1 Какие молекулы являются индукторами РНК-интерференции?

2 Что такое «генная цензура»?

3 Какие молекулы относятся к классу малых РНК?

4 Как работает siRNA в клетках растений и животных?

5 Какова роль ферментов argonaute и DICER в РНК-интерференции?

6 Почему в РНК-интерференции участвуют именно двухцпочечные

РНК?

7 Что такое интерферон? Чем его работа отличается от действия siRNA?

8 Какова функциональная роль РНК-интерференции?

9 Как используется явления РНК-интерференции в функциональной

геномике?

10 Каковы перспективы применения малых РНК в экспериментальной

генотерапии?

4 ПРОБЛЕМЫ НОВЫХ И ВОЗНИКАЮЩИХ ВИРУСНЫХ

ИНФЕКЦИЙ

4.1 Новые вирусы: ВИЧ, гепатита С, гепатита GB, герпесвирусы 6, 7,

8, атипичной пневмонии, их характеристика и вызываемы ими

заболевания

Вирус иммунодефицита человека относится к ретровирусам, и для

него характерны все особенности жизненного цикла вирусов данного

семейства. Геном ВИЧ представлен одноцепочечной молекулой РНК. В

инфицированной клетке с помощью вирусного фермента – обратной

Рисунок 9 – ВИЧ рядом

с клеткой CD4

транскриптазы (ревертазы) – на матрице

вирусной РНК синтезируется двухцепочечная

молекула ДНК, которая затем встраивается в

какой-либо участок одной из хромосом

клетки-хозяина. Интегрированная ДНК-копия

ретровирусного генома называется

провирусом. В таком состоянии ретровирус

может долгое время сосуществовать с

инфицированным организмом, никак себя не

проявляя. Однако, получив определенные

молекулярные сигналы, с провирусной ДНК

инициируется транскрипция вирусной РНК, а

с нее – синтез вирусных белков. Затем следуют сборка многочисленных

вирусных частиц и выход их из клетки, приводящий в итоге к гибели

зараженных клеток. Отличительное свойство ВИЧ прояется в том, что он

адсорбируется на поверхности только тех клеток, которые содержат

мембранный белок, называемый антигеном CD4. Такой поверхностный

антиген в основном содержат T4-лимфоциты, являющиеся

T-хелперами/индукторами (хелпер от англ. helper – помощник) и играющие

важнейшую роль в координации работы всей иммунной системы человека.

Уничтожение вирусом лимфоцитов этого типа и обусловливает

иммуносупрессорное действие ВИЧ.

До недавнего времени считалось, что вирусы ОРЗ, гепатита C и ВИЧ

относятся к разным группам. Пол Элквист и его коллеги из Университета

Висконсин–Мэдисон детально исследовали эти патогены и пришли к выводу,

что все они произошли от одного предка.

О родстве патогенов свидетельствует cходство в строении белковых

оболочек вирусных частиц. К тому же, у всех этих вирусов аналогичный

механизм репликации – т.е. копирования новых частиц. Выявление общих

черт наиболее распространенных в мире вирусов может привести к созданию

высокоэффективных лекарственных препаратов нового поколения.

Тестирование ВИЧ-инфекции. Большинство вирусных инфекций

(например, грипп, ветряная оспа) развиваются быстро, и врач их

идентифицирует прежде всего по клиническим проявлениям у больного. В

случае ВИЧ-инфекции такой подход неприменим, так как ее внешние

проявления могут наблюдаться лишь спустя месяцы и годы после заражения.

Поэтому всеобщее распространение получил метод обнаружения в крови

человека антител к вирионным белкам ВИЧ. Первые варианты такого метода

– метода иммуноферментного анализа (ИФА) были разработаны уже в 1984

г.

Метод ИФА используют для массовых обследований. В случае

положительного результата обязательно выполняют дополнительные анализы

методически независимыми способами, обеспечивающие достоверность

результатов. В частности, для выявления провирусной ДНК в клетках крови

используется более чувствительный метод полимеразной цепной реакции

(ПЦР).

Стадии развития ВИЧ-инфекции. Разработка методов тестирования и

многолетние наблюдения за ВИЧ-инфицированными пациентами позволили

подробно изучить стадии развития данной инфекции. Согласно принятой

классификации, заболевание в своем развитии проходит шесть стадий.

• Первая стадия протекает, как правило, бессимптомно и длится 6–12 мес.

после заражения. В это время происходит размножение ВИЧ, которое

затем затухает. Содержание T4-лимфоцитов в крови при этом обычно

близко к норме (около 800 клеток в 1 мл).

• Вторая, самая протяженная по времени стадия (обычно 3–5 лет)

характеризуется развитием хронической лимфо-аденопатии (увеличением

лимфатических узлов) и постепенным снижением содержания T4-

лимфоцитов в крови. Самочувствие больного на этой стадии все еще

хорошее.

• Снижение титра (концентрации) T4-лимфоцитов ниже 400 клеток/мл

знаменует наступление третьей стадии, которая характеризуется

скрытым (субклиническим) нарушением иммунной системы.

• Четвертая стадия ВИЧ-инфекции по внешним проявлениям не

отличается от предыдущей, но для нее характерны более глубокие

изменения в иммунной системе, которые выявляются лишь

дополнительными анализами.

• На пятой стадии иммунная система больного угнетается настолько, что

появляется клиническое проявление в виде грибкового поражения

слизистых полости рта, называемого молочницей. К началу этой стадии

концентрация T4-лимфоцитов в крови обычно становится менее 200

клеток/мл. Кроме молочницы на этой стадии часто развиваются стойкие

вирусные и/или грибковые заболевания кожи и слизистых (например,

хроническая инфекция вирусом простого герпеса).

• Через 1-2 года после начала пятой стадии у больного развиваются так

называемые хронические оппортунистические инфекции, вызываемые

условно-патогенными микроорганизмами, что свидетельствует о глубоких

нарушениях иммунной системы. Часто такой инфекцией является тяжелая

пневмония, вызываемая простейшими Pneumocystis carinii (пневмоцистоз).

Такие осложнения свидетельствуют о переходе ВИЧ-инфекции в

последнюю шестую стадию, которая и называется СПИД. Содержание T4-

лимфоцитов при этом обычно ниже 100 клеток/мл (у здорового человека –

не менее 800 клеток/мл). Данная стадия длится, как правило, не более двух

лет и завершается смертью больного.

В Африке катастрофа уже охватила сегодня до 30% населения некоторых

стран. Официальная мировая статистика свидетельствует, что к концу 2002 г.

от СПИДа уже умерли около 25 миллионов человек, и около 42 миллионов

инфицированы. Россия, Украина и Беларусь при этом входят в число лидеров

по темпам нарастания заболеваемости. В России, начиная с 1996 г., даже

официальные данные регистрируют ежегодное увеличение количества

больных в 2–3 раза. По разным подсчетам, в России на настоящий момент

могут быть инфицированы от 220 тысяч до 1,5 миллионов человек. В

настоящее время самыми неблагополучными по распространению ВИЧ-

инфекции являются Калининградская, Ростовская, Нижегородская области,

Краснодарский край и Москва. Устрашает прогноз Национального

разведывательного совета США (US National Intelligence Council),

обнародованный в октябре 2002 г. Если верить ему, к 2010 г. каждый десятый

работоспособный россиянин может быть инфицирован ВИЧ. x

Гепатит С. Слово "гепатит" происходит от греческого слова hepar,

hepatos, которое в переводе означает "печень", а собственно термин "гепатит"

обозначает название совокупности симптомов болезни – воспаления печени.

Симптомы этой болезни известны с давних времен, но причины ее стали

проясняться только в 1963 г., когда впервые была доказана инфекционная

природа одного из видов гепатита – гепатита В. Опасность этого заболевания

для человека подтверждает тот факт, что почти половину пациентов

инфекционных клиник в нашей стране в настоящее время составляют

больные гепатитами, а вторым по важности фактором канцерогенеза (т.е.

способствующим возникновению рака фактором) после табакокурения

является перенесение инфекции вирусом гепатита В.

Все вирусные гепатиты по способу их передачи от человека к человеку

можно разделить на две группы:

• передающиеся фекально-оральным путем (т.е. через загрязненные уже

зараженным человеком воду, продукты питания, реже – предметы личного

обихода) вирусы гепатитов А, Е и F. Поскольку эти вирусы стойки при

температурах около 30°C, то они широко распространены в жарких

странах;

• передающиеся парентеральным (в том числе половым) или инъекционным

путем, т.е. при пользовании без необходимой тщательной стерилизации

многоразовыми шприцами и мединструментами, при многократных

инъекциях крови и препаратов, полученных из донорской крови, половым

путем и т.д. Сюда относятся гепатиты B, C и G.

Со времени открытия вирусной природы заболевания и обнаружения

вирусов гепатитов А и В выяснилось, что лишь немногим более половины

случаев этого заболевания обусловлены инфицированием именно этими

типами возбудителей и, по всей вероятности, существуют и другие вирусы,

вызывающие гепатиты у людей. Со временем даже возник термин – гепатит

"ни-А, ни-В". Лишь в конце 1980-х гг. был обнаружен новый вирус,

вызывающий заболевание печени, его назвали вирусом гепатита С (ВГС). В

настоящее время установлено, что до 40% случаев посттрансфузионных

гепатитов (т.е. гепатитов, возникающих после применения для лечения

человека препаратов из донорской крови) вызывается этим вирусом.

По имеющимся данным, в мире около 3% населения являются

хроническими носителями ВГС. Передается он от человека к человеку так же,

как и гепатит В. В России при обследовании ежегодно выявляется 10–20

тысяч новых носителей этого вируса, однако ввиду того, что исследования

начаты лишь в 1995 г., эта цифра представляется заниженной.

Предполагаемое число носителей (по аналогии с другими странами) может

достигать 2–3 миллионов.

В настоящее время ВГС относят к семейству флавивирусов. Долгое

время его не могли обнаружить в крови в виде вирусной частицы, и лишь в

последние годы это удалось сделать. Размер его вириона составляет 38–50 нм.

Устройство генетического материала ВГС (рисунок 10) подобно геномам

пести- и флавивирусов, типичными представителями которых являются

вирусы желтой лихорадки и клещевого энцефалита.

Рисунок 10 – Строение геномной РНК виуса гепатита С. C –

капсидный белок, Е1 и Е2 – поверхностные белки, NS5 – РНК-

полимераза

Он состоит из одноцепочечной РНК, длиной около 9400 нуклеотидов. На

5'- и 3'- концах вирусной РНК находятся нетранслируемые (некодирующие)

области. Между ними заключена единственная открытая протяженная рамка

трансляции (рамка считывания генетического кода в аминокислотную

последовательность), с которой считывается вирусный полипептид (3010 или

3011 аминокислот, начиная с первого остатка аминокислоты метионина).

Последовательность генов в геноме ВГС подобна таковой у пести- и

флавивирусов. Вирусная рамка считывания может быть разделена на

структурную и неструктурную части.

Структурная часть состоит из генов белка вирусного нуклеокапсида C и

гликопротеинов оболочки E1 и E2. Ген белка C среди различных изолятов

ВГС весьма консервативен. Гены гликопротеинов E1 и E2 значительно менее

консервативны и имеют очень изменчивые от изолята к изоляту районы. У

представителей рода флавивирус, по названию которого получило название

семейство, белок, соответствующий гликопротеину E2 оболочки вириона

ВГС, не входит в состав вирусной частицы. Он является первым (по порядку

расположения генов в вирусной РНК) неструктурным белком флавивирусов и

обозначается NS1. Поэтому гликопротеин E2 вируса гепатита C обозначают

также E2/NS1.

Неструктурная часть генома ВГС кодирует белки NSp2-Nsp5,

большинство которых являются либо вирусспецифическими протеазами,

либо ферментами, ответственными за размножение вируса.

Гепатит GB. В середине 90-х гг. обнаружены еще несколько вирусов,

поражающих печень. В частности весной 1995 г. выявлен вирус гепатита,

передающийся парентеральным путем, точнее сразу три его разновидности,

объединенные именем гепатит GB: гепатиты GB-A, GB-B и GB-C. Все

разновидности относятся, как и вирус гепатита С, к семейству флавивирусов,

передаются от человека к человеку так же, как и гепатит С. Эти вирусы, по

всей вероятности, являются причиной до 5% всех перентеральных гепатитов

у людей. Обнаружены они, как и вирус гепатита С, методами молекулярной

биологии.

Герпесвирусы 6, 7, 8. Герпетическая инфекция (син.: простой герпес) –

собирательное название для инфекций, вызываемых вирусом простого

герпеса первого типа (ВПГ-1) и вирусом простого герпеса второго типа (ВПГ-

2). Термин «герпес» (от греческого herpes – ползучий) был использован

Геродотом в 100 г. до н.э. для описания волдырей, сопровождающихся

лихорадкой.

Вирусы, относящиеся к семейству герпесвирусов, очень широко

распространены в природе. Они могут вызывать заболевания у различных

видов диких и домашних животных (кошек, собак, лошадей, коров, кур, рыб

и др.). В настоящее время известно более 100 герпесвирусов, 8 из них

выделены от человека: вирусы простого герпеса первого и второго типов

(HSV-1, HSV-2), ветряной оспы – опоясывающий герпес, цитомегаловирус

(CMV), вирус Эпштейна–Барр, вирусы герпеса человека шестого, седьмого и

восьмого типов (HHV-6, HHV-7, HHV-8).

К семейству Herpesviridae относятся три подсемейства: аlpha-

Herpesviridae, beta-Herpesviridae, gamma-Herpesviridae.

Наиболее важным биологическим свойством герпесвирусов в патогенезе

заболеваний является их способность к латентному существованию.

Герпесвирусы способны пожизненно персистировать в организме человека и

вызывать заболевания с многообразными клиническими проявлениями:

• острые и хронические рецидивирующие инфекции с поражением кожных

покровов и слизистых оболочек, внутренних органов, центральной нервной

системы;

• трансплацентарные инфекции с поражением плода;

• лимфопролиферативные заболевания.

Одной из самых распространенных вирусных инфекций человека

является простой герпес (ВПГ), представляющий собой серьезную медико-

социальную проблему. Около 90% людей на земном шаре инфицированы

ВПГ и около 20% имеют какие-либо клинические проявления инфекции. Все

герпесвирусы имеют выраженное иммуносупрессивное действие, подавляют

клеточные и гуморальные реакции иммунитета. Наименее изучены

клинические проявления инфекций, вызванных герпесвирусами шестого,

седьмого и восьмого типов, у детей.

HHV-6 – шестой член семейства герпесвирусов человека является

причиной розеолы, имеет многообразные проявления у детей и взрослых.

Хотя этот новый вирус был найден изначально в B-лимфоцитах

иммуноскомпрометированных взрослых больных, впоследствии выяснилось,

что он имеет первоначальное сродство с T-лимфоцитами, и его оригинальное

название – человеческий В-лимфотропный вирус (HBLV) – было изменено на

HHV-6.

HHV-6 входит в состав рода Roseolovirus, подсемейства beta-Herpesvirus.

Подобно другим вирусам герпеса HHV-6 обладает характерным электронно-

плотным ядром и икосаэдральным капсидом, окруженным оболочкой и

внешней мембраной, местом расположения важных гликопротеинов и

протеинов мембраны. Главный компонент клеточного рецептора для HHV-6 –

CD46, который присутствует на поверхности всех ядерных клеток и

позволяет HHV-6 инфицировать широкий ряд клеток. Главная цель HHV-6 –

это зрелая клетка CD4+, но вирус может инфицировать естественных

киллеров (NK), гамма-дельта T-лимфоциты, моноциты, древоподобные