Дромашко С.Е. Генетика и вирусология

Подождите немного. Документ загружается.

заболевание, лечить его будут с учетом индивидуальных особенностей

организма конкретного человека. Сегодня для лечения используются

массовые медицинские препараты, и на разных людей они действуют по-

разному: из 100 человек у 60 могут произойти заметные улучшения в

самочувствии, у 20 они будут незначительными, а еще 20 никак не

почувствуют воздействия препарата. Благодаря молекулярной медицине в

будущем появятся новые лекарства, гораздо более избирательные и

эффективные, чем ныне существующие, поскольку они будут

целенаправленно воздействовать на генные и белковые мишени.

2.6 Понятие о генетическом паспорте человека

Хотя определить все гены предрасположенности для каждого человека

пока невозможно, сегодня уже технически доступен индивидуальный анализ

по нескольким десяткам генов. Иными словами, желающие знать свои

генетические характеристики могут получить генетический паспорт. В нем

должна быть информация о наличии мутаций в генах наследственных

болезней и в генах предрасположенности к мультифакторным заболеваниям.

В некоторых западных странах генетическое тестирование проводят по

медицинским показаниям или просто в качестве платной услуги. Сведения,

записанные в генетическом паспорте, – такая же врачебная тайна, как и

результаты любых других медицинских обследований.

Зачем нужен такой паспорт и какие гены необходимо тестировать?

Генетический паспорт обычно делается либо с целью ДНК-

идентификации, либо для того, чтобы определить, какие опасные заболевания

подстерегают вас в жизни. Это как бы штрих-код, описывающий человека, а

точнее наличие тех или иных черт в его ДНК. В США, например, введено

генетическое тестирование военнослужащих не для медицинских целей. Его

результаты, хранящиеся в специальной базе данных, позволяют

идентифицировать человека гораздо точнее, чем надетый на руку жетон.

Очень важен генетический паспорт для криминалистики. В той же самой

Америке решили пересмотреть дела, связанные с изнасилованием. Сравнили

генетические паспорта осужденных и детей, которые родились у

потерпевшей. И оказалось, что 30% осужденных по этой статье не являются

отцами данных детей.

Если генетический паспорт необходим для здорового молодого человека,

желающего знать, какие болезни могут ожидать его в будущем и как

предотвратить их развитие, прежде всего нужно составить его родословную и

посмотреть, чем болели его родственники.

Носительство мутаций, связанных с моногенными болезнями

(фенилкетонурией, муковисцидозом), можно определять, если в семье

имеются подобные больные или же заболевание встречается с высокой

частотой в той этногеографической группе или того географического

региона, где живет обследуемый. Если среди родственников обследуемого

есть больше одного человека с одинаковой мультифакторной патологией,

необходимо анализировать гены предрасположенности к ее развитию.

При наличии факторов риска, связанных с профессией или особыми

условиями среды, нужно тестировать гены, имеющие отношение к болезням,

провоцируемым именно этими факторами.

Работы по генетической паспортизации уже начались. Они получили

финансовую поддержку в Ирландии, Финляндии, в некоторых штатах США.

Большие средства на генетическое тестирование детей с семилетнего возраста

выделены правительством Эстонии. Такие работы сопровождаются

публикациями в средствах массовой информации, обсуждениями этических и

социальных проблем и правовых аспектов. Не случайно в материалах

Всемирной организации здравоохранения за 1998 г., посвященных этическим

аспектам медицинской генетики, подчеркивается, что

пресимптоматическое тестирование можно проводить только по

желанию, только в случае возможной реальной пользы для пациента или его

родственников, при условии максимально объективного информирования

пациента о результатах тестирования.

Большинство людей (около 70%) уже теперь хотели бы получить

генетический паспорт, 20% не хотят этого, 14% затруднились ответить.

Большинство хотели бы получить медико-генетическую информацию о себе

(60%) и своем супруге (50%). 92% респондентов считают, что такую

информацию должны иметь родители о несовершеннолетних детях; 87% –

взрослые дети о родителях; 50% считают, что о генетических рисках здоровья

должен знать супруг; 73% доверились бы врачам медицинских учреждений

при соблюдении врачебной тайны. Более 80% опрошенных –против

предоставления этой информации руководству предприятий.

Вопросы для проверки усвоения материала

1 Что такое наследственные заболевания?

2 Как различаются моногенные и мультифакторные болезни?

3 Что такое хромосомные перестройки и генные мутации?

4 Каковы признаки основных моногенных болезней?

5 Какова роль систем трансформации-детоксикации ксенобиотиков в

формировании предрасположенности к мультифакторным болезням?

6 Что такое митохондриальные заболевания человека?

7 Какова классификация патогенных мутаций мтДНК?

8 На каких принципах основана молекулярная диагностика

наследственных и ненаследственных заболеваний человека?

9 Каковы особенности прямой и непрямой ДНК-диагностики

моногенных наследственных болезней?

10 Что такое генная терапия наследственных заболеваний?

11 Почему нельзя вводить гены в половые клетки?

12 Каковы особенности генотерапии с использованием соматических

клеток?

13 Какие методы переноса ДНК используются для доставки генов в

культивируемые клетки и ткани?

14 В чем разница между корректирующей и заместительной терапией?

15 Для лечения каких наследственных заболеваний уже используется

генотерапия?

16 Что такое молекулярная геномика?

17 Для чего нужен человеку генетический паспорт?

18 С какими биоэтическими проблемами связано внедрение

генетических паспортов?

19 В каких научно-исследовательских учреждениях Беларуси ведутся

исслдеования по генетике человека и медицинской генетике?

3 РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ: ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И

ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

3.1 Малые РНК как индукторы РНК-интерференции

Нобелевская премия вxобласти медицины иxфизиологии заx2006xг.

присуждена американским генетикам: 47-летнему профессору патологии и

генетики Медицинской школы Стэнфордского университета Эндрю Файеру

(Andrew Z. Fire) и 45-летнему профессору молекулярной медицины

Медицинской школы Массачусетского университета вxВустере Крэйгу

Меллоу (Craig C. Mello). Исследователи открыли иxописали механизм

универсального явления – «генной цензуры», или РНК-интерференции, при

которой происходит избирательное подавление экспрессии генов,

унаследованных организмом. Это один из редких случаев, когда от начала

работ, до их увенчания Нобелевской премией прошло чуть больше десяти

лет.

Первые загадочные результаты были получены еще в 1980-х – начале

1990-х гг. Сначала в опытах на кишечной палочке было установлено, что

искусственное введение в клетку синтетических фрагментов одноцепочечных

молекул рибонуклеиновой кислоты может приводить к отключению генов.

Затем на цветах (петуния) и червях (нематода Caenorhabditis elegans)

введение в клетки дополнительных копий генов вместо усиления экспрессии

наблюдался противоположный эффект: полное "замолкание".

В 1997xг. Э.Файер и К.Меллоу в экспериментах с нематодой

Caenorhabditis elegans обнаружили, что РНК очень эффективно отключает

гены, если ее вводить короткими фрагментами, причем не одноцепочечными,

а двухцепочечными! Это наблюдение было сделано почти случайноx–

исследователи вовсе не предполагали, что такие фрагменты будут работать

лучше одноцепочечных, они вводили их просто для контроля. Поначалу это

явление казалось загадочным, т.к. двухцепочечнаяxРНК сама по себе не

может связаться с матричной, ей сначала надо расплестись на две нити.

Первооткрыватели тоже не могли его объяснить, это удалось сделать лишь

позже. Впервые об открытии было объявлено в феврале 1998 г., когда

Э.Файер и К.Меллоу опубликовали в журнале «Nature» статью о новом

явлении. Эффект "гашения" экспрессии определенных генов малыми РНК

был назван К.Меллоу РНК-интерференцией, а молекулы, вызывающие его,

назвали siRNA (small interfering ribonucleic acids – малые интерферирующие

рибонуклеиновые кислоты).

3.2 Структурно-функциональная организация и биогенез микро-

РНК, коротких интерферирующих РНК и других малых РНК

В класс малых РНК включают молекулы, содержащие от 20 до 300

нуклеотидов. За эффект РНК-интерференции отвечают самые короткие из

них – siRNA, состоящие всего из 21–28 (у млекопитающих из 21–23)

нуклеотидов (таблица 3). Особенность этих молекул проявляется в том, что

они в отличие от большинства других клеточных РНК, состоящих всего из

одной цепи нуклеотидов, являются двунитчатыми. Нуклеотиды с

противоположных нитей (цепей) siRNA спариваются по тем же законам

комплементарности, которые формируют двунитчатые цепи ДНК в

хромосомах. Кроме того, по краям каждой из цепей siRNA всегда остаются

два неспаренных нуклеотида.

Происхождение двухцепочечных РНК в клетке может быть различным:

транскрипция с конаправленных промоторов, активность клеточной или

вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, самокомплементарные

транскрипты, способные к внутримолекулярному спариванию и образованию

шпилечных структур, а также искусственно введенные в клетку молекулы.

Механизм РНК-интерференции очень древний. Скорее всего,

биологическая эволюция создала его более миллиарда лет назад, когда нашу

планету населяли только микроорганизмы. С его помощью они получили

возможность защищаться от нападений вирусов. Позже эту способность

переняли у них грибки и растения, а потом и животные. Многоклеточные

организмы также научились прицельно отключать с помощью РНК-

интерференции собственные гены, прерывая процесс синтеза кодируемых

ими белков.

Таблица 3 – Основные типы малых РНК и их свойства

Класс Подкласс

Длина (в

нуклеотидах

)

Биогенез Механизм действия Биологическая функция

Микро РНК

(miRNA)

Нет ~22(19–25) Двухстадийное разре-

зание предшествен-

ников шпилечных

структур ферментами

Drosha и Dicer

Репрессия транс-

ляции, разрезание

мРНК

Различные (часто дейст-

вуют в процессе

развития и клеточной

дифференцировки)

Короткая ин-

терферирую-

щая РНК

(siRNAs)

Эндогенная

взаимодей-

ствующая

siRNA

21–22 (у не-

матоды)

21 (у расте-

ний)

Разрезание длинных

эндогенных dsRNAs с

помощью Dicer

Разрезание мРНК Неизвестна

Ассоцииро-

ванная с

повторами

siRNA

(rasiRNA)

24–24 (у

растений)

24–27 (у

плодовой

мушки)

Разрезание длинных

dsRNAs,

происходящих от

повторяющихся

последовательностей,

ферментом Dicer

Модификация гис-

тона и/или ДНК

Сайленсинг

транспозонов,

повторяющихся генов и

вирусов

Малая ска-

нирующая

РНК

(scnRNA)

~28 Разрезание длинных

dsRNAs с помощью

Dicer

Метилирование

гистонов, ведущее к

элиминации ДНК

Перестройка генома в

ходе конъюгации

Крошечная

некодирую-

щая РНК

(tncRNA)

Нет ~20 Производится ферме-

том Dicer из неиз-

вестного

предшественника

Неизвестен Неизвестна

Малая моду-

ляторная РНК

(smRNA)

Нет ~20 Неизвестен Транскрипционная

трансактивация

Дифференциация нейро-

нов

На рисунке 6 схематически показан механизм работы siRNA в клетках

растений и животных. Первые 4 этапа являются общими для всех организмов.

Сначала с молекулой siRNA связываются белки-ферменты хеликаза и

нуклеаза (см. этап 1), формируя комплекс RISC (RNA-induced silencing

complex; silence – англ. молчать, замолкать; silencing – замолкание, так в

англоязычной и специальной литературе называют процесс "выключения"

гена).

Рисунок 6 – Механизм работы siRNA в клетках растений и животных

Хеликаза раскручивает нити siRNA, в результате чего они расходятся

(этап 2). Одна из нитей, к которой прикреплен фермент нуклеаза, – ее

официальное название аргонавт (argonaute), может теперь связаться с

комплементарным (строго соответствующим ей) участком однонитчатой

мРНК (этап 3), позволяя нуклеазе разрезать ее. Разрезанные же участки мРНК

подвергаются действию других клеточных РНКаз, которые разрезают их на

более мелкие куски (этап 4).

У растений и насекомых выработалась своеобразная система усиления

защитного действия siRNA (этапы 5–7). Присоединяясь к цепи мРНК, участок

siRNA может с помощью комплекса ферментов, называемого DICER, сначала

достроить вторую цепочку мРНК, а затем разрезать ее в разных местах,

создавая таким образом разнообразные "вторичные" siRNA. Они в свою

очередь формируют RISC и проводят мРНК через все стадии, о которых шла

речь выше, вплоть до ее полного уничтожения. Такие "вторичные" молекулы

смогут специфично связываться не только с тем участком вирусной мРНК, к

которому была направлена "первичная" молекула, но также и с другими

участками, что резко усиливает эффективность клеточной защиты.

У млекопитающих в отличие от насекомых и растений работает и другая

система защиты. При попадании в "зрелую" (дифференцированную) клетку

млекопитающего чужой РНК, длина которой больше 30 нуклеотидов, клетка

начинает синтез интерферона. Интерферон, связываясь со специфическими

рецепторами на клеточной поверхности, способен стимулировать целую

группу генов. В результате в клетке синтезируется несколько видов

ферментов, которые тормозят синтез белков и расщепляют вирусные РНК.

Кроме того, интерферон может действовать и на соседние, еще не

зараженные клетки, блокируя тем самым возможное распространение вируса.

Как можно заметить, обе системы во многом схожи. Даже названия

"interferon" и "(RNA) interference" происходят от общего корня. Но есть у них

и одно очень существенное различие: если интерферон при первых признаках

вторжения просто "замораживает" работу клетки, не позволяя (на всякий

случай) производство многих белков в клетке, то система siRNA отличается

чрезвычайной разборчивостью: каждая siRNA будет распознавать и

уничтожать только свою, специфическую мРНК. Замена всего лишь одного

нуклеотида внутри siRNA ведет к резкому снижению эффекта

интерференции.

3.3 Функциональная роль РНК-интерференции

Итак, мы видим, что основная "специальность" siRNA в клетке – это

блокирование генов, участок которых соответствует одной из цепочек внутри

siRNA. Но почему механизм РНК-интерференции существует в клетках?

Какие процессы он призван регулировать? Что из себя представляют те

мРНК, на которые направлено "жало" малых РНК, и почему их необходимо

уничтожать?

Одно из возможных объяснений роли РНК-интерференции – это защита

организмов от РНК-содержащих вирусов и мобильных элементов,

перемещающихся посредством РНК. Таким образом, двухцепочеченые РНК

(дцРНК) могут быть важными звеньями иммунной системы, распознающими

и ликвидирующими чужую РНК. В случае, если в клетку проник РНК-

содержащий вирус, такая система защиты не даст ему размножиться. Если же

вирус содержит ДНК, дцРНК будет мешать ему производить вирусные белки.

Как предполагают, роль коротких РНК в клетке не ограничивается

только защитой от вирусов и других чужеродных РНК. Дело в том, что геном

любого многоклеточного организма включает множество элементов, которые

когда-то были привнесены в него в процессе эволюции извне, например как

результат встраивания вируса. Из всего материала, содержащегося в

хромосомах человека, 34% приходится на долю элементов, называемых

LINEs и SINEs (соответственно, Long и Short Interspersed Nuclear Elements), о

функциях которых известно только то, что они могут время от времени

копировать себя и перемещаться с одного места хромосомы на другое. Те

участки ДНК, которые достались нам от ретровирусов (8% генома) и

транспозоны (3%) также способны менять свое место в геноме. LINEs,

SINEs, остатки вирусной ДНК и транспозоны, за их способность к

перемещениям названные подвижными, или мобильными, элементами

генома, представляют значительную опасность для наших хромосом.

Некоторые из них – остатки вирусов, или протоонкогены – способны при

"включении" вызывать рак, другие мобильные элементы, размножаясь и

перемещаясь, меняют структуру хромосом, что может привести к мутациям.

Например, у плодовой мушки дрозофилы более 80% спонтанных

мутаций возникают именно из-за "хулиганского" поведения ее собственных

мобильных элементов. Их перемещения внутри генома так индивидуальны и

непредсказуемы, что положение некоторых из них может служить

"молекулярным паспортом", точно определяющим личность хозяина, что уже

используется на практике. Понятно, что каждому организму было

необходимо разработать систему жесткого контроля за поведением

мобильных элементов. Как раз эту "надзирательскую" функцию, как

полагают, и выполняет система внутриклеточных siRNA. На модели все того

же C. elegans, например, было показано, что отключение генов, кодирующих

некоторые из малых РНК, ведет к активизации перемещений мобильных

элементов в его хромосомах и соответственно – к повышению уровня

мутаций.

Кроме того, ошибки в развитии органов и тканей при отключении генов,

кодирующих систему siRNA у подопытных животных, а также ее активность

в "незрелых" клетках указывают на то, что механизм РНК-интерференции

активно участвует в регуляции программы "созревания" клеток и как

следствие может играть одну из ключевых ролей в формировании целостного

организма.

Еще одна из предполагаемых нормальных функций siRNA –

отслеживание неправильно обработанных копий других типов РНК в клетке.

Наконец, в 2002 г. исследователи неожиданно выяснили, что действие

siRNA может не ограничиваться лишь временным выключением генов на

уровне РНК. Имеются показания, что в некоторых случаях siRNA, видимо,

воздействует прямо на ДНК, изменяя структуру хроматина и способствуя

длительному "замолканию" одних и, возможно, активизации других генов.

3.4 Использование явления РНК-интерференции и малых РНК в

функциональной геномике и экспериментальной генотерапии

Этот защитный механизм, предохраняющий клетку от вирусов и

мобильных генетических элементов, можно использовать в терапевтических

целях. Самое главное для практического применения РНК-интерференции –

то, что для фермента аргонавта не имеет значения, какую информационную

РНК уничтожать: он слепо следует указаниям микро-РНК.

Обычно лекарства действуют на уровне конечных стадий

биохимического «производства»; они, образно говоря, «выключают» (или

«ломают») работающие «станки» или уничтожают «готовые изделия».

Открытие РНК-интерференции делает возможной применение иной

стратегии: не обезвреживать нежелательный биохимический продукт (рискуя

нарушить заодно и какой-либо нормально протекающий процесс), а просто

"нацеливать" собственный защитный механизм клетки – RISC – на

определенную информационную РНК, предотвращая таким способом

образование нежелательного продукта. Достаточно сконструировать

правильную микро-РНК. Это на современном этапе вполне выполнимая

задача, поскольку геном человека уже секвенирован, а для некоторых

болезней известны вполне определенные гены, за них ответственные. Ныне

уже разработан метод РНК-интерференции, который предполагает внесение в

клетку дцРНК, специально сконструированной под определенный ген.

Недавние эксперименты на животных показали, что с помощью дцРНК

можно погасить ген, обусловливающий, например, высокий уровень

холестерина в крови; есть надежда использовать в перспективе РНК-

интереференцию для лечения вирусных инфекций, в том числе СПИДа, рака

и обменных нарушений. Высокая специфичность и эффективность siRNA-

методов в совокупности с их низкой токсичностью вселяют оптимизм.

Вот примеры из офтальмологии: новые подходы к лечению макулярной

дегенерации сетчатки (macular degeneration) – болезни, которая приводит к

потере зрения. Ежегодно в мире регистрируется полмиллиона новых случаев

этого заболевания. Болезнь заключается в том, что в центральной части

сетчатки неконтролированно растут новые кровеносные сосуды, что

приводит к разрушению светочувствительных нервных клеток.