Дромашко С.Е. Генетика и вирусология

Подождите немного. Документ загружается.

составляет 36,7 и 26,7% соответственно;

 генотип GSTT1(-) в группе некурящих больных встречался со

статистической достоверностью в 1,5 раза чаще (36,4%), чем у курящих

пациентов (23,7%).

Совместно с генетиками Республиканского научно-практического центра

«Мать и дитя» начато изучение полиморфизма GST-генов у детей Беларуси с

целью разработки технологии выявления наследственной

предрасположенности к заболеваниям органов дыхания различной этиологии.

Планируется провести анализ делеционного полиморфизма в генах системы

детоксикации у новорожденных, у детей, страдающих бронхиальной астмой,

у детей с хроническим обструктивным бронхитом, а также у здоровых детей

того же возраста и определить частоту встречаемости нулевого генотипа в

этих когортах.

Эффективность лечения различными препаратами также связана с

состоянием генов. Например, лечение эндометриоза (заболевания,

встречающегося почти у 10% женщин белой расы) широко используемым

препаратом циклофероном у части больных безрезультатно по причинам

генетического характера. Наши исследования также позволят прогнозировать

чувствительность пациентов к лекарственным препаратам различных

фармакологических групп, в метаболизме которых участвуют глутатион-S-

трансферазы, что поможет индивидуализировать медикаментозную терапию

и снизить риск побочных эффектов.

К настоящему времени на хромосомах человека картировано около 800

генов, мутации которых приводят к различным наследственным

заболеваниям. Количество моногенных заболеваний, для которых известна

локализация контролирующего гена, еще больше и приближается к 950 за

счет существования аллельных серий, т.е. групп болезней, клинически сильно

отличающихся, но обусловленных мутациями в одном и том же гене. Среди

них гены, обусловливающие предрасположенность к остеопорозу (VDR-3),

дефектам заращения нервной трубки (ДЗНТ), коронарной болезни сердца

(КБС) и атеросклерозу (MTHFR), инфаркту миокарда (АСЕ), атеросклерозу

(АроЕ), аденоме и раку простаты (AR), диабету (IDDM-1 и -5), астме (СС16)

и др. Известны также онкогены (Ras, Miс) и антионкогены (p53), мутации

которых с большой вероятностью ведут к различным опухолям. Уже

идентифицированы гены, мутации которых не только предрасполагают, но и

с большой вероятностью вызывают серьезные заболевания (BRCA1, BRCA2 –

рак молочной железы, PS-1, PS-2 – болезнь Альцгеймера и др.). Быстро

увеличивается и список наследственных болезней с поздней манифестацией,

для которых вполне реальна ранняя досимптоматическая диагностика в

любом возрасте (хорея Гентингтона, другие нейродегенеративные

заболевания, рак толстой кишки, щитовидной железы и др.).

Наконец, уже сегодня можно выявлять гетерозиготное носительство

наиболее частых смертельных наследственных болезней в семьях высокого

риска (муковисцидоз, миодистрофия Дюшена, фенилкетонурия, синдром

Мартина–Белла, гемофилия, спинальная мышечная атрофия,

адреногенитальный синдром). Очень важно, что эти и многие другие тяжелые

наследственные недуги с успехом диагностируются уже пренатально, что

позволяет выявить возможность рождение больных детей.

2.2 Митохондриальные заболевания человека

В настоящее время известно более 100 точковых мутаций и несколько

сот структурных перестроек митохондриальной ДНК (мтДНК), связанных с

характерными нейромышечными и другими митохондриальными

синдромами: от летальных в неонатальном периоде жизни – до заболеваний с

поздним началом. Непосредственная причина возникновения и развития

митохондриальных расстройств кроется в дефектах системы окислительного

фосфорилирования. Благодаря выявлению все большего количества

пациентов и описанию сотен родословных, сведения о взаимоотношении

между генотипом и фенотипом, структуре и частоте встречаемости

патогенных и условно-патогенных мутаций мтДНК в популяциях

накапливаются ускоренными темпами.

Можно привести следующую классификацию патогенных мутаций

мтДНК:

 Смысловые мутации в структурных генах. Наиболее типичным

заболеванием, ассоциированным со смысловыми заменами в

митохондриальном геноме, является наследуемая по женской линии

нейропатия (атрофия) зрительных нервов Лебера (LHON).

 Мутации мтДНК, приводящие к нарушениям синтеза белка.

Прогрессирующая с возрастом нейросенсорная глухота, если она

наследуется по линии матери, часто ассоциируется с заменой А на Г в

позиции 1555 гена 12S рРНК.

 Структурные перестройки мтДНК. Описано множество перестроек в

мтДНК (дупликации, делеции или их комбинации), приводящих к

нарушениям в системе окислительного фосфорилирования. Такие

перестройки обнаружены у больных нейромышечными заболеваниями

типа синдрома Кернса–Сейра (KSS), при прогрессирующей наружной

офтальмоплегии (СРЕО) и синдроме Пирсона (болезнь костного мозга и

поджелудочной железы).

 Взаимодействие двух геномов. Хотя большинство генов, продукты

которых ответственны за нормальное функционирование системы

окислительного фосфорилирования, располагаются в хромосомах, сегодня

известно всего несколько локусов, мутации в которых могут

рассматриваться как причина митохондриальной болезни. В качестве

примера можно сослаться на синдром нейрогастроинтестинальной

энцефалопатии (MNGIE), обусловленной мутацией гена

тимодинфосфорилазы. Кроме того, в основе возникновения некоторых

митохондриальных миопатий, таких как офтальмоплегия и птоз, может

находиться дестабилизация молекулы мтДНК, инициируемая мутациями в

ядерных генах.

Рисунок 3 – Карта мтДНК человека с указанием положения генов и

относительно часто встречающихся патогенных мутаций

В лаборатории нехромосомной наследственности Института генетики и

цитологии НАН Беларуси под руководством члена-корреспондента

О.Г.Давыденко и кандидата биологических наук Н.Г.Даниленко в

содружестве с РНПЦ «Мать и дитя» ведется разработка методов ДНК-

диагностики митохондриальных заболеваний человека, в частности

вышеупомянутого синдрома Лебера. Изучается также генетическая

предрасположенность белорусов к сердечно-сосудистым заболеваниям,

ведется анализ генотипического риска в белорусской популяции по

ключевым белкам липидного метаболизма и т.д. Успешно выполнен

инновационный проект по геногеографии белорусов на основе анализа

митохондриальной ДНК и Y-хромосомы.

2.3 Принципы молекулярной диагностики наследственных и

ненаследственных заболеваний человека на разных этапах онтогенеза

В результате изучения генома человека появилась молекулярная

медицина, одно из направлений которой – генная диагностика болезней, их

профилактика и генотерапия, что имеет большое медицинское и социальное

значение. Сегодня вполне реальна не только пренатальная диагностика

наследственных болезней, но и досимптоматическая. Выявление

гетерозиготного носительства мутаций в семьях высокого риска стало

важным разделом медико-генетической службы. В России такие

исследования проводятся во многих государственных и коммерческих

центрах, в Беларуси лидером в этом направлении является РНПЦ «Мать и

дитя», предшественником которого в медицинской генетике был НИИ

наследственных и врожденных заболеваний Министерства здравоохранения

Республики Беларусь. Этот институт был создан членом-корреспондентом

РАМН и НАНБ Г.И.Лазюком и многие годы входил в число лучших медико-

генетических учреждений Европы.

Рисунок 4 – Примерное распределение генов человека

по их функциям

Принципиально различают прямую и непрямую ДНК-диагностику

моногенных наследственных болезней. В общем случае использование

прямых методов диагностики возможно лишь для клонированных генов с

известной нуклеотидной последовательностью полноразмерной кДНК; при

этом необходимо предварительное генотипирование мутантных аллелей у

родителей.

В случае прямой диагностики объектом молекулярного анализа является

сам ген, точнее, мутации этого гена. Такой подход особенно эффективен при

наличии точной информации о природе, частоте и локализации наиболее

распространенных (доминирующих по частоте) мутаций соответствующих

генов, а также о наличии в них особенно легко мутирующих «горячих» точек.

Главное преимущество прямого метода – высокая, доходящая до 100%,

точность диагностики и отсутствие необходимости анализа всей семьи на

предмет ее информативности. Последнее обстоятельство особенно важно для

проведения пренатальной диагностики тяжелых, зачастую ведущих к

летальному исходу наследственных болезней (муковисцидоза, миодистрофии

Дюшена, гемофилии А и др.).

Однако для огромного количества наследственных болезней мутации

пока не описаны. Кроме того, всегда сохраняется возможность присутствия у

пробанда неизвестных мутаций. Далеко не всегда возможно примененять

такой подход и вследствие очевидных финансовых и временных

ограничений. Однако такие трудности успешно преодолеваются благодаря

наличию непрямых (косвенных) методов молекулярной диагностики.

Этот исторически наиболее ранний подход основан на использовании

сцепленных с геном полиморфных маркеров, с помощью которых проводится

идентификация мутантных хромосом (точнее хромосом, несущих мутантный

ген) в семьях высокого риска, т.е. у родителей больного и его ближайших

родственников.

В настоящее время применять косвенные методы молекулярной

диагностики принципиально возможно для выявления практически всех

моногенных заболеваний с известной локализацией контролирующего гена,

для каждого из которых уже разработана удобная система вне- и

внутригенных полиморфных индексных маркеров. Косвенные методы

молекулярной диагностики пригодны даже для тех болезней, гены которых

еще не идентифицированы и мутации неизвестны. Единственным и

непременным условием применения этой методики является наличие

полиморфных сайтов рестрикции либо коротких тандемных повторов типа

STR, находящихся в непосредственной близости от мутантного гена или, что

еще лучше, внутри него (чаще всего в интронах). При помощи этих

полиморфных сайтов удается маркировать мутантные аллели гена и

проследить их передачу потомству.

В качестве еще одного примера работы белорусских исследователей

следует назвать лабораторию молекулярной генетики Института генетики и

цитологии НАН Беларуси, где под руководством академика НАНБ

Н.А.Картеля многие годы ведутся исследования молекулярных механизмов

возникновения и развития рака щитовидной железы. В 2006 г. его учеником

Д.Г.Ярмолинским защищена кандидатская диссертация на тему

«Молекулярно-генетический анализ генома опухолевых клеток щитовидной

железы у белорусских пациентов», в которой изучены молекулярно-

генетические аспекты развития папиллярных карцином щитовидной железы,

удаленных в период с 1996 по 2001 гг. у пациентов, которые проживали в

белорусской зоне радиационного облучения во время аварии на

Чернобыльской АЭС.

2.4 Генная и клеточная терапия моногенных и мультифакторных

заболеваний

Каждый сотый ребенок в мире рождается с серьезными

наследственными дефектами, количество которых неумолимо растет.

Наследственные отклонения, как правило, приводят к физическим или

умственным нарушениям и преждевременной смерти. Для большинства

известных в настоящее время наследственных заболеваний еще не найдено

достаточно эффективных способов лечения.

Спасением от таких заболеваний могло бы стать введение в организм

больного неповрежденной копии мутантного участка ДНК. Первая успешная

попытка применить генотерапию в клинической практике была предпринята

в 1990 г. в США. Ребенку, страдающему редким заболеванием – тяжелым

комбинированным иммунодефицитом, – которое связано с дефектом гена,

кодирующего фермент аденозиндезаминазу, была введена неповрежденная

копия гена. И хотя использованный метод предполагал многократное

введение гена на протяжении всей жизни пациента, т.е., строго говоря, не

обеспечивал полного излечения, была открыта новая эра в медицине.

Известно несколько подходов к лечению генами. Гены можно вводить в

половые клетки (сперматозоиды или яйцеклетки), в клетки эмбриона на

ранних стадиях развития либо в соматические клетки (клетки тела, кроме

половых или их предшественников). Введение генов в половые клетки

означает, что приобретенное свойство будет передаваться из поколения в

поколение. Именно этот метод широко используется при получении

трансгенных животных, но он вряд ли применим к людям из этических

соображений.

Генотерапия соматических клеток в отличие от половых затрагивает

организм только самого пациента и поэтому разрабатывается в качестве

основного подхода. При этом большое значение имеет правильный выбор

типа соматических клеток, которые должны обеспечить длительное

сохранение и функционирование внесенного "лечебного" гена.

Наследственные заболевания могут быть обусловлены дефектом одного

или нескольких генов, а также крупными генетическими изменениями,

например утратой целой хромосомы. Безусловно, на современном этапе

можно пытаться лечить генами только заболевания первого типа, так

называемые моногенные, при условии, что ответственный за дефект ген уже

обнаружен и клонирован, т.е. получен материал для введения больному.

Таблица 1 – Методы внесения ДНК в эукариотические клетки и область

их применения

Методы переноса ДНК

Применимость для доставки генов

в культивируемые

клетки

в ткани

Химические:

осаждение ДНК фосфатом Са + –

Физические:

электропорация + –

микроинъекции + –

бомбардировка частицами + +

простая инъекция – +

Слияние:

липосомы + +

Опосредованное рецепторами

поглощение:

ДНК-белковые комплексы + +

Рекомбинантные вирусы:

аденовирусы + +

ретровирусы + –

Применяются два способа передачи больному "лечебного" гена. Если

болезнь связана с отсутствием или малыми количествами белкового продукта

дефектного гена, то достаточно ввести в клетку неповрежденный ген и дать

ему возможность работать; в результате появятся достаточные количества

белка-продукта. Таким образом, внесенная копия гена заместит по функциям

сохраняющийся в геноме больного дефектный ген, поэтому этот подход

получил название заместительной терапии. Все используемые в настоящее

время клинические методы переноса генов основаны на внесении в клетку

дополнительных количеств ДНК, т.е. на заместительной терапии.

Другим, идеальным, способом излечивать генетические заболевания

могла бы быть корректирующая (или исправляющая) терапия, при помощи

которой дефектный ген реально заменялся бы в геноме нормальной копией.

Этого можно достичь, основываясь на способности двух молекул ДНК к

рекомбинации – обмену при помощи специальных ферментов фрагментами

полинуклеотидных цепей. Однако из-за крайне низкой эффективности этого

метода в условиях лаборатории до практического использования

корректирующей терапии пока очень далеко.

Генетическая модификация соматических клеток может производиться

либо непосредственно в организме больного, либо путем введения

функционального гена в предварительно выделенные и культивируемые

клетки пациента, которые затем возвращают в организм. Оба способа имеют

недостатки и ограничения, но второй способ в настоящее время используется

чаще из-за его большей эффективности.

Таблица 2 – Генотерапия некоторых наследственных заболеваний

Заболевания Тип вводимых генов

Тип клеток, в которые

вводится «лечебный» ген

Тяжелый

комбинированный

иммунодефицит

Ген аденозиндезаминазы Т-лимфоциты, стволовые

клетки костного мозга

Болезнь Гоше (лизосомная

болезнь накопления)

Ген глюкоцеребозидазы Стволовые клетки

костного мозга

Семейная

гиперхолистеринемия

Ген рецептора Гепатоциты печени

Гемофилия Ген одного из факторов

свертывания крови

Фибробласты кожи

Талассемия Ген глобулинов и их регу-

ляторные участки

Клетки костного мозга

Муковисцидоз Ген регулятора трансмем-

бранной проводимости

Эпителий легкого (аэро-

зольное впрыскивание

век-тора в дыхательные

пути)

Прогрессирующая дистро-

фия мышц Дюшена

Ген дистрофина Мышцы (инъекции), мио-

циты

Примечание. В случае, когда «лечебный» ген вводился непосредственно в

ткани пациента, в скобках указан способ его доставки. В остальных случаях

введение гена производили в клетки, извлеченные из организма больных и

культивируемые в пробирках

Главное условие примения метода переноса генов – включается

(интегрирует) ли новый ген в хромосому клетки-мишени. Для активно

делящихся клеток отсутствие интеграции внесенного гена в клеточную ДНК

означает его неминуемую утрату в клетках-потомках. Одной из основных

причин того, что в 80% случаев для внесения чужеродной ДНК при

клинических испытаниях на людях использовали ретровирусные векторы,

является его стабильная интеграция в клеточный геном. Кроме того, эти

векторы обеспечивают высокую эффективность доставки генов и не приводят

к ощутимым повреждениям в клетке-мишени. В отличие от ретровирусных

аденовирусные векторы в геном не интегрируются.

2.5 Молекулярная геномика

Использование методов молекулярной геномики позволит установить,

какие гены данного человека дефектны и какими заболеваниями это

угрожает. Уже сегодня в силах науки провести такой анализ и составить

генетический паспорт человека.

Исследования в этом направлении ведутся и в России: в Москве – в

Научном центре медицинской генетики и Институте неврологии РАМН, в

Санкт-Петербурге – в Институте биорегуляции и геронтологии РАМН и в

лаборатории пренатальной диагностики НИИ акушерства и гинекологии

РАМН, в Томске – в Институте медицинской генетики, в Медико-

генетическом центре Новосибирска и в Институте биохимии и генетики

Уфимского научного центра РАН Генетический анализ может выявить

предрасположенность к гипертонии, диабету, некоторым формам рака,

болезни Дауна, фенилкетонурии, к алкоголизму и наркомании, даже к

гомосексуализму.

Рисунок 5 – Интернет-сайты российских центров молекулярной

диагностики

Группа компаний с участием фирмы Motorola Life Sciences уже

разрабатывает портативное устройство генной диагностики заболеваний на

базе карманного компьютера. Оно будет определять болезнь, исследуя

образец слюны пациента. Новая технология появится в лечебных

учреждениях в течение ближайших пяти лет, а в быту – десяти лет. Генная

диагностика позволит определить наиболее слабые участки человеческого

организма, предрасположенность к тем или иным болезням. Соответственно

человек сможет построить свою жизнь так, чтобы в дальнейшем избежать

проблем со здоровьем. В случае, если генная диагностика выявит какое-то