Белясова Н.А. Биохимия и молекулярная биология

Подождите немного. Документ загружается.

319

Данный циклический процесс повторяют с той же реакционной смесью

20—60-кратно. После третьего цикла амплификации начинают накапливать-

ся двухнитевые фрагменты ДНК, равные по длине расстоянию между двумя

праймерами (рис. 21.4). В каждом последующем цикле количество синтези-

рованных фрагментов удваивается, т. е. за n циклов образуется 2

копий дуп-

лексных сегментов с длиной, ограниченной праймерами.

Практическое применение метода PCR имеет несколько аспектов. Во-

первых, с помощью амплификации определенных последовательностей ДНК,

уникальных для определенных геномов или даже целых генов, можно обна-

ружить данные сегменты даже при условии, что изначально они присутству-

ют в клетках в очень малых дозах (числе копий). Например, начальные этапы

вирусных инфекций характеризуются низким содержанием нуклеиновых ки-

слот вирусов, но их можно обнаружить с помощью PCR-метода с последую-

щей идентификацией при использовании зондов, комплементарных искомым

последовательностям. Такие методы в настоящее время широко используют

для детекции вирусов кори и краснухи, а также холерного вибриона.

Еще одним приложением метода является диагностирование наследст-

венных заболеваний. Для многих наследственных заболеваний в настоящее

время уже выявлены гены, а также их локусы, мутации в которых приводят к

тяжелым болезням. Поскольку эти мутации передаются в поколениях инди-

видуумов, для ответа на вопрос — будет ли будущий новорожденный нести

ту или иную мутацию требуется выявить ее у плода (пренатальная диагности-

ка). Для этого приблизительно на 16-й неделе беременности производят отбор

амниотической (околоплодной) жидкости, из которой можно выделить клетки

плода в ходе центрифугирования. Из клеток извлекают ДНК. Получить пре-

паративные количества фрагментов ДНК, предположительно содержащие

мутации, можно двумя путями: клонированием соответствующих фрагментов

или их амплификацией методом PCR. Второй способ гораздо проще и дешев-

ле. После того, как искомый фрагмент ДНК получен в достаточном количест-

ве, можно осуществить его секвенирование и сопоставить нуклеотидные по-

следовательности нормального и анализируемого генов. Существует и более

простой способ выявления мутаций во фрагментах ДНК — блот-

гибридизация.

Блот-гибридизация (блотинг по Саузерну). Этот метод разработан Сау-

зерном в Эдинбурге. Он основан на способности гомологичных цепей ДНК

гибридизоваться в подходящих условиях. Суть метода состоит в следующем.

Исследуемую ДНК расщепляют рестриктазами на фрагменты, которые разде-

ляют по размеру в ходе электрофореза в агарозном геле. Затем гель помеща-

ют на нитроцеллюлозный фильтр и пропускают через него соответствующий

буферный раствор в направлении, перпендикулярном направлению электро-

фореза. При этом фрагменты ДНК элюируются из геля и связываются с нит-

роцеллюлозным фильтром, на котором в результате получается реплика геля.

Для поиска нужных фрагментов ДНК на реплике проводят гибридизацию с

меченым зондом, специфичным к искомому гену (фрагменту). Аналогичная

методика используется для анализа РНК.

В основе обнаружения мутаций в генах лежит явление полиморфизма

длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ или RFLP от англ. restriction

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

320

fragment length polimorphism). Оно заключается в том, что последователь-

ность ДНК, содержащая мутацию, может приобретать или, наоборот, утрачи-

вать сайты рестрикции для тех или иных рестриктаз. Это можно обнаружить

при разделении полученных фрагментов электрофорезом и гибридизацией с

радиоактивным зондом. Сопоставление радиоавтографов для нормального и

мутантного генов в этом случае позволяет обнаружить разницу в количестве и

положении «полос» (рис. 21.5).

В качестве примера использования методов PCR и блот-гибриди-зации

для ранней диагностики наследственных заболеваний можно привести прена-

тальную идентификацию серповидно-клеточной анемии. Причиной этого не-

дуга является мутация в гене, определяющем структуру b-глобиновой цепи

гемоглобина, в результате чего остаток глутамата в 6 положении (кодируется

триплетом GAG) замещается на остаток валина (кодируется триплетом GTG).

Измененный гемоглобин имеет тенденцию кристаллизоваться в эритроцитах,

при этом они становятся менее гибкими, задерживаются в селезенке, и воз-

никает их дефицит в крови. Мутацию легко идентифицировать с помощью

рестрикционных ферментов Dde I и Mst II. Нуклеотидная замена аденилата

на тимидилат в смысловой цепи ДНК, вызывающая серповидно-клеточную

анемию, нарушает структуру сайтов рестрикции для названных ферментов,

которые, однако, остаются не измененными в нормальном гене b-глобина.

Это отличие и выявляется в ходе анализа.

Получают ДНК b-глобинового гена или его фрагмента, который может

содержать данную мутацию, используя метод клонирования или (проще) —

PCR-метод. Расщепляют фрагменты, например, с помощью Dde I и осущест-

вляют блот-гибридизацию с меченной

Р b-глобиновой ДНК. На радиоавто-

графе геля для нормальной ДНК выявляются два фрагмента длиной 201 и

175 п. н., а для мутантной ДНК — только один фрагмент размером 376 п. н.

(рис. 21.5).

PCR-метод совместно с блот-гибридизацией используются также в судеб-

но-медицинской практике, в частности для установления отцовства, а также

для идентификации принадлежности биологической пробы тому или иному

лицу. В последнем случае обнаруженные на месте преступления образцы

биологического материала (кровь, слюна, волосы) используются для извлече-

ния ДНК, в которой амплифицируются определенные участки (наиболее ва-

риабельные по структуре). То же проделывают с ДНК, выделенной из крови

подозреваемых лиц. После расщепления амплифицированных фрагментов

рестриктазами и блот-гибридизацией с мечеными зондами получают радио-

автографы гелей. Сопоставление расположения «полос» на радиоавтографах

позволяет ответить на вопрос о принадлежности биологических образцов.

Принцип метода основан на том, что одинаковые фрагменты ДНК, полу-

ченной от генетически не идентичных индивидов, часто образуют рестрикци-

онные фрагменты различной длины. Метод достаточно чувствителен, по-

скольку PCR позволяет получать микрограммы ДНК-копий

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

321

Рис. 21.5. Идентификация серповидноклеточного мутантного гена b-глобина

сегмента, даже когда он присутствует в препарате в составе единственной

молекулы.

Возможность идентификации мутаций в генах и умение получать практи-

чески любые гены, лишенные мутаций, позволили приблизиться к лечению

наследственных заболеваний. Возникло новое направление на стыке медици-

ны и генетической инженерии — генотерапия, под которой подразумевают

введение нуклеиновых кислот в клетку с целью направленного изменения

генных дефектов или придания клеткам новых функций. Основной подход

генотерапии, реализуемый в настоящее время, состоит в выделении ДНК из

больного организма, осуществлении исправления мутаций (например, в ходе

сайт-специфического мутагенеза), введение исправленной ДНК в организм

больного (метод ex vivo). Первый удачный результат генной терапии человека

получен в США в 1990 г., когда с помощью методологии ex vivo удалось вы-

лечить четырехлетнюю девочку с врожденным иммунодефицитом (мутация в

гене аденозиндезаминазы). Внутривенно больной вводили собственные лим-

фоциты, трансформированные нормальным геном аденозиндезаминазы, кло-

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

322

нированном на ретровирусном векторе.

Еще одно приложение генноинженерных методов к медицинским пробле-

мам состоит в производстве вакцин, отличающихся высокой надежностью,

применение которых исключает риск заболеваний (в отличие от вакцин, по-

лучаемых традиционными методами — инактивацией возбудителей). Разра-

ботаны и широко применяются генноинженерные вакцины против гепатита В

и А — очень опасных заболеваний, приобретающих характер эпидемий. Раз-

рабатываются вакцины против СПИДа.

Основными достижениями генетической инженерии для сельского хозяй-

ства можно считать создание трансгенных животных и растений. Трансген-

ными считают такие особи животных, растений или микроорганизмов, гене-

тическая программа которых изменена с использованием методов генной ин-

женерии.

Трансгенных животных — коров, свиней, овец, коз — используют для

секреции под промоторами «генов молока» высокоактивных биологических

веществ для медицины и фармакологии. Уже прошли лицензирование и по-

ступили на рынок полученные через трансгенных животных антитрипсин

(для лечения легочных заболеваний), антитромбин III (для предотвращения

инфарктов и инсультов), факторы свертываемости крови, лактоферрин (свя-

зывает и транспортирует в организм железо, обладает биоцидными свойства-

ми по отношению к патогенной микрофлоре, регулирует естественный имму-

нитет, замедляет развитие опухолей). Первый трансгенный бычок, насле-

дующий ген человеческого лактоферрина, получен в Голландии в 1990 г. Те-

перь стада трансгенных коров с этим геном есть в нескольких странах.

Методы молекулярной диагностики в применении к животным позволяют

выявлять не только гены с «вредными» мутациями, которые обусловливают

наследственные заболевания, но и «полезные» гены, например детермини-

рующие устойчивость к инфекционным заболеваниям (лейкоз, колибактериоз

и др). Появляется возможность имплантировать эти гены селекционируемым

животным.

Аналогичная ситуация наблюдается в отношении трансгенных растений.

Изолированы гены, кодирующие ферменты деградации некоторых гербици-

дов. Введение этих генов в растения позволило получить устойчивые к герби-

цидам сорта. Другим примером является введение в геном растений модифи-

цированных генов прототоксина Bacillus thuringiensis, в результате чего по-

лучен картофель, устойчивый к колорадскому жуку, а также хлопок и кукуру-

за, устойчивые к вредителям.

Показано, что растения могут производить белки животного происхожде-

ния. Например, получены трансгенные растения табака, в которых собирают-

ся полностью функциональные моноклональные иммуноглобулины, в частно-

сти специфичные к бактериям, вызывающим кариес (перспектива получения

антикариесной зубной пасты). Разработаны подходы, позволяющие получать

бактериальные антигены в растениях и использовать их в качестве вакцин. В

настоящее время у 120 видов растений существуют трансгенные формы. Раз-

решено использование трансгенных сои, кукурузы, хлопка, рапса, картофеля,

томатов, свеклы, тыквы, табака, льна. Эти растения выращивают в 11 стра-

нах мира. С их использованием, кроме перечисленных выше, решены такие

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

323

проблемы, как устойчивость к вирусным, грибковым и бактериальным забо-

леваниям, регуляция сроков созревания, повышение общей продуктивности,

продукция съедобных вакцин.

Перечисленные достижения, связанные с внедрением методов генетиче-

ской инженерии в медицину и сельское хозяйство, получены за очень корот-

кий срок, в основном в ходе последнего десятилетия. При этом ни научная, ни

широкая общественность не успела осознать всех последствий масштабного

внедрения подобных разработок в практику. Никто в настоящее время не спо-

собен гарантированно предсказать ни полную безвредность, ни безусловный

вред от использования в пищу продуктов, полученных из генетически моди-

фицированных организмов, от возделывания в неконтролируемых условиях

(на естественных полях) трансгенных растений, от последствий генотерапии

и т. п. Поэтому в странах, где проводятся подобные работы, существует сис-

тема государственного контроля за генноинженерной деятельностью, переда-

чей и использованием генетически модифицированных растений и животных.

В большинстве государств приняты и действуют соответствующие законы,

правительственные нормативные акты, строго регламентирующие требования

к подобного рода исследованиям, порядок и ответственность научных органи-

заций и государственных органов за безопасность при создании, выпуске в

окружающую среду и использовании трансгенных животных и растений. Это

становится особенно актуальным в связи с прогнозами специалистов, соглас-

но которым в ближайшие годы на мировом рынке более 20 % объема всей

экспортно-импортной продукции составят товары и продукты, полученные с

помощью методов современной биотехнологии и биоинженерии.

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

Часть вторая. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ КЛЕТОЧНЫХ

КОМПОНЕНТОВ

Глава 4. БИОМЕМБРАНЫ

К биомембранам относят плазматические мембраны клеток, ядерную

мембрану, мембраны эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи,

мембраны лизосом, пероксисом, митохондрий, хлоропластов, суперкапсиды

вирусов, а также некоторые специализированные мембраны отдельных орга-

низмов. Все они имеют классическую структуру — липидный бислой с вкра-

плениями белковых молекул, и можно говорить, что принципиально их орга-

низация не различается, что дает право рассматривать эти принадлежащие

разным организмам и органеллам мембраны в общей схеме.

Биомембраны выполняют такое количество разнообразных, неотъемле-

мых для живых существ функций, что можно считать их появление решаю-

щим этапом возникновения жизни. Основными функциями мембран являют-

ся следующие:

1) ограничивающая: биомембраны окружают все про- и эукариотические

клетки, обосабливая таким образом живое от неживого или отдельные клетки

в многоклеточном организме. Мембраны также ограничивают содержимое

отдельных органелл в эукариотических клетках, позволяя в каждой из них

осуществляться специфическим процессам;

2) барьерная: биомембраны представляют собой высокоизбирательный

барьер для большинства веществ, стремящихся попасть в клетку (органеллу)

или покинуть ее;

3) мембраны обусловливают индивидуальность клеточных поверхностей,

что особенно важно для многоклеточных животных организмов, лишенных

клеточных стенок: это позволяет клеткам взаимодействовать между собой,

формируя органы и ткани;

4) такие незаменимые для многих клеток процессы запасания энергии,

как окислительное и фотофосфорилирование, могут осуществляться только

на мембранах;

5) многие ферментативные реакции осуществляются только в мембранах,

и биомембраны воздействуют на активность многих ферментов;

6) генерация и перенос нервных импульсов возможны только на мембра-

нах, биомембраны обладают рецепторной функцией. Работа высокоразвитых

органов чувств высших животных и человека основана на свойствах мем-

бран;

7) многие жизненно важные для клетки функции требуют обязатель-

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

ного участия мембран. Это, в первую очередь, синтез белка, репликация

ДНК, модификация и секреция белков, регуляция метаболизма, основанная

на гормональном ответе.

Биомембраны представляют собой природные пленки толщиной 5—7 нм,

состоящие в основном из липидов, которым принадлежит, в первую очередь,

структурная функция, и белков, определяющих разнообразие мембран и уни-

кальность их свойств. Кроме того, в состав мембран входят углеводы, кото-

рые присутствуют там не в свободной форме, а в составе сложных соедине-

ний: гликолипидов и гликопротеинов. Для объяснения организации био-

мембран предложено несколько моделей, из которых общепринятой в на-

стоящее время считается жидкостно-мозаичная модель С.Дж. Сингера и

Г.Л. Николсона, предложенная в 1971 г. Согласно этой модели, основой мем-

бран служит текучий липидный бислой, в котором остатки жирных кислот

фосфолипидов находятся в жидкокристаллическом состоянии. В бислой по-

гружены и встроены молекулы белков, также способные к движению. Со

времени своего появления модель Сингера и Николсона претерпела некото-

рые изменения и уточнения, но ее концептуальная основа осталась неизмен-

ной.

Для изучения структуры биомембран используются в основном методы

электронной микроскопии препаратов, приготовленных по типу заморажива-

ния—скалывания, и метод дифракции рентгеновских лучей.

4.1. Особенности организации мембранных липидов

В биомембранах присутствует несколько основных классов липидов:

фосфоглицеролипиды, фосфосфинголипиды, гликоглицеролипиды, гликос-

финголипиды, стеролы. Разнообразие представителей этих классов огромно:

в любой конкретной мембране может содержаться до ста разных типов ли-

пидных молекул, что, очевидно, связано с разнообразием их функций. Одна-

ко основной функцией липидов в биомембранах служит структурная —

липиды формируют двухслойный матрикс, в котором находятся белковые

молекулы.

Фосфоглицеролипиды. Этот класс липидов в количественном отношении

преобладает в большинстве биологических мембран. Наибольшее распро-

странение получили следующие фосфоглицеролипиды: фосфатидилхолин,

фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, дифосфатидилглицерол (кардио-

липин). Основу молекул фосфоглицеролипидов представляет трехатомный

спирт глицерол. Две его гидроксильные группы этерифицированы двумя ос-

татками жирных кислот, а третья — остатком фосфорной кислоты. Образо-

ванная в результате молекула представляет собой основной предшественник

всех фосфоглицеролипидов — фосфатидную кислоту (рис. 4.1).

В клетке присутствует небольшое количество фосфатидата, поскольку он является

ключевым промежуточным соединением для синтеза всех фосфоацилглицеролов. По-

следние образуются в ходе реакции этерификации фосфатной группы гидроксильной

группой одного из спиртов. На рис. 4.1 представлены структурные формулы наиболее

часто встречающихся в мембранах полярных спиртов, а также структура одного из

фосфоглицеролипидов — фосфатидилхолина (лецитина).

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

OH OH

Глицерол

O P

Фосфатидат

N CH

CHCH

COO

Холин

Этаноламин

Серин

CH CH

Гидрофобный

хвост

Полярная головка

Фосфатидилхолин

Рис. 4.1. Строение молекул фосфоглицеролипидов и их структурных компо-

нентов. R

и R

— остатки углеводородных цепей жирных кислот

Жирные кислоты в составе фосфолипидов почти всегда содержат четное

число атомов углерода (от 14 до 24). Среди них наиболее распространены

следующие: пальмитиновая (16:0), пальмитолеиновая (16:1 D9), стеариновая

(18:0), олеиновая (18:1 D9), линолевая (18:2 D9,12), g-линоленовая

(18:3 D6,9,12), a-линоленовая (18:3 D9,12,15), арахиновая (20:0), арахидоно-

вая (20:4 D5,8,11,14). В скобках указано число атомов углерода: число двой-

ных связей, число атомов углерода (D) от карбоксильной группы до двойной

связи.

Фосфоглицеролипиды выполняют в мембранах структурную функцию.

Фосфатидилхолин служит основным компонентом мембран животных кле-

ток, фосфатидилэтаноламин чаще встречается в мембранах бактерий. Это

сильно амфифильные молекулы, поскольку содержат в структуре две нерав-

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

нозначные по свойствам группировки: полярную гидрофильную головку и

неполярный гидрофобный хвост (рис. 4.1).

Фосфосфинголипиды. Это также сильно амфифильные молекулы. Они

образованы на основе аминоспирта сфингозина, который имеет длинную

негидролизуемую ненасыщенную углеводородную цепь (рис. 4.2). Первич-

ным сфинголипидом, из которого образуются все классы неглицероловых

липидов, является церамид (рис. 4.2). Он формируется в результате присое-

динения жирной (чаще моноеновой) кислоты к центральной аминогруппе

сфингозина с образованием амидной связи.

Фосфосфинголипиды представляют собой церамиды, у которых остав-

шаяся спиртовая группа этерифицирована фосфатным производным (фосфо-

рилхолином, фосфорилэтаноламином, фосфорилинозитолом, фосфорилгли-

церолом). Церамид, этерифицированный фосфорилхолином называется

сфингомиелином (рис. 4.2). Сфингомиелин преобладает в

CHHO CH CH

HO CH CH

CHHO CH CH

N(CH

)

Сфингозин

Церамид

Сфингомиелин

Полярная головка

Гидрофобный

хвост

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

Рис. 4.2. Структурные компоненты и строение молекул фосфосфинголи-

пидов на примере сфингомиелина (церамид-1-фосфорилхолина)

мембранах животных клеток, выполняя там в основном структурную функ-

цию.

Гликоглицеролипиды. Представляют собой полярные липиды, построен-

ные на основе глицерола, у которого гидроксил у третьего атома углерода

участвует в образовании гликозидной связи с каким-либо углеводом. Роль

углеводных единиц чаще выполняют остатки галактозы или 6-сульфо-6-

дезокси-a-D-глюкопиранозил, при этом образуются, соответственно, монога-

лактозилдиацилглицерол и сульфолипид (рис. 4.3). Гидроксилы двух осталь-

ных атомов углерода в гликоглицеролипидах так же, как в фосфоглицероли-

пидах, этерифицированы жирными кислотами. Моногалактозилдиацилглице-

рол считается самым распространенным в природе полярным липидом, по-

скольку на его долю приходится до половины всех липидов тилакоидных

мембран хлоропластов. Гликоглицеролипиды выполняют в основном рецеп-

торную функцию.

Гликосфинголипиды. Молекулы этих липидов построены на основе це-

рамида, к концевой гидроксильной группе которого с помощью гликозидной

связи присоединяются моно- либо олигосахариды. Те гликосфинголипиды, у

которых углеводная часть представлена моносахаридами, носят название це-

реброзиды. Цереброзиды присутствуют в высоких концентрациях в мозге и

нервных тканях млекопитающих. В частности, галактоцереброзид (рис. 4.4)

является основным компонентом миелиновой оболочки нервного волокна.

Сфинголипиды, у которых углеводная часть представлена коротким ки-

слотным, как правило, разветвленным олигосахаридом, называются ганг-

лиозидами. Кислотность этого класса гликолипидов обусловлена присутст-

вием в них в качестве ветвей углеводной цепи моносахарида нейраминовой

кислоты или ее N-ацетил-производного (рис. 4.4).

Гликосфинголипиды участвуют в регуляции клеточного метаболизма, в

частности играют роль в регуляции роста клеток. Кроме того, гликолипиды

данного класса можно считать молекулами-медиаторами: они выполняют

сигнальные функции, воспринимая и передавая сигналы. Гликосфинголипиды

мембран эритроцитов несут антигены группы крови.

CHOCOR

OCOR

Моногалактозилдиацилглицерол

OCOR

CHOCOR

Сульфолипид (6-сульфо-6-дезокси-

)

a-D

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)