Журнал - Проблемы криобиологии 2010 №4

Подождите немного. Документ загружается.

содержание

Памяти Грищенко Валентина Ивановича.............................................................................................................................................

теоретическая и экспериментальная криобиология

Гулевский А.К., Релина Л.И. Нуклеирующие агенты позвоночных и беспозвоночных животных ...................................

Венцковская Е.А., Шило А.В., Бабийчук Г.А. Терморегуляция, сон и температурные воздействия .....................................

Дудецкая Г.В., Божок Г.А., Бондаренко Т.П. Влияние скорости охлаждения на сохранность зонально-дифферен-

цированных популяций клеток надпочечников крыс .....................................................................................................................

Писаренко Н.А., Шпакова Н.М. Влияние амфифильных веществ на гипертонический гемолиз эритроцитов,

модифицированных температурой 49°С ........................................................................................................................................

Горбунов Л.В. Обеспечение условия сопоставимости результатов криоконсервирования спермиев животных ...............

Кавок Н.С., Боровой И.А., Малюкина М.Ю. Влияние различных концентраций ДМСО на динамику гормон-

стимулированных изменений трансмембранных потенциалов изолированных гепатоцитов крыс при оценке методом

флуоресцентных зондов .....................................................................................................................................................................

Тодрин А.Ф., Попивненко Л.И. Теплофизические свойства криопротекторов. III. Плотность, кинематическая вязкость

и поверхностное натяжение ряда криопротекторов, их водных растворов и смесей ..........................................................

криоконсервирование биологических объектов

Петренко Ю.А., Скоробогатова Н.Г., Волкова Н.А., Петренко А.Ю. Характеристика иммунофенотипа и диффе-

ренцировочного потенциала мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека после криоконсерви-

рования ...................................................................................................................................................................................................

Богданчикова О.А., Киреев В.А., Ходько А.Т., Компаниец А.М. Криоконсервирование тромбоцитов. 2. Эффектив-

ность криоконсервантов на основе комбинаций криопротекторов при различных режимах замораживания...............

Указатель ключевых слов номеров журнала “Проблемы криобиологии” за 2010 год......................................................................

Содержание журнала “Проблемы криобиологии” за 2010 год...........................................................................................................

Правила для авторов.........................................................................................................................................................................

 Институт проблем криобиологии и криомедицины Национальной Aкадемии наук Украины

“Проблемы криобиологии”, 1985–2010

2010

Том 20

351

354

363

379

388

396

407

416

436

443

452

458

464

проблемы

криобиологии

том

2010

contents

Valentin Grischenko. In Memoriam........................................................................................................................................................

theoretical and experimental cryobiology

Gulevsky A.K., Relina L.I. Nucleating Agents of Vertebrates and Invertebrates.............................................................................

Ventskovska O.A., Shylo O.V. , Babiychuk G.O. Thermoregulation, Sleep and Temperature Influences....................................

Dudetskaya G.V. , Bozhok G.A., Bondarenko T.P. Effect of Cooling Rate on Integrity of Zone-Differentiated Adrenal Cell

Populations of Rats .....................................................................................................................................................................................

Pisarenko N.A., Shpakova N.M. Effect of Amphiphiles on Hypertonic Hemolysis of Erythrocytes, Modified with Temperature

of 49°C .....................................................................................................................................................................................................

Gorbunov L.V. Providing of Condition to Compare Animal Sperm Cryopreservation Results ..........................................................

Kavok N.S., Borovoy I.A., Malyukina M.Yu. Effect of Different DMSO Concentrations on Dynamics of Hormone-Stimulated

Changes in Transmembrane Potentials of Isolated Rat Hepatocytes During Assessment with Fluorescent Probes ....................

Todrin A.F., Popivnenko L.I. Thermophysical Properties of Cryoprotective Agents. III. Density, Kinematic Viscosity and

Surface Tension of Some Cryoprotective Agents, Their Solutions and Mixtures .............................................................................

cryopreservation of biological systems

Petrenko A.Yu., Skorobogatova N.G., Volkova N.A., Petrenko Yu.A. Characterization of Immunophenotype and Differen-

tiation Potential of Human Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells after Cryopreservation ....................................................

Bogdanchikova O.A., Kireev V.A., Khod’ko A.T., Kompaniets A.M. Platelet Cryopreservation. 2. Efficiency of Cryopreser-

vatives Based on Cryoprotectant Combinations Under Different Freezing Regimens .....................................................................

Key Word Index. Volume 20.................................................................................................................................................................

Table of Contents. Volume 20..............................................................................................................................................................

Instructions to the Authors ................................................................................................................................................................

 Τranslated from Russian by Pushkova E.N.

 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov,

“Problems of Cryobiology”, 2010

351

354

363

379

388

396

407

416

436

443

455

461

464

problems

of cryobiology

vol.

2010

351

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №4

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №4

Памяти

Грищенко

Валентина Ивановича

(1928–2011)

Мудрый человек, обладающий огромным та-

лантом, Валентин Иванович принадлежал к когор-

те ученых-энциклопедистов с неисчерпаемым за-

пасом новых идей, неистощимой энергией и рабо-

тоспособностью. Научный авторитет академика

Валентина Ивановича Грищенко был непререка-

емым, его мнение всегда было весомым, а зачас-

тую и определяющим в профессиональной среде.

Скромность, простота и искренность были харак-

терными чертами Валентина Ивановича в обще-

нии с людьми.

Валентин Иванович родился 28 ноября 1928 г.

в семье известного специалиста акушера-гинеколога

Ивана Ивановича Грищенко и врача акушера-гине-

колога Александры Федоровны Деуль. В юношес-

кие годы он увлекался автоделом, работал в госпи-

тале киномехаником. После окончания школы с

золотой медалью поступил на факультет двига-

телей внутреннего сгорания механико-машино-

строительного института (теперь Национальный

технический университет “ХПИ”).

Однако по совету отца и его ближайшего друга

зав. кафедры судебной медицины проф. Н.Н.Бока-

риуса одновременно поступил в Харьковский меди-

цинский институт. Первая же лекция по биологии ре-

шила его судьбу – всю жизнь он посвятил медицине.

Во время учебы в мединституте принимал

участие в работе научных кружков, а в кружке по

3 января 2011 г. ушел из жизни известный ученый, выдающийся клиницист,

организатор науки и педагог, директор Института проблем криобиологии

и криомедицины НАН Украины, заведующий кафедры акушерства и гинекологии № 1

Харьковского национального медицинского университета,

директор ГП «МНЦ криобиологии и криомедицины НАН, АМН и МЗ Украины»,

директор центра репродукции и генетики «Имплант»,

академик НАН Украины, доктор медицинских наук, профессор

Грищенко Валентин Иванович.

352

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №4

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №4

акушерству и гинекологии выполнил свою первую

научную работу о нервах пуповины. При ее выпол-

нении проводил часть исследований на кафедре

нормальной анатомии, где познакомился со своей

будущей женой Бровиной Нонной Николаевной.

Они прожили счастливо до самой кончины Нонны

Николаевны в мае 2003 г.

Свой профессиональный опыт как акушера-

гинеколога Валентин Иванович приобретал в среде

соратников и коллег своего отца, большую ценность

представляла библиотека отца по акушерству и

гинекологии.

По окончании института Валентин Иванович

был направлен в клиническую ординатуру по

акушерству и гинекологии Института охраны мате-

ринства и детства им. Н.К.Крупской. Его научным

руководителем был уникальный специалист проф.

Константинов В.И.; опыт в хирургии он приобрел

у практического врача доц. Шухата И.Г.

Для выполнения кандидатской диссертации

около года он работал в родильном отделении при

кафедре психоневрологии Харьковского института

усовершенствования врачей. В этом отделении

проф. Ильей Захаровичем Вельвовским и его сот-

рудниками была разработана психопрофилактичес-

кая система обезболивания родов.

По рекомендации этой кафедры Валентин Ива-

нович выступал в Англии с докладом на первом

съезде по психоматике в акушерстве и гинекологии.

По окончании ординатуры работал младшим, а

затем старшим научным сотрудником Института

ОХМД.

С 1957 г. он начал и преподавательскую дея-

тельность в Харьковском медицинском институте

(ХМИ) в качестве ассистента кафедры акушерст-

ва и гинекологии, которой руководила блестящий

специалист проф. Вера Федоровна Матвеева. На

кафедре выполнил и в 1964 г. защитил докторскую

диссертацию. С 1965 по 1983 г. работал прорек-

тором ХМИ. После ухода на пенсию В.Ф.Матвеевой

с 1968 г. заведовал кафедрой акушерства и гинеко-

логии №1 ХМИ. В этом же году на кафедре были

начаты исследования по использованию холода в

акушерско-гинекологической практике, примене-

нию криовоздействия, при хирургических опера-

циях. За эти работы Валентин Иванович был удос-

тоен Государственной премии УССР в области

науки и техники. В начале 70-х годов на кафедре

выполнялись работы по репродуктологии. Посколь-

ку результаты этих исследований широко пуб-

ликовались и были известны медицинской общест-

венности, в 1971 г. профессор Грищенко В.И. был

назначен временным советником, с 1974 г. – экс-

пертом ВОЗ по проблемам рождаемости, с 1977 по

1979 гг. – членом группы советников, а с 1980 г. –

экспертом ВОЗ по проблеме “Репродукция чело-

века”.

В качестве эксперта и временного советника

ВОЗ по планированию семьи Валентин Иванович

посещал Финляндию и Индию; для изучения воз-

можности снижения материнской смертности –

Афганистан; для оказания помощи в развитии аку-

шерства и гинекологии – Монголию; был делегатом

от СССР на заседаниях рабочих групп ВОЗ в Вене,

Стокгольме, Будапеште.

Наиболее сложной была поездка в Афганистан

в 1981 г. Несколько раз его жизнь была под угрозой.

Однажды попал в перестрелку, оказавшись на пути

моджахедов. Самый неприятный случай произо-

шел во время торжественного приема представи-

телей ООН, куда был приглашен Валентин Ивано-

вич, – на пропускном пункте подорвал себя смертник,

однако, к счастью, раньше, чем начался прием.

Известен факт, что в Монголии Валентину Ива-

новичу удалось при поддержке жены Председателя

Президиума Народного Хурала Монголии Цеден-

бала (она была русской) в Министерстве здраво-

охранения МНР ввести должность ответственного

заместителя министра по проблемам материнства

и детства.

Общение с представителями разных стран, осо-

бенно с проф. О.Е. Вязовым из Москвы, позволило

использовать в работе кафедры самые передовые

разработки в области репродуктологии. Кафедра

стала первой в СССР по изучению проблемы им-

мунологического бесплодия.

Для лечения этой формы бесплодия часто при-

ходилось прибегать к внутриматочной инсеминации

спермой мужа. При мужском бесплодии иногда

была необходима инсеминация спермой донора.

Так было начато применение вспомогательных

репродуктивных технологий в нашей стране, а

Харьков стал лидером в решении этой проблемы.

В 1978 г. в Англии родился первый ребенок “из

пробирки”. Валентин Иванович очень хотел внед-

рить такие технологии и в нашей стране. Однако

не было опыта, аппаратуры, реактивов, которые

можно было приобрести только за границей за ва-

люту. У медицинского института этих возмож-

ностей не было, и именно в этот момент в 1983 г.

президент АН Украины Б.Е. Патон предложил Ва-

лентину Ивановичу должность директора Инсти-

тута проблем криобиологии и криомедицины. Ака-

демия наук располагала небольшим количеством

валюты, что открывало перспективы развития у

нас этого современного направления.

Валентин Иванович видел в этом реальную воз-

можность решения проблемы экстракорпорального

оплодотворения, при котором нередко используется

криоконсервирование сперматозоидов или эмбрио-

353

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №4

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №4

нов. Благодаря исследованиям, проведенным под его

руководством, впервые в Украине в 1991 г. родилась

девочка, зачатие которой произошло in vitro.

Уже в ХХ столетии подсадки живых эмбриофе-

тальных тканей начали использовать в процессе

лечения. Развитие этого направления науки сдер-

живалось определенной опасностью подобных

трансплантаций, связанных с возможностью пере-

носа инфекционных агентов от донора к реципиен-

ту. Необходимость проведения контроля, выполня-

емого несколько дней, в течение которых препарат

мог погибнуть, потребовала решения проблемы

криоконсервирования клеток и тканей. В институте

были разработаны методы криоконсервирования

широкого аспекта клеток и тканей. Оказалось, что

разные виды этого материала требовали и различ-

ной биотехнологии замораживания и оттаивания.

Усиленная работа в этом направлении позволила

создать около 40 препаратов эмбриофетоплацен-

тарного комплекса, в основном человека, абсолю-

тное большинство из них в настоящее время

хранятся в криобанке для научно-исследователь-

ских и прикладных целей.

По инициативе Валентина Ивановича было соз-

дано ГП “Межведомственный научный центр крио-

биологии и криомедицины НАН, АМН, МЗ Украи-

ны”, задачей которого являлось внедрение научных

разработок института в медицинскую практику.

Разработанное под руководством Валентина

Ивановича Грищенко направление клеточной и тка-

невой терапии препаратами эмбриофетоплацен-

тарного комплекса с успехом применяется при раз-

личных видах патологии: болезни крови, сахарный

диабет, болезни печени, нервной системы, ослож-

нения беременности и гинекологические заболе-

вания, офтальмологическая патология и др. За эти

работы в 2002 г. группа ученых, включая ученых

из ИПКиК НАН Украины, получила Государст-

венную премию Украины в области науки и

техники.

До последних дней академик Валентин Ивано-

вич Грищенко руководил широкомасштабными

исследованиями клинической эффективности при-

менения препаратов. В институте из стволовых

клеток костного мозга пациентов получены нерв-

ные клетки, клетки поджелудочной железы. В

результате проведения первых клинических наблю-

дений выявлен благоприятный эффект у больных

с патологией нервной системы и сахарным диа-

бетом.

Уд а л о с ь получить очень хорошие результаты

как при лечении многих заболеваний, так и для

улучшения общего состояния, повышения качест-

ва жизни практически здоровых людей, а также в

случаях женского и мужского бесплодия.

Валентин Иванович Грищенко был одним из

основателей научного направления “биология и ме-

дицина стволовых клеток”. На кафедре ЮНЕСКО

по криобиологии, основателем и руководителем ко-

торой он был, сформирована и успешно выпол-

няется программа по разработке методов выде-

ления и криоконсервирования клеток и тканей,

содержащих стволовые клетки и их производные.

Под руководством Валентина Ивановича были

созданы, сертифицированы и используются в кли-

нике криоконсервированные препараты плаценты.

Особого внимания заслуживает разработка пре-

паратов нового класса, созданных из клеток взрос-

лого организма пациента и культивированных,

которые могут применяться для этого же пациента

в ортопедической практике, при лечении тяжелых

ран, ожогов, неврологической патологии и в косме-

тической медицине.

В 1979 г. Валентина Ивановича Грищенко изб-

рали членом-корреспондентом, в 1988 г. – акаде-

миком АН Украины.

Валентин Иванович был председателем Украин-

ского научного общества криобиологов и криоме-

диков, вице-председателем Ассоциации акушеров-

гинекологов, почетным Председателем общества

репродуктологов Украины, членом Всемирного об-

щества криобиологов, почетным членом Индий-

ского общества криогенетики, главным редактором

журнала “Проблемы криобиологии”, зам. главного

редактора “Международного медицинского журна-

ла”, членом редколлегии журналов “Cryobiology”,

«CryoLetters”, “Сell Preservation Technology”, “Аку-

шерство и гинекология”. Он подготовил 35 докторов

и 119 кандидатов медицинских и биологических

наук. Являлся автором более 1000 научных работ,

21 монографии и 6 учебников, 143 патентов и автор-

ских свидетельств на изобретения.

Награжден многими орденами и медалями, был

Заслуженным деятелем науки и техники, Лауреа-

том Государственных премий в области науки и

техники УССР, СССР и Украины, премий НАН Ук-

раины имени А.А. Богомольца, АМН СССР име-

ни В.Ф.Снегирева.

Валентин Иванович навсегда останется в памя-

ти народной как выдающийся специалист в облас-

ти акушерства и гинекологии, инициатор создания

в Украине службы экстракорпорального оплодот-

ворения.

Династию врачей Грищенко в Харькове продол-

жают его дочь Ольга Валентиновна, внуки Николай

и Валентин.

Сотрудники Института проблем криобиологии

и криомедицины и редколлегия журнала “Проб-

лемы криобиологии” выражают глубокое сочувст-

вие семье и близким покойного. Светлая память о

Валентине Ивановиче навсегда сохранится в на-

ших сердцах.

354

* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:

ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+380

57) 373-41-35, факс: +38 (057) 373-30-84, электронная почта:

lianaisaakovna@rambler.ru

* To whom correspondence should be addressed: 23,

Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373

4135, fax: +380 57 373 3084, e-mail: lianaisaakovna@rambler.ru

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-

tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine

Институт проблем криобиологии и криомедицины

НАН Украины, г. Харьков

УДК 577.112:591.54

А.К. ГУЛЕВСКИЙ, Л.И. РЕЛИНА*

Нуклеирующие агенты позвоночных и беспозвоночных животных

UDC 577.112:591.54

A.K. GULEVSKY, L.I. RELINA*

Nucleating Agents of Vertebrates and Invertebrates

В обзоре представлены сведения о структуре и активности нуклеирующих агентов беспозвоночных и позвоночных. Дано

сравнительное описание нуклеаторов животных и нуклеаторов бактериального происхождения.

Ключевые слова: белки-нуклеаторы, устойчивость к замерзанию, насекомые, тихоходки, амфибии, рептилии.

В обзорі подано відомості щодо структури та активності нуклеюючих агентів безхребетних та хребетних. Подано

порівняльний опис нуклеаторів тварин та нуклеаторів бактеріального походження.

Ключові слова: білки-нуклеатори, стійкість до замерзання, комахи, тихохідки, амфібії, рептилії.

The information on invertebrate and vertebrate nucleating agent structure and activity is presented in the review. The data on

animals' nucleators are compared with those of nucleators of bacterial origin.

Key words: ice nucleating proteins, freeze-tolerance, insects, tardigrades, amphibia, reptiles.

problems

cryobiology

Vol. 20, 2010, №4

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №4

Замерзание жидкости начинается с образова-

ния ядра – нуклеуса (от лат. nucleus), который

имеет льдоподобную структуру. Этап инициации

замерзания жидкости называется нуклеацией –

физический процесс, отличающийся от катализа

и являющийся весьма необычной функцией для

белков [43]. Способность инициировать формиро-

вание кристаллов льда в переохлажденной воде

присуща ряду психро- и мезофильных бактерий

[13]. Установлено, что нуклеирующие агенты

бактериального происхождения являются липо-

гликопротеидными комплексами, которые принято

называть белками-нуклеаторами (БН) [32]. Впос-

ледствии БН были обнаружены у устойчивых к

замерзанию насекомых [10, 11, 23, 40, 42, 43],

тихоходок [36] и моллюсков [1, 2, 14]. Имеются

также сведения о наличии нуклеаторов белковой

природы в плазме устойчивых к замерзанию поз-

воночных – древесных лягушек Rana sylvatica

[28] и черепах [29].

При этом организме многих избегающих за-

мерзания животных содержатся белки с нуклеи-

рующей активностью, которые в зимний период

животным приходится либо маскировать, либо от

них избавляться [9, 22].

Не все устойчивые к замерзанию животные

способны продуцировать БН. Антарктическая не-

матода Panagrolaimus davidi может выживать

при внутриклеточном кристаллообразовании и

превращении в лед почти 82% содержащейся в

теле воды и зависит от инокулятивного ("приви-

вочного" или "заражающего") замерзания, при

Freezing of liquid begins with formation of nuc-

leus with ice-like structure. Initiation stage of liquid

freezing is called nucleation, a physical process, dif-

fering from catalysis and being extremely unusual

function for proteins [43]. The capacity of initiating

ice crystallization in supercooled water is inherent to

some psycho- and mesophilic bacteria [13]. It has

been established that nucleating agents of bacterial

origin are lipoglycoprotein complexes, commonly cal-

led as ice-nucleating proteins (INPs) [32]. There-

after INPs were observed in freeze-tolerant insects

[10, 11, 23, 40, 42, 43], tardigrades [36] and molluscs

[1, 2, 14]. There are also the data about the presence

of protein origin nucleators in plasma of freeze-

tolerant invertebrates the wooden frog Rana sylva-

tica [28] and turtles [29].

Herewith in many freeze-avoiding animals there

are proteins with nucleating activity, which animals

either have to mask or eliminate in winter [9, 22].

Not all freeze-tolerant animals can produce INPs.

The Antarctic nematode Panagrolaimus davidi can

survive intercellular crystallization and transformation

of nearly 82% of body water into ice and depends

on inoculative (‘contaminating’) freezing wherein

crystallization is initiated with environmental ice [37].

INPs of invertebrates

The nucleators were found in haemolymph of hy-

menoptera, coleoptera and diptera [40]. In many

freeze-tolerant insects nucleators are present only in

winter, for example in the tenebrionid beetle Eleodes

blanchardi [42]. In summer haemolymph nucleators

355

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №4

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №4

котором кристаллизация инициируется льдом

окружающей среды [37].

БН беспозвоночных

Нуклеаторы обнаружены в гемолимфе у

жестко-, перепончато- и двукрылых [40]. У боль-

шинства устойчивых к замерзанию насекомых

нуклеаторы присутствуют только зимой, напри-

мер у чернотелки Eleodes blanchardi [42]. Летом

нуклеаторы в гемолимфе отсутствуют, следова-

тельно, переохлаждение жидкостей в теле насе-

комых более глубокое, поэтому они чувствитель-

ны к замерзанию. При наличии высокоактивных

нуклеаторов гемолимфы менее эффективные ки-

шечные и внутриклеточные нуклеаторы могут не

инактивироваться и не удаляться в зимний период,

при этом насекомые выдерживают неоднократные

циклы замораживания-оттаивания [41]. В услови-

ях обитания с флуктуациями субнулевых темпе-

ратур в течение суток летом, когда насекомые

должны питаться, развиваться и размножаться,

риск "ночного" замерзания под действием ки-

шечных нуклеаторов предотвращается более

эффективными нуклеаторами гемолимфы на про-

тяжении всего года, например у Phyllodecta lati-

collis [34], Seneciobius kenyanus и Pyrasystotes

elongatus [27].

При температурах выше 80°С нуклеаторы

гемолимфы E. blanchardi [42] и Vespula macu-

lata инактивируются [11]. Поскольку обработка

протеазами приводила к инактивации нуклеатора

V. maculata, авторы [10] пришли к выводу о его

белковой природе. Молекулярная масса этого

белка 74 кДа, он содержит 20% остатков глутама-

та, который, вероятно, позволяет ему упорядочи-

вать молекулы воды в кристаллоподобные струк-

туры.

Выделенный из гемолимфы личинок комара

долгоножки Tipula trivitata БН имеет молекуляр-

ную массу 800 кДа [23]. Он состоит из двух бел-

ковых компонентов с молекулярной массой 80 и

265 кДа, а также липидного компонента, содержа-

щего фосфатидилинозитол. У T. trivitata БН име-

ет повторяющуюся последовательность из 16

аминокислотных остатков, замещение которых

другими аминокислотами приводило к потере ну-

клеирующей активности. Поскольку наличие пов-

торов также является отличительной чертой пер-

вичных последовательностей БН бактерий, мож-

но предположить, что повторяющиеся мотивы –

необходимое условие проявления нуклеирующей

активности. Возможно, именно наличие повторов

обуславливает сворачивание молекул БН в кон-

формацию, обеспечивающую взаимодействие с

молекулами воды. Фосфатидилинозитол состав-

are absent, therefore liquid supercooling in insects'

body is deeper, therefore they are sensitive to freez-

ing. In the presence of highly active nucleators of

haemolymph less effective intestinal and intracellular

nucleators may be not inactivated and are not remo-

ved in winter time, herewith insects survive multiple

cycles of freeze-thawing [41]. Under environmental

conditions with fluctuations of subzero temperatures

during a day in summer, when insects must feed,

grow and reproduce, the risk of "night" freezing due

to action of intestinal nucleators is prevented by mo-

re effective nucleators of haemolymph over the year,

e. g. in Phyllodecta laticollis [34], Seneciobius

kenyanus and Pyrasystotes elongatus [27].

Haemolymph nucleators of E. blanchardi [42]

and Vespula maculata are inactivated under the tem-

peratures above 80°C [11]. Whereas the treatment

with proteases resulted in inactivation of V. maculata

nucleator, the authors [10] concluded about its protein

nature. The molecular mass of this protein makes

74 kDa and it comprises 20% of glutamate residues,

which probably enables the ordering of water mole-

cules into crystal-like structures.

The molecular mass of an INP derived from

haemolymph of the meadow maggot Tipula trivitata

is 800 kDa [23]. It consists of two protein compo-

nents with 80 and 265 kDa molecular mass, and also

lipid component, containing phosphatidyl inositol. In

T. trivitata INP has a repeating sequence from 16

amino-acid residues, the replacement of which by

others amino-acids resulted into a loss of nucleating

activity. Since the presence of repeats is also a disti-

nctive feature of primary sequences of bacterial

INPs it may be suggested that repeating motifs are

the essential condition for nucleating activity mani-

festation. Probably just the presence of the repeats

stipulates the folding of INP molecules in conforma-

tion, providing interaction with water molecules.

Phosphatidyl inositol makes nearly 11% of total con-

tent of phospholipids. The analysis carried-out with

different phospholipases showed that phosphatidyl

inositol was necessary for manifestation of nuclea-

ting activity. According to Warner D.T. the capacity

of inositol to make the ordering of water into ice-

like structures was noted [35], however according

to Duman J.G. et al. it is necessary for the formation

of huge INPs aggregates [12]. The importance of

phosphatidyl inositol for manifestation of nucleating

activity in bacteria, where it performs the "anchor"

function in attaching the INPs to cell membrane was

established [15]. Neither apolipoprotein, nor lipid

component by themselves have a nucleating activity

[23]. The results of experiments, carried-out in the

designed proteoliposomes of different composition

confirm that for manifestation of T. trivitata INP

356

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №4

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №4

ляет примерно 11% от общего содержания фосфо-

липидов. Анализ, проведенный с помощью различ-

ных фосфолипаз, показал, что фосфатидилинози-

тол необходим для проявления нуклеирующей

активности. Warner D.T. отмечал способность

инозитола упорядочивать воду в льдоподобные

структуры [35]. Однако по мнению Duman J.G.

et al. фосфатидилинозитол необходим для образо-

вания крупных агрегатов БН [12]. Важность фос-

фатидилинозитола для проявления нуклеирующей

активности бактерий, у которых он выполняет

функцию "якоря" в прикреплении БН к клеточной

мембране, доказана [15]. Сами по себе ни аполи-

попротеин, ни липидный компонент не обладают

нуклеирующей активностью [23]. Результаты экс-

периментов, проведенных на сконструированных

протеолипосомах различного состава, подтверж-

дают, что для проявления нуклеирующей актив-

ности БН T. trivitata необходимо наличие белко-

вой и липидной частей.

Липопротеин-нуклеатор T. trivitata является

основным липопротеином гемолимфы и состав-

ляет более 95% от общего содержания липопро-

теинов [23]. В целом его состав сходен с соста-

вом других липопротеидов насекомых [5, 25]. Он

также имеет глобулярную структуру, как и охарак-

теризованные ранее липопротеины [5, 6, 20, 24].

Известно, что такие липопротеиды выполняют

функцию липофоринов. Возможно, что БН T. trivi-

tata, помимо функции инициации кристаллизации,

участвует в транспорте липидов [23]. Несмотря

на отличия в составе БН T. trivitata и липофори-

нов (отсутствие фосфатидилинозитола и более

высокая удельная доля белкового компонента в

составе липофоринов [5, 25]), липофорины воз-

можно были "предками" БН насекомых, посколь-

ку транспортная функция скорее всего предшест-

вовала нуклеаторной и была присуща липофори-

нам древних насекомых, обитавших в тропиках.

Липопротеиды из гемолимфы личинок табачного

бражника Manduca sexta и имаго таракана Peri-

planeta нуклеирующей активностью не обладают

[23]. Однако липопротеиды с нуклеирующей ак-

тивностью обнаружены у чувствительных к за-

мерзанию видов насекомых [38]. Поскольку у та-

ких насекомых естественный отбор должен был

происходить в направлении элиминации активных

нуклеаторов льда, возникает вопрос: почему

неактивный в отношении нуклеации липофорин не

является общераспространенной и основной фор-

мой? Вероятно, инактивированные формы липо-

протеида, которые можно получить у насекомых

с помощью ювенильного гормона, лишены каких-

либо компонентов, важных для транспортной

функции липопротеидов, следовательно, эволю-

nucleating activity both protein and lipid parts are

necessary.

T. trivitata lipoprotein nucleator is the main lipo-

protein of haemolymph and makes above 95% of

lipoproteins' total content [23]. On the whole its

composition is similar to other lipoproteins of insects

[5, 25]. It also has a globular structure as described

above lipoproteins [5, 6, 20, 24]. It has been known

that these lipoproteins perform function of lipopho-

rines. Maybe T. trivitata INP in addition to crystal-

lization initiation function takes part in lipid transport

[23]. In spite of the differences in composition of

T. trivitata INP and lipophorines (the absence of

phosphatidyl inositol and higher specific part of pro-

tein component in composition of lipophorines [5,

25]), the latter were likely ‘progenitors’ of insects'

INPs, whereas transport function most likely prece-

ded nucleating one and was characteristic for lipo-

phorines of ancient insects inhabiting in the tropics.

Lipoproteins from haemolymph of the tobacco horn-

worm Manduca sexta and the cockroach imago Pe-

riplaneta express no nucleating activity [23].

However lipoproteins with nucleating activity were

observed in freeze sensitive insect species [38].

Whereas in these insects the natural selection must

take place towards elimination of active ice-nuclea-

tors, the question arises: why non-active in respect

of nucleation lipophorine is not a common and basic

form? Probably inactivated forms of lipoproteins,

which may be derived from insects with juvenile hor-

mones, were deficient of some components impor-

tant for a transport function of lipoproteins and there-

fore the evolution impact could not fully eliminate

nucleating activity. Seasonal and maybe hormonally

regulated ‘elimination’ of nucleating activity of these

lipoproteids during hypometabolic state takes place

[26].

In contrary to bacterial INPs, INPs of insects

were not attached to membranes. However they are

also capable of aggregation, forming long chains,

free-floating in haemolymph as well as single INPs

[39]. Quite a high temperature of nucleation (–4°C),

demonstrated by insects INPs was stipulated by the

formation of aggregates with molecular mass up to

6,000 kDa [43]. For the formation of chains from

INP-monomers phosphatidyl inositol is seemingly

necessary [12]. The presence of plateau in the cur-

ve of nucleating activity dependence on concentra-

tion of insects' INPs points to the fact that these ag-

gregates achieve the fixed size and do not grow any

more as their concentration increases (Figure).

Some insects nucleators are of non-protein, but

mineral nature. For example, freeze-tolerant larvae

of the gall fly Eurosta solidaginis have spherules

of calcium phosphate in Malpighian tubules, which

357

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №4

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №4

ционное давление не могло элиминировать нук-

леирующую активность полностью. Происходит

только сезонное, возможно регулируемое гормо-

нально, "выключение" нуклеирующей активности

таких липопротеидов во время гипометаболи-

ческого состояния [26].

В отличие от БН бактерий, БН насекомых не

прикреплены к мембранам. Однако они также

способны к агрегации, образуя длинные цепочки,

свободно плавающие в гемолимфе, как и одиноч-

ные БН [39]. Достаточно высокая температура

нуклеации (–4°С), которую демонстрируют БН

насекомых, обусловлена формированием агрега-

тов с молекулярной массой до 6000 кДа [43]. Для

формирования цепочек из БН-мономеров, по-

видимому, необходим фосфатидилинозитол [12].

Наличие плато на кривой зависимости нуклеирую-

щей активности от концентрации БН насекомых

указывает на то, что эти агрегаты достигают оп-

ределенного размера и при повышении концентра-

ции далее не растут (рисунок).

Некоторые насекомые обладают нуклеато-

рами не белковой, а минеральной природы. На-

пример, устойчивые к замерзанию личинки галло-

вой мухи Eurosta solidaginis имеют в мальпигие-

вых трубочках сферулы из фосфата кальция,

которые способны инициировать кристаллизацию

почти при –10°С, что совпадает с температурой

замерзания личинок (–9,5°С) и весьма сильно от-

личается от температуры замерзания гемолимфы

(–18°С) [21].

Высокая температура кристаллизации интакт-

ных тихоходок Adorybiotus coronifera подтвер-

ждает присутствие в жидкостях тела нуклеирую-

щих агентов, которые инактивируются при тем-

пературе выше 68°С, что свидетельствует об их

белковой природе. Гель-фильтрация гомогенатов,

полученных из A. сoronifera, указывает на то, что

молекулярная масса нуклеирующих агентов

тихоходок должна быть выше 200 кДа [36].

Костянка обыкновенная Lithobius forficatus

устойчива к замерзанию в зимний период.

Tursman D. et al. [33] предположили присутствие

нуклеаторов в организме L. forficatus зимой,

однако их природа не описана. Не исключено, что

устойчивость к замерзанию у L. forficatus все же

зависит от инокулятивного замерзания. Если же

в организме этой многоножки и присутствуют

нуклеирующие агенты, возможно, что они "слу-

чайные", т. е. выполняют иные функции, а нуклеи-

рующая активность является лишь побочным

эффектом [19].

В гемолимфе устойчивого к замерзанию лито-

рального моллюска Melampus bidentatus в зим-

ний период обнаружен высокомолекулярный (бо-

Температура нуклеации серийно разведенных образцов

гемолимфы устойчивых к замерзанию жуков E. blan-

chardi [42]. Рядом с маркером 1указан фактор разведе-

ния гемолимфы.

Nucleation temperature of serially diluted samples of

E. blanchardi freeze-tolerant beetles haemolymph [42].

Near the 1 marker the haemolymph dilution factor is noted.

100000

10000

1000

100

-20

-15

-10

-5

Температура нуклеации, °С

Nucleation temperature, °C

capable to initiate the crystallization near –10°C, that

the same as freezing temperature of larvae (–9,5°C)

and rather strongly differs from haemolymph freez-

ing temperature (–18°C) [21].

High crystallization temperature of the intact tar-

digrade Adorybiotus coronifera confirms the pre-

sence in body liquids the nucleating agents, inacti-

vated at the temperature above 68°C, that testifies

about their protein nature. Gel chromatography of

homogenates derived from A. coronifera shows

that molecular mass of nucleating agents of tardigra-

des should be above 200 kDa [36].

The common drupe Lithobius forficatus is free-

ze-tolerant in winter. Tursman D. et al. [33] sugges-

ted the presence of nucleators in the organism of

L. forticatus in winter, however their nature has not

been described. It can not be ruled out that tolerance

to freezing in L. forticatus nevertheless depends on

inoculative freezing. But if in the organism of this

centipede the nucleating agents are present, probably

they are ‘random’, i. e. perform other functions, and

nucleating activity is only a side effect [19].

In haemolymph of the freeze-tolerant littoral mol-

lusc Melampus bidentatus in winter time a high-mo-

lecular (above 3,500 kDa) thermo-sensitive nucleat-

ing agent was observed [14], however its nucleating

activity was low-sensitive to protease action. If mol-

luscs' nucleators are lipoglicoproteins, similar to bac-

terial nucleators [32], probably carbohydrate and/or

lipid parts of complex screen the cleavage sites for

358

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №4

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №4

лее 3500 кДа) термочувствительный нуклеирую-

щий агент [14], однако его нуклеирующая актив-

ность малочувствительна к действию протеазы.

Если нуклеаторы моллюсков являются липоглико-

протеинами, подобно бактериальным нуклеато-

рам [32], то возможно углеводная и/или липидная

части комплекса экранируют сайты расщепления

для протеаз. Подобное предположение было вы-

сказано в отношении нуклеатора древесной ля-

гушки, который некоторые протеазы не способны

инактивировать [28].

Гемолимфа устойчивой к замерзанию голубой

мидии Mytilus edulus также содержит нуклеато-

ры небактериального происхождения [18]. В зим-

ний период нуклеирующая активность в гемолим-

фе мидий повышается, однако при их содержании

в лабораторных условиях ни температура, ни

фотопериод на температуру кристаллизации гемо-

лимфы не влияют. Однако Theede H. и Stein U.

[30] на том же объекте показали, что короткий

фотопериод и низкая температура способствуют

накоплению нуклеирующих агентов у мидий летом

и, напротив, высокая температура и длинный

фотопериод зимой приводят к исчезновению нук-

леаторов из гемолимфы.

У устойчивого к замерзанию литорального

двустворчатого моллюска митилиды Geukensia

demissa в гемолимфе не обнаружено нуклеирую-

щих агентов, однако в его жабрах выявлена ледо-

нуклеирующая бактерия Pseudomonas fulva [17].

Подобные симбиотические отношения описаны и

для амфибий (см. ниже).

БН позвоночных

Нуклеирующий агент из плазмы лягушки

R. sylvatica инициирует нуклеацию при –7,5°С и

утрачивает активность при 87°С [28], а также при

обработке растворами 5% HCl, 7 М мочевины и

некоторыми протеазами. Эти данные могут впол-

не обосновывать белковую природу нуклеатора из

плазмы R. sylvatica. Добавление к плазме лягу-

шек N-бромосукцинимида, который окисляет ин-

дольные группы триптофана и тирозина, резко

снижало температуру кристаллизации, что свиде-

тельствует о важной роли этих аминокислот в

формировании и/или поддержании активной кон-

формации нуклеатора.

В природе древесные лягушки обычно контак-

тируют со льдом, поэтому для них характерно

инокулятивное замерзание при –1°С. Однако при

охлаждении в лабораторных условиях сухой ля-

гушки нуклеация не происходит, а жидкости тела

животного сильно переохлаждаются. Хотя темпе-

ратура нуклеации нуклеирующего агента R. sylva-

tica существенно выше, чем температура иноку-

proteases. A similar suggestion was expressed as for

the nucleator of the wooden frog, which some pro-

teases could inactivate [28].

Haemolymph of the tolerant to freezing blue mus-

sel Mytilus edulus also contains nucleators of non-

bacterial origin [18]. In winter time nucleating ac-

tivity in haemolymph of mussels increases, however

under laboratory conditions neither temperature, nor

photoperiod affect haemolymph crystallization tem-

perature. However Theede H. and Stein U. [30] in

the same object showed that short photoperiod and

low temperature stimulated accumulation of nucleat-

ing agents in mussels in summer and, to the contrary,

high temperature and long photoperiod in winter

resulted in disappearance of nucleators from haemo-

lymph.

In the tolerant to freezing littoral clam Geukensia

demissa no nucleating agents were observed, how-

ever in its gills the Pseudomonas fulva [17] ice-

nucleating bacterium was found. Similar symbiotic

relationships were described for amphibia (see be-

low).

INPs of vertebrates

A nucleating agent from the frog R. sylvatica

plasma initiates nucleation at –7.5

°C and loses acti-

vity at 87

°C [28] and also after treatment with 5%

HCl, 7 M urea and some proteases. These data can

completely substantiate a protein nature of nucleator

from R. sylvatica plasma. Adding to frog plasma N-

bromosuccinimide, oxidating indole groups of trypto-

phan and tyrosine, sharply decreased crystallization

temperature that testified to an important role of the-

se amino acids in formation and/or the supporting of

nucleator active conformation.

In the nature the wooden frogs usually are in con-

tact with ice, therefore, inoculative freezing at –1

°C

is characteristic for them. However during cooling

of a dry frog under laboratory conditions the nuc-

leation does not occur and animal liquids are strongly

supercooled. Although the nucleating agent nuclea-

tion temperature of R. sylvatica was significantly

higher than the temperature of inoculative freezing,

it could perform "safety" function if inoculative freez-

ing did not take place under any reasons.

It is also known that the frog R. sylvatica uses

nucleating bacteria as symbions [16]. There were

able for nucleation initiation 13 strains of Pseudomo-

nas fluorescens, 4 strains of Pseudomonas putida

and 2 strains of Enterobacter agglomerance,

isolated from intestine of R. sylvatica. It was the

first mention about nucleating activity of P. putida

species. It is noteworthy that judging by the nuclea-

tion temperature and ability to cause D

O nucleation,

these bacteria have nucleators of A class [31].