Белясова Н.А. Биохимия и молекулярная биология

Подождите немного. Документ загружается.

269

(группа пептидных антибиотиков с циклолинейной структурой) способны

связываться с фосфатными группами кардиолипина, фосфатидилэтаноламина

и других кислых липидов, входящих в структуру липидного бислоя мембран.

При этом наблюдается нарушение проницаемости мембраны — очень серьез-

ное повреждение, влияющее на весь клеточный метаболизм (в первую оче-

редь, происходит «потеря» ионов, создающих градиент на мембране). Кроме

этого, полимиксины активируют фосфолипазы наружной мембраны грамот-

рицательных бактерий, что приводит к разрушению липидного бислоя. Эти

нарушения носят бактерицидный характер, а действие полимиксинов направ-

лено, в первую очередь, против грамотрицательных бактерий, обладающих

дополнительной (наружной) мембраной.

Похожим образом действуют на мембраны полиеновые антибиотики

(амфотерицин В, нистатин, леворин, трихомицин). Их молекулы содержат

сопряженную систему двойных связей, а мишенью действия является мем-

брана. Полиеновые антибиотики связываются со стеролами особой структу-

ры, которые преобладают в мембранах грибов. В результате в мембранах

образуются крупные поры, приводящие к нарушению проницаемости.

Нарушают проницаемость мембран также антибиотики-ионофоры, опи-

санные в главе 4.

Ингибиторы трансляции. К этой группе относится значительное коли-

чество антибиотиков (рис. 18.2), среди которых наибольшее распространение

имеют тетрациклины, аминогликозидные антибиотики (стрептомицин,

канамицины, неомицины, гентамицины), хлорамфеникол, макролид-

ные антибиотики (эритромицины, олеандомицин, лейкомицины, тило-

зин). Особенностью этих веществ является способность связываться с рибо-

сомами, блокируя синтез белка. Следует отметить, что большинство перечис-

ленных антибиотиков характеризуется избирательностью связывания именно

с субъединицами (или их составными частями) 70S-рибосом, присутствую-

щими в клетках прокариот. Поэтому данные антибиотики специфичны по

отношению к прокариотам. Их действие носит в основном обратимый харак-

тер, и поэтому они обусловливают чаще бактериостатический эффект.

Связываясь с рибосомами, ингибиторы трансляции либо препятствуют

взаимодействию с рибосомами аминоацилтранспортных РНК (тетрацикли-

ны), либо ингибируют инициацию трансляции (стрепто-мицин), либо ингиби-

руют активность пептидилтрансферазы — структур-ной части 50S-

субъединицы рибосомы (хлорамфеникол), либо нарушают процесс трансло-

кации рибосомы (эритромицин) и т. п.

Антибиотик пуромицин имеет структурное сходство с концевым фраг-

ментом акцепторной ветви аминоацил-тРНК, но он значительно меньших

размеров. Благодаря этому пуромицин способен быстро связываться с А-

участком рибосом (70S и 80S), однако после присоединения к аминогруппе

пуромицина пептидного остатка (пептидилтрансферазная реакция) весь ком-

плекс отщепляется от рибосомы из-за отсутствия кодон-антикодонового

взаимодействия. Пуромицин обладает высокой токсичностью по отношению

к эукариотическим клеткам, поскольку не имеет избирательности связывания

с 70S-рибосомами. Этот антибиотик

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

270

Тетрациклины

Х = Cl

Тетрациклин:

X = H, R = H

Хлортетрациклин:

R = H

Окситетрациклин:

X = H, R = OH

OOH

NHCH

HOH

CHO

Стрептомицин

CHCl

Хлорамфеникол

(левомицетин)

CO CO

пептид

Саркозин

Актиномицин D

Пептид:

L-Thr D-Val L-Pro

L-метил-Val

Рис. 18.2. Структура тетрациклинов, актиномицина D, стреп-

томицина, хлорамфеникола

активен против бактерий, простейших, гельминтов, а также некоторых злока-

чественных опухолей.

Антибиотики-интеркаляторы. Действие этих антибиотиков основано

на способности встраиваться (интеркалировать) в молекулы ДНК. Таким дей-

ствием обладает, например, актиномицин D (рис. 18.2), адриамицин, дау-

номицин. Молекула актиномицина, в частности, встраивается своей плоской

гетероциклической частью между параллельными плоскостями пар основа-

ний ДНК. Подобным образом ведет себя дауномицин, две молекулы которого

интеркалируют своими гетероциклическими ядрами между плоскостями пар

оснований G/C. При таком воздействии локально нарушается структура ДНК,

что приводит к ингибированию процессов репликации и транскрипции.

Поскольку структура ДНК отличается высокой консервативностью, анти-

биотики-интеркаляторы активны и в отношении ДНК эукариот, что делает их

высокотоксичными. Эти антибиотики находят применение при химиотерапии

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

271

злокачественных опухолей, клетки которых, как известно, делятся быстрее

нормальных, а значит, и матричные процессы, на которые воздействуют на-

званные антибиотики, в них более активны.

ДНК-тропные антибиотики. Эти антибиотики взаимодействуют с мо-

лекулами ДНК, приводя к их разрушению. Классическим примером служат

митомицины (А, В, С), а также порфиромицин. Действие названных анти-

биотиков осуществляется двумя путями: во-первых, модификацией пурино-

вых оснований, во-вторых, формированием поперечных сшивок между анти-

параллельными цепями ДНК. Как результат, происходит подавление процес-

са репликации, возникают ошибки репликации, а также происходят разрывы

молекулы ДНК. Еще один тип антибиотиков — блеомицины вызывают мно-

гочисленные одно- и двухнитевые разрывы в молекулах ДНК.

Большинство ДНК-тропных антибиотиков высокотоксичны и использу-

ются в качестве противоопухолевых препаратов.

Ингибиторы транскрипции. Кроме уже названных антибиотиков-

интеркаляторов, транскрипцию подавляют рифамицины. Эти антибиотики

взаимодействуют с ДНК-зависимыми РНК-полимеразами прокариот, в част-

ности с b-субъединицей минифермента. Связывание носит нековалентный

характер, однако оказывается довольно прочным, из-за чего нарушается про-

цесс синтеза цепей РНК.

Ингибиторы ферментативных процессов. В качестве таких антибио-

тиков выступают уже рассмотренные выше пенициллины, цефалоспорины,

циклосерин, хлорамфеникол и др. Кроме того, следует отметить антимицин,

подавляющий процесс транспорта электронов между цитохромами в дыха-

тельной цепи, олигомицин, связывающийся с ферментами, обусловливаю-

щими сопряжение окисления субстратов с фосфорилированием, новобиоцин,

являющийся ингибитором фермента ДНК-гиразы (принимает участие в реп-

ликации), актиномицин А, ингибирующий активность цитохром С-

редуктазы.

18.2. Закономерности биосинтеза антибиотиков

Антибиотики относятся к вторичным метаболитам — низкомолеку-

лярным веществам, функции которых несущественны для роста чистых куль-

тур. Вторичные метаболиты (антибиотики, алкалоиды, гормоны роста расте-

ний, токсины) производятся представителями ограниченного числа таксоно-

мических групп. В отличие от первичных метаболитов, вторичные имеют

более сложное химическое строение и образуются, как правило, в ходе длин-

ных метаболических путей.

Известно, что образование антибиотиков делает их продуцентов более

конкурентоспособными и является мощным фактором в борьбе организмов за

существование. Однако это не единственная роль антибиотиков: недавно об-

наружено, что данные вещества осуществляют функцию контроля и регуля-

ции процессов метаболизма, выполняя роль специфических эффекторов, кон-

тролирующих активность ряда ферментных систем. Кроме этого, существует

точка зрения, согласно которой антибиотики могут служить клеточными ком-

понентами, в виде которых клетка избавляется от накопившихся в ней по тем

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

272

или иным причинам в избытке метаболитов и восстановительных эквивален-

тов.

Биосинтез большинства вторичных метаболитов, в том числе антибиоти-

ков, обычно осуществляется на определенной стадии развития микроорга-

низма, в условиях торможения основных процессов анаболизма —биосинтеза

нуклеиновых кислот, белка, липидов, полисахаридов. Различают две принци-

пиально различные стадии развития популяции продуцентов антибиотиков.

Первая, носящая название трофофаза или фаза сбалансированного роста,

характеризуется интенсивным синтезом соединений, требующихся для роста

клеток, что сопровождается быстрым потреблением основных питательных

компонентов среды. Эта фаза соответствует фазе логарифмического роста

периодической культуры микроорганизмов. После исчерпания некоторых

ингредиентов среды (в первую очередь, углерода, азота, молекулярного ки-

слорода) и накопления продуктов метаболизма наступает вторая фаза (идио-

фаза, или фаза несбалансированного роста). Идиофаза отличается заметным

торможением или прекращением роста микробной популяции, что соответст-

вует переходу в стационарную фазу роста периодической культуры. Здесь

начинают преобладать протеолитические процессы, происходит автолитиче-

ский распад клеток. Именно в идиофазе многие микроорганизмы начинают

синтезировать вторичные метаболиты, к числу которых относятся и антибио-

тики. Описанные закономерности можно отобразить графически (рис. 18.3).

Рис. 18.3. Динамика биохимических изменений в культуре продуцента ан-

тибиотика: 1 — рост культуры; 2 — накопление антибиотика; 3 —

использование углеводов; 4 — использование фосфора в составе

минеральных соединений

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

273

В большинстве случаев максимум накопления антибиотика в культураль-

ной жидкости наступает после максимума накопления биомассы. Это объяс-

няется тем, что синтез ферментов, ответственных за образование антибиоти-

ков, подавлен (репрессирован) во время трофофазы.

Биосинтез антибиотиков — наследственно закрепленное свойство орга-

низмов. Гены, ответственные за эти процессы, могут располагаться на хромо-

сомах (нуклеоидах у прокариот), а также на плазмидах.

Регуляция процесса синтеза антибиотика осуществляется разными спосо-

бами: чаще в ходе катаболитной репрессии, с помощью репрессии синтеза

ферментов конечным продуктом, а также при аллостерическом ингибирова-

нии антибиотиком активности ключевых ферментов своего биосинтеза. При

этом важными компонентами среды, оказывающими влияние на биосинтез

антибиотиков, являются глюкоза, а также фосфат. Как правило, избыток этих

веществ отрицательно сказывается на образовании антибиотиков.

Антибиотическая продуктивность организма отражает количество анти-

биотика (в мкг или в единицах), образованное единицей массы (обычно 1 мг)

сухих клеток микроорганизма-продуцента в единицу времени (обычно за 1 ч).

Этот параметр зависит, в первую очередь, от вида микроорганизма, фазы

роста клеток, состава среды, условий культивирования. Препараты антибио-

тиков характеризуются разной степенью чистоты и, соответственно, активно-

сти, которая выражается в количестве единиц антибиотической активности

(ЕД), содержащихся в 1 мг или 1 мл препарата. За единицу антибиотической

активности принимают минимальное количество чистого вещества антибио-

тика, способное подавить развитие определенного числа клеток стандартного

штамма микроорганизма (тест-микроба) в единице объема культуральной

жидкости. Например, 1 ЕД стрептомицина эквивалентна 1 мкг чистого осно-

вания этого вещества, 1 ЕД пенициллина соответствует 0,6 мкг натриевой

соли бензилпенициллина. При этом в качестве тест-микроба для стрептоми-

цина используется E.coli, а для пенициллина — Staphylococcus aureus.

18.3. Механизмы устойчивости микроорганизмов к антибиотикам

Уже отмечалось, что антибиотики проявляют избирательность действия,

оказывая эффект только на определенные группы микроорганизмов (чувстви-

тельные к данному антибиотику), не затрагивая другие (устойчивые или ре-

зистентные). Однако в популяциях чувствительных к тому или иному анти-

биотику микроорганизмов всегда можно обнаружить определенное количест-

во антибиотикорезистентных форм, которые возникают в результате мутаций

или генетического обмена. Устойчивость к антибиотикам может быть обу-

словлена следующими основными факторами:

1) превращением активных форм антибиотиков в неактивные под дейст-

вием специфических ферментов. Например, пенициллины и цефалоспорины

расщепляются ферментами b-лактамазами, хлорамфеникол подвергается

ацетилированию, в результате чего утрачивает активность;

2) модификацией чувствительной к данному антибиотику мишени. На-

пример, аминокислотная замена в белке S12 в составе 30S-субъеди-ницы ри-

босомы приводит к неспособности стрептомицина связываться с ней и блоки-

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

274

ровать инициацию трансляции; изменение структуры ДНК-зависимой РНК-

полимеразы прокариот делает их устойчивыми к рифамицину; метилирова-

ние 23S-рибосомальной РНК в 50S-субъединице рибосомы делает синтез бел-

ка нечувствительным к эритромицину и линкомицину и т. д.;

3) утратой или снижением проницаемости мембран и клеточных стенок к

антибиотикам. Так, в результате синтеза белков, влияющих на транспорт в

клетку тетрациклинов, происходит снижение внутриклеточной концентрации

этих антибиотиков;

4) использованием альтернативного фермента или метаболического пути

взамен инактивированных антибиотиком;

5) увеличением содержания фермента, подверженного ингибированию

антибиотиком;

6) повышением концентрации метаболита, способного противодейство-

вать антибиотику;

7) снижением потребности в продукте, образование которого находится

под контролем антибиотика.

Важно отметить, что механизмы устойчивости к антибиотикам, детерми-

нируемые плазмидными генами (в составе R-факторов), часто отличаются от

контролируемых хромосомальными генами механизмов устойчивости к тем

же препаратам. Так, клетки, наследующие R-плазми-ды, в большинстве слу-

чаев проявляют устойчивость к стрептомицину и другим аминогликозидным

антибиотикам за счет специфических ферментов, инактивирующих молекулы

антибиотиков. В частности, устойчивость к стрептомицину в данном случае

является следствием модификации не мишени его действия (30S-субъединица

рибосомы), а самого антибиотика путем его аденилирования или фосфорили-

рования.

Изучение R-плазмид позволяет сделать вывод об их быстрой эволюции в

направлении увеличения числа детерминант резистентности. В результате

этого явления возникают плазмиды, контролирующие полирезистентность

(устойчивость к трем, четырем и более антибиотикам). Причиной этого мо-

жет служить миграция транспозонов лекарственной устойчивости в популя-

циях клинических штаммов бактерий, которая, в свою очередь, обусловлена

широким применением самых распространенных лекарственных препаратов.

Транспозоны лекарственной устойчивости также могут содержать несколько

детерминант резистентности, как, например, Tn 1696, контролирующий ус-

тойчивость к стрептомицину, хлорамфениколу, гентамицину, сульфанилами-

ду, а также к ионам ртути.

Штаммы микроорганизмов — суперпродуценты антибиотиков в боль-

шинстве случаев обладают несколькими системами защиты от собственного

антибиотика.

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

275

Глава 19. ИНТЕГРАЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА

Каждый момент в метаболизирующей клетке осуществляется несколько

сотен химических реакций, и можно утверждать, что все они, так или иначе,

взаимосвязаны между собой. Это становится возможным благодаря тесной

интеграции клеточного метаболизма и его многоуровневой регуляции. Об

интеграции конструктивного и энергетического метаболизма частично уже

говорилось в главе 8, здесь речь пойдет о ключевых промежуточных мета-

болитах — веществах, с помощью которых клетке удается координировать

процессы обмена органических соединений различных классов.

На рис. 19.1 представлена упрощенная схема интеграции основных мета-

болических путей, общих для большинства клеток и организмов. Можно ви-

деть, что процессы разложения и биосинтеза сложных органических соедине-

ний (белков, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов) связаны между собой,

в первую очередь, благодаря пирувату, ацетил-СоА и промежуточным соеди-

нениям цикла трикарбоновых кислот.

Основными ключевыми метаболитами являются: пируват, ацетил-СоА,

оксалоацетат, a-кетоглутарат. Рассмотрим их роль в клеточном метаболизме.

19.1. Роль ключевых промежуточных соединений

в интеграции метаболизма

Пируват. Эта трехуглеродная a-кетокислота связывает между собой гли-

колиз и глюконеогенез, а также обмен углеводов с обменом липидов, белков,

изопреноидов, кетоновых тел (рис. 19.1).

Пируват образуется в клетках в основном при катаболизме гексоз, при

окислении лактата, который накапливается в мышцах при молочном броже-

нии, а также при дезаминировании аланина. Процессы катаболизма гексоз

охарактеризованы в главе 9. Молочнокислое брожение —основной метаболи-

ческий процесс (глава 10), протекающий в клетках активно работающих

мышц человека и животных при недостаточном снабжении их кислородом.

При этом образование лактата позволяет организму быстро регенерировать

NAD

, необходимый для запасания АТР в гликолизе (процесс сокращения и

расслабления мышечных волокон требует гидролиза АТР).

Накапливающийся в мышцах лактат поступает в кровь и переносится в

печень, где окисляется снова в пируват. В ходе глюконеогенеза пируват мо-

жет превращаться в глюкозу. Эта последовательность реакций известна как

цикл Кори.

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

276

Пируват

Белки

Аминокислоты

Нуклеиновые

кислоты

Нуклеотиды

Азотистые

основания

Углеводы

Глюкоза

Липиды

Жирные

кислоты

Глицерол

Мочевина

ЦТК

Рибозо-5- Р

Ацетил-СоА

Рис. 19.1. Взаимосвязь основных клеточных процессов (упрощенная

схема): 1 — гликолиз; 2 — пентозофосфатные пути; 3 —

глюконеогенез; 4 — цикл Кальвина; 5 — b-окисление жирных кислот;

6 — дезаминирование; 7 — аминирование кетокислот; 8 —

цикл мочевины; ЦТК — цикл трикарбоновых кислот

Аланин образуется из пирувата в реакциях трансаминирования (рис. 16.8)

с участием аминокислот, образованных в ходе протеолиза белков. Аланин с

током крови поступает в печень, где снова превращается в пируват, выполняя

роль переносчика аммонийного азота, который в печени включается в цикл

мочевины. Кроме этого, образующийся из пирувата аланин может включать-

ся в состав пептидов.

Превращения пировиноградной кислоты (рис. 19.2) связаны также с реак-

циями карбоксилирования и декарбоксилирования. В первом процессе, иду-

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

277

щем в митохондриях, образуется оксалоацетат, который может включаться в

ЦТК (одна из важнейших анаплеротических реакций) либо преобразовывать-

ся в фосфоенолпируват, а затем — в глюкозу (глюконеогенез).

Во втором случае пируват подвергается окислительному декарбоксилиро-

ванию с образованием ацетил-СоА, который также является ключевым мета-

болитом.

Еще одной важной частью превращений пирувата являются различного рода

брожения, в которых пировиноградная кислота служит субстратом.

Ацетил-СоА. Основными источниками этого ключевого промежуточного

соединения служат пируват и жирные кислоты (процессы окислительного

декарбоксилирования и b-окисления соответственно). Кроме этого, ацетил-

СоА образуется из кетогенных аминокислот при расщеплении их углеродных

скелетов.

Судьба ацетил-СоА, как и других ключевых метаболитов, зависит от по-

требностей клетки (организма): он может быть полностью окислен в цикле

трикарбоновых кислот, являясь его субстратом; может подвергаться последо-

вательному конденсированию с образованием 3-гидрокси-3-метил-глутарил-

СоА — предшественника холестерола, терпеновых со-

Пируват

Лактат

Аланин

Глюкоза

Оксалоацетат

Полисахариды

Ацетил СоА

Жирные

кислоты

ЦТК

Липиды

Холестерол

Кетоновые

тела

Изопреноиды

Аминокислоты

(кроме ala)

Аминокислоты

Белок

3-Гидрокси-3-метил-

глутарил-СоА

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

278

Рис. 19.2. Основные превращения пирувата и ацетил-СоА

в клеточном метаболизме

единений (изопреноидов), кетоновых тел (ацетоуксусная, 3-гидрокси-

масляная кислоты и ацетон); а также может превращаться в жирные кислоты

(рис. 19.2). Уже отмечалось, что в организме млекопитающих ацетил-СоА не

способен превращаться в углеводы. В то же время в клетках растений и мик-

роорганизмов возможен синтез предшественников глюконеогенеза, а значит,

и углеводов из ацетил-СоА (рис. 11.7).

Кроме перечисленных реакций, ацетил-СоА принимает участие в процес-

сах синтеза аминокислот, в частности аргинина, лейцина, лизина (в клетках

грибов), цистеина (у некоторых микроорганизмов), а также является субстра-

том для маслянокислого и ацетонобутилового брожения.

Участие основных промежуточных соединений ЦТК (оксалоацетата, a-

кетоглутарата) в интеграции метаболизма нетрудно проследить на схемах,

представленных на рис. 19.1 и 19.2.

Подводя итог сказанному, следует еще раз подчеркнуть, что все метабо-

лические процессы, протекающие в клетке (организме), связаны между собой

с помощью промежуточных метаболитов, которые являются продуктами од-

них метаболических путей и субстратами других. Такая взаимосвязь и взаи-

мозависимость метаболических процессов позволяет клетке (организму) ко-

ординировать свои возможности с потребностями и быстро «настраивать»

уровень обмена веществ в соответствии с меняющимися условиями сущест-

вования. Конечно, этот тонкий механизм был бы невозможен без регуляции

метаболических путей.

19.2. Регуляция метаболизма

Химические реакции, протекающие в клетках, катализируются фермен-

тами. Неудивительно поэтому, что большинство способов регуляции обмена

веществ основано на двух ведущих процессах: изменении концентрации фер-

ментов и их активности. Эти способы регуляции метаболизма характерны для

всех клеток и осуществляются с помощью разнообразных механизмов в ответ

на сигналы разного рода. Кроме этого, клетки владеют дополнительными

способами регуляции метаболизма, многообразие которых удобно рассмот-

реть в соответствии с несколькими уровнями организации.

Регуляция на уровне транскрипции. Этот тип регуляции рассмотрен в

главе 3 на нескольких примерах положительного и отрицательного контроля

транскрипции прокариотических генов. Данный механизм характерен, в пер-

вую очередь, для регуляции количества мРНК, определяющих структуру

ферментов, а кроме этого — белков-гистонов, рибосомальных, транспортных

белков. Группа последних, не обладая каталитической активностью, также

принимает большое участие в изменении скорости соответствующих процес-

сов (формирование хромосом и рибосом, транспорт веществ через мембра-

ны), а значит, и метаболизма в целом.

В регуляции транскрипции генов участвуют регуляторные белки, структу-

ра которых определяется специфическими генами (регулято-рами), их ком-

плексы с лигандами (например, лактозой при индукции транскрипции или

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)