Журнал - Проблемы криобиологии 2009 №1

Подождите немного. Документ загружается.

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

В отличие от многих эритроцитов млекопита-

ющих эритроциты лошади лишены одного из ком-

понентов цитоскелетного комплекса – белка полосы

4.2 [10]. Этот белок связывается с цитоплазмати-

ческим доменом белка полосы 3 и взаимодейст-

вует с анкирином в эритроцитах человека [17].

Представители различных классов амфифиль-

ных соединений при использовании их в микро-

молярных концентрациях способны снижать уро-

вень гипертонического гемолиза эритроцитов раз-

ных видов млекопитающих [3, 15]. Представляло

интерес исследовать активность веществ для

эритроцитов лошади, которые лишены белка поло-

сы 4.2 и содержат спектрин в денатурированной

форме (после инкубации при 49° С).

Цель работы – исследовать влияние предвари-

тельной инкубации эритроцитов лошади при 49° С

на их чувствительность к гипертоническому шоку

(4,0 М NaCl) и на эффективность амфифильных

соединений в указанных стрессовых условиях.

Ìàòåðèàëû è ìåòîäû

Объектами исследования были эритроциты ло-

шади, полученные из цельной крови, заготовлен-

ной на глюгицировом консерванте. После удаления

плазмы эритромассу дважды отмывали центри-

фугированием (при 1500 g в течение 3 мин) в 10-

кратном объеме физиологического раствора

(0,15 М NaCl, 0,01 М фосфатный буфер, pH 7,4).

Все среды готовили на 0,01 М фосфатном буфе-

ре, рН 7,4.

В работе были использованы децилсульфат

натрия, додецил-β,D-мальтозид, трифторперазин

(Calbiochem, США) и реактивы отечественного

производства квалификации “х.ч.” и “ч.д.а.”.

Для гипертонического шока эритроцитов клетки

переносили в раствор, содержащий 4,0 М NaCl, на

5 мин при температуре 37 или 0°С (конечный

гематокрит 0,4%). Амфифильные соединения до-

бавляли в гипертоническую среду перед внесе-

нием в нее клеток [9].

Эритроциты лошади (гематокрит 25%) инкуби-

ровали при температуре 49°С в течение 10 мин.

Количество вышедшего в супернатант гемогло-

бина определяли спектрофотометрически при дли-

не волны 543 нм. За 100% принимали поглощение

пробы, в которую добавляли детергент тритон

Х-100 в концентрации 0,1%.

Максимальную антигемолитическую актив-

ность амфифильного соединения выражали как

процент снижения гемолиза клеток в присутствии

вещества по отношению к гемолизу в пробе, не

содержащей амфифил [6].

Экспериментальные результаты, полученные на

крови 6 животных, представлены как среднее

арифметическое ± стандартная ошибка среднего,

The representatives of different classes of amphi-

philic compounds when using them under micromolar

concentrations are capable to reduce the level of hyper-

tonic hemolysis in erythrocytes of different mammalian

species [3, 15]. Of interest was to study the activity of

substances for equine erythrocytes, free of band 4.2

protein and containing spectrin in a denatured form

(after incubation at 49°C).

The research was aimed to investigate the effect

of preliminary incubation of equine erythrocytes at 49°C

on their sensitivity to hypertonic stress (4.0 M NaCl)

and amphiphilic compound efficiency under the men-

tioned stress conditions.

Materials and methods

The equine erythrocytes, procured from a whole

blood, prepared with glygicir preservative, served as

the investigation object. After plasm removal the

erythromass was twice washed out with centrifugation

(at 1500 g for 3 min) in a 10-fold volume of physiological

solution (0.15 M NaCl, 0.01 M phosphate buffer, pH

7.4). All media were prepared with 0.01 M phosphate

buffer, pH 7.4.

Sodium decyl sulfate, dodecyl-β,D-maltoside,

trifluoroperazine (Calbiochem, USA) and home

produced reagents with “chemically pure” and “pure

for analysis” grades have been used in the research.

Cells were transferred into the 4.0 M NaCl-con-

taining solution for 5 min at 37 or 0°C (0.4% final he-

matocrit) for erythrocyte hypertonic stress. Amphiphilic

com-pounds were added into hypertonic medium prior

to cell introduction [9].

Equine erythrocytes (25% hematocrit) were incu-

bated at 49°C for 10 min.

The amount of hemoglobin, released into superna-

tant was spectrophotometrically determined at 543 nm

wavelength. Adsorption of the sample with added

0.1% X-100 triton detergent was assumed for 100%.

The maximum antihemolytic activity of amphiphilic

compound was expressed as the percentage of cell

hemolysis decrease at the substance presence in res-

pect of hemoglobin in the amphiphile-free sample [6].

The experimental results, obtained in blood of 6 ani-

mals are presented as an mean ± standard error, M±m.

Results were processed with the Mann-Whitney and

ANOVA tests. Difference between data of groups

was considered as statistically significant at P < 0.05.

Results and discussion

In order to investigate the equine erythrocyte

sensitivity to hypertonic stress, cells were transferred

into the 4.0 M NaCl-containing medium (Fig. 1). The

level of erythrocyte hypertonic lysis at 37 and 0°C was

62 and 15%, correspondingly.

Hypertonic hemolysis of erythrocytes, preliminary

subjected to incubation at 49°C significantly depends

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

M±m. Анализ результатов проводили с помощью

Манна-Уитни и ANOVA тестов. Разброс между

группами считали статистически достоверным при

Р < 0,05.

Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå

Для изучения чувствительности эритроцитов

лошади к гипертоническому стрессу клетки пере-

носили в среду, содержащую 4,0 М NaCl (рис.1).

Видно, что при температуре 37°С уровень гипер-

тонического лизиса эритроцитов составляет 62%,

а при 0°С– 15%.

Гипертонический гемолиз эритроцитов, которые

предварительно подвергали инкубации при 49°С, в

значительной степени зависит от температуры

гипертонического раствора (рис. 1). При 37°С наб-

людается снижение уровня гемолиза эритроцитов,

модифицированных температурой (49°С), а при 0°С

отмечается рост повреждения клеток по сравне-

нию с контрольными значениями. Полученные ре-

зультаты согласуются с данными, представленны-

ми в работе [4].

Для изучения влияния амфифильных соедине-

ний на развитие гипертонического гемолиза эрит-

роцитов лошади были использованы представи-

тели анионных веществ децилсульфат натрия (С10),

неионных – додецил-β,D-мальтозид (ДМ) и катион-

ных – трифторперазин (ТФП). Для каждого сое-

динения были сняты концентрационные зави-

симости гипертонического гемолиза эритроцитов

лошади (4,0 М NaCl, температура 37 и 0°С). Из

них определяли эффективные концентрации, соот-

ветствующие величинам максимальной антигемо-

литической активности (АГ

макс

) этих соединений.

На рис. 2 представлены величины АГ

макс

амфи-

фильных соединений в условиях гипертонического

лизиса эритроцитов лошади при 37°С. Для натив-

ных клеток используемые вещества проявляют

высокую эффективность (70–85%). В результате

инкубации клеток при 49°С модификация белков

цитоскелета эритроцитов приводит к снижению в

различной степени антигемолитической актив-

ности всех амфифильных соединений в условиях

гипертонического стресса. По степени снижения

эффективности вещества можно расположить в

ряд: ТФП < С10 < ДМ. Таким образом, модифи-

кация цитоскелет-мембранного комплекса, обус-

ловленная денатурацией основного цитоскелетного

белка – спектрина, в меньшей степени отражается

на способности заряженных амфифильных соеди-

нений защищать клетки от гипертонического пов-

реждения при 37°С.

Снижение температуры эксперимента до 0°С

(рис. 3) приводит к уменьшению величин антигемо-

литической активности С10 и ДМ, но эффектив-

ность положительно заряженного ТФП практичес-

Рис. 1. Влияние предварительной инкубации эритро-

цитов лошади при 49°С на гипертонический гемолиз

(4,0 М NaCl) при температуре 37 и 0°С: – контроль; –

клетки, предварительно инкубированные при 49°С; * –

различия достоверны по сравнению с контролем, Р < 0,05.

Fig. 1. Effect of preliminary incubation of equine erythro-

cytes at 49°C on hypertonic hemolysis (4.0 M NaCl) at 37

and 0°C: – control; – cells, preliminary incubated at

49°C; * – statistically significant differences compared to

the control, P<0.05.

37 0

Температура, °С

Temperature, °С

Гемолиз, %

Hemolysis, %

100

on hypertonic solution temperature (Fig. 1). A decrease

in hemolysis level of temperature-modified erythro-

cytes (49°C) is observed at 37°C but a growth in cell

damage compared to the control values is noted at

0°C. The results obtained are consistent to the data,

reported in the paper [4].

Such representatives of anion substances as: sodium

decyl sulfate (C10), non-ion one: dodecyl-β,D-maltoside

(DM) and cation: trifluoroperazine (TFP) were used

for studying the effect of amphiphilic compounds on

hypertonic hemolysis development in equine erythro-

cytes. For each compound we registered the concent-

ration dependencies of equine erythrocyte hypertonic

hemolysis (4.0 M NaCl, 37 and 0°C). Among them

the efficient concentrations, corresponding to the maxi-

mum antihemolytic activity values (AH

max

) of these

compounds, were determined.

The Fig. 2 shows the AH

max

values of amphiphilic

compounds under equine erythrocyte hypertonic lysis

at 37°C. The used substances manifest a high

efficiency (70–85%) for native cells. As a result of

cell incubation at 49°C the modification of erythrocyte

cytoskeletal proteins results in a decrease in different

extent of antihemolytic activity of all amphiphilic

compounds under hypertonic stress conditions. By the

extent of efficiency decrease the substances may be

placed in series as follows: TFP < C10 < DM. Thus,

the modification of cytoskeleton-membrane complex,

stipulated by a denaturation of the main cytoskeletal

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

Рис. 3. Антигемолитическая активность амфифильных

веществ в условиях гипертонического гемолиза (4,0 М

NaCl) эритроцитов лошади при температуре 0°С: –

контроль; – клетки, предварительно инкубированные

при 49°С. На оси представлены эффективные концент-

рации используемых амфифильных соединений.

Fig. 3. Antihemolytic activity of amphiphilic substances

under hypertonic hemolysis (4.0 NaCl) of equine erythro-

cytes at 0°C: – control; – cells, preliminary incubated

at 49°C. The efficient concentrations of studied amphiphilic

compounds are shown in the axis.

protein: spectrin, affects in a less extent the ability of

charged amphiphil compounds to protect cells against

hypertonic damage at 37°C.

The experimental temperature decrease down to

0°C (Fig. 3) results in a reduction of C10 and DM

antihemolytic activity values but the efficiency of

positively charged TFP is not practically temperature-

dependent under hypertonic stress of unmodified equi-

ne erythrocytes.

When the erythrocytes, preliminary exposed at

49°C are subjected to hypertonic stress at 0°C, an

approximate two-fold decrease in C10, DM and TFP

antihemolytic activity is observed. Thus, spectrin dena-

turation results in an equal extent of antihemolytic acti-

vity decrease in studied substances with different

physical and chemical characteristics under erythrocyte

hypertonic stress conditions at low temperature.

The processes, stipulating the transmembrane pore

formation, comparable by size with hemoglobin mole-

cules, are in the base of hypertonic stress damaging

effect. The process of transmembrane defect forma-

tion proceeds much easily at 37 than at 0°C. Under

low temperature in the membrane, characterizing by a

denser package of its components (lipids) in a lateral

plane, the processes of defect origination and its follow-

ing development look like inhibited.

An increase in both ion strength and temperature

results in a decrease of protein cytoskeleton relative

ки не зависит от температуры при гипертоническом

стрессе немодифицированных эритроцитов лошади.

Когда гипертоническому стрессу при 0°С под-

вергаются эритроциты, которые предварительно

находились при 49°С, наблюдается снижение

антигемолитической активности С10, ДМ и ТФП

примерно в 2 раза. Таким образом, в условиях

гипертонического шока эритроцитов при низкой

температуре денатурация спектрина приводит к

одинаковой степени снижения антигемолитической

активности исследуемых веществ, имеющих

различные физико-химические характеристики.

В основе повреждающего действия гипертони-

ческого стресса лежат процессы, обусловливаю-

щие формирование трансмембранных пор, соизме-

римых по размерам с молекулами гемоглобина.

Процесс образования трансмембранных дефектов

при 37°С протекает гораздо легче, чем при 0°С.

Похоже, что при низкой температуре в мембране,

характеризующейся более плотной упаковкой

своих компонентов (липидов) в латеральной плос-

кости, процессы зарождения дефектов и последую-

щего их развития заторможены.

Повышение как ионной силы, так и темпе-

ратуры приводит к уменьшению относительных

размеров белкового цитокаркаса [16]. Следова-

тельно, в условиях гипертонического шока при

37°С уменьшение размеров цитоскелетной сети

С10, 15 мкМ

C10, 15 µM

ДМ, 3 мкМ

DM, 3 µM

ТФП, 20 мкМ

TFP, 20 µM

АГ

макс

, %

max

, %

100

Рис. 2. Антигемолитическая активность амфифильных

веществ в условиях гипертонического гемолиза (4,0 М

NaCl) эритроцитов лошади при температуре 37°С: –

контроль; – клетки, предварительно инкубированные

при 49°С; * – различия достоверны по сравнению с

контролем, Р < 0,05. На оси представлены эффективные

концентрации используемых амфифильных соединений.

Fig. 2. Antihemolytic activity of amphiphilic substances

under hypertonic hemolysis (4.0 NaCl) of equine erythro-

cytes at 37°C: – control; – cells, preliminary incubated

at 49°C; * – statistically significant differences compared

to the control, P < 0.05. The efficient concentrations of stu-

died amphiphilic compounds are shown in the axis.

АГ макс, %

max

, %

С10, 40 мкМ

C10, 40 µM

ДМ, 3 мкМ

DM, 3 µM

ТФП, 20 мкМ

TFP, 20 µM

должно быть выражено в большей степени, чем

при 0°С. Можно полагать, что в гипертонических

условиях при 37°С белки цитоскелета, находя-

щиеся на внутренней поверхности мембраны,

оказывают более выраженный стабилизирующий

эффект на образовавшиеся мембранные поры, чем

при 0°С.

Инкубация эритроцитов человека при темпера-

туре выше 48°С приводит к денатурации спект-

рина, вследствие чего увеличивается модуль элас-

тического сдвига мембраны и уменьшается ее те-

кучесть [13]. Однако и после денатурации спектрин

сохраняет остаточную структурную целостность

[11]. Чувствительность эритроцитов, термически

модифицированных, к гипертоническому стрессу

в значительной степени определяется температур-

ными условиями эксперимента (см. рис. 1). По-

видимому, изменения структурно-динамических

характеристик цитоскелет-мембранного комплек-

са эритроцитов лошади в результате высокотемпе-

ратурной (49°С) инкубации по-разному прояв-

ляются в условиях их гипертонического поврежде-

ния при 37 и 0°С.

Представители разных классов амфифильных

соединений оказывают защитный эффект при

действии различных стрессовых факторов на эрит-

роциты млекопитающих [7, 9, 12]. Положительно

заряженные молекулы ТФП при встраивании в

эритроцитарную мембрану распределяются во

внутреннем монослое липидного бислоя эритроци-

тарной мембраны, что на макроскопическом уров-

не проявляется в изменении формы эритроцита по

типу дискоцит-стоматоцит [5]. В основе распреде-

ления ТФП лежит электростатическое взаимо-

действие между положительно заряженными мо-

лекулами амфифильного соединения и отрицатель-

но заряженным внутренним монослоем, содержа-

щим фосфатидилсерин. С10 и ДМ, относящиеся к

анионным и неионным амфифилам, соответственно

встраиваются и распределяются во внешнем мо-

нослое липидного бислоя мембраны, что сопровож-

дается трансформацией эритроцитов по типу дис-

коцит-эхиноцит [5].

Антигемолитический эффект амфифильных

соединений связывают со способностью их моле-

кул при встраивании в эритроцитарную мембрану

разупорядочивать ее структуру и препятствовать

развитию трансмембранных дефектов до размера

гемолитических пор [8, 12]. Встраивание и распре-

деление экзогенных амфифильных молекул в

значительной степени определяются как состо-

янием эритроцитарной мембраны, так и их физико-

химическими свойствами. Более жесткая струк-

тура плазматической мембраны при 0°С приводит

к снижению способности амфифилов разупоря-

дочивать мембрану, что проявляется в снижении

sizes [16]. Consequently, size decrease in cytoskeletal

network should be much more expressed under hy-

pertonic stress at 37 than at 0°C. The cytoskeletal pro-

teins, being on inner membrane surface, are believed

to cause more manifested stabilizing effect on the for-

med membrane pores under hypertonic conditions at

37 vs. 0°C.

Human erythrocyte incubation at temperatures

higher than 48°C results in spectrin denaturation, due

to that an elastic shift modulus of membrane increases

and its fluidity decreases [13]. However spectrin pre-

serves a residual structural integrity even after denatu-

ration [11]. The sensitivity of heat-modified erythrocy-

tes to hypertonic stress is mostly determined by experi-

mental temperature conditions (see Fig. 1). Apparently,

the changes in structural and dynamic characteristics

of cytoskeletal and membrane complex of equine eryth-

rocytes as a result of high-temperature incubation

(49°C) are differently manifested under conditions of

their hypertonic damage at 37 and 0°C.

The representatives of different classes of amphi-

philic compounds cause a protective effect under

various stress factors on mammalian erythrocytes [7,

9, 12]. The positively charged TFP molecules when

building into erythrocyte membrane are spread in inner

monolayer of erythrocyte membrane lipid bilayer, that

is macroscopically manifested in a changed erythrocyte

shape by discocyte-stomatocyte type [5]. The TFP

distribution is based on electrostatic interaction between

positively charged molecules of amphiphilic compound

and negatively charged phosphatidyl serine-containing

inner monolayer. C10 and DM, referred to anion and

non-anion amphiphils, correspondingly, are built and

spread into external monolayer of membrane bilayer,

that is accompanied with erythrocyte transformation

by discocyte-echinocyte type [5].

Antihemolytic effect of amphiphilic compounds is

associated to the capability of their molecules to

disorder its structure and prevent transmembrane de-

fect development up to the hemolytic pore size when

these compounds incorporate into erythrocyte mem-

brane[8, 12]. Incorporation and distribution of exoge-

nous amphiphilic molecules are mostly determined by

both erythrocyte membrane state and their physical

and chemical properties. More rigid plasmatic membra-

ne structure at 0°C results in a decrease of amphiphile

ability for membrane disordering, manifesting in lowe-

ring the efficient concentration values and the ones

for antihemolytic activity of substances. Spectrin dena-

turation reduces the erythrocyte membrane fluidity

[13]. Antihemolytic activity decrease in all studied

amphiphil compounds under hypertonic stress condi-

tions of modified erythrocytes both at 37 and 0°C testi-

fies to the fact, that the changes in structural and dyna-

mic state of cytoskeleton as a result of spectrin denatu-

ration leads in erythrocyte membrane hardening.

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

Conclusions

1. Equine erythrocyte sensitivity to hypertonic

stress at 37°C is higher than at 0°C. Cell incubation at

49°C, resulting in spectrin denaturation, reduces the

level of erythrocyte hypertonic damage at 37°C and

increases it at 0°C.

Meanwhile the TFP antihemolytic activity does not

depend on experimental temperature, the C10 and DM

efficiency under hypertonic stress condition of equine

erythrocytes is higher at 37 than at 0°C. Cell incubation

at 49°C results in a decrease in the maximum anti-

hemolytic activity of amphiphilic substances both at

37 and 0°C.

References

Belous A.M., Bondarenko V.A. Structural changes in biological

membranes under cooling.– Kiev: Naukova dumka, 1982.–

255 p.

Belous A.M., Grischenko V.I. Cryobiology.– Kiev: Naukova

dumka, 1994.– 432 p.

Ershov S.S., Orlova N.V., Shpakova N.M. Mammalian erythro-

cyte sensitivity to change in temperature and osmotic medium

conditions // Problems of Cryobiology.– 2004.– N3.– P. 51–

57.

Ershov S.S., Shpakova N.M. Effect of preliminary incubation

at 49°C and phenylhydrazine treatment on hypertonic stress

and hypertonic cryohemolysis levels in mammalian eryth-

rocytes // Abstract book of the 2

Meeting of Ukrainian Society

of Cell Biology.– Kiev, 2007.– P. 62.

Kuleshova L.G., Orlova N.V., Shpakova N.M. Antihemolytic

and transforming activity of amphiphilic compounds // Prob-

lems of Cryobiology.– 2001.– N1.– P. 9–15.

Orlova N.V., Shpakova N.M. To the question about protective

action of amphiphil compounds under erythrocyte hypertonic

hemolysis // Fiziol. Zhurnal.– 2006.– N1.– P. 55–61.

Pisarenko N.A., Shpakova N.M., Orlova N.V. Effect of

amphiphil compounds on hypertonic stress of human and

bovine erythrocytes // Vestnik Kharkov. Univ. Series: Biolo-

gy.– 2007.– N768.– P. 145–149.

Tsymbal L.V., Orlova N.V., Shpakova N.M. Modification with

chlorpromazine of structural and functional state of erythrocyte

membranes // Biol. Membrany.– 2005.– Vol. 22, N2.– P. 105–

113.

Shpakova N.M., Pantaler E.R., Bondarenko V.A. Antihemolytic

effect of chlorpromazine under hypertonic and cold stress

of erythrocytes // Biokhimiya.– 1995.– Vol. 60, N10.– P. 1624–

1631.

Baskurt O.K., Farley R.A., Meiselman H.J. Erythrocyte

aggregation tendency and cellular properties in horse, human,

and rat: a comparative study // Am. J. Physiol.– 1997.–

Vol. 273, N6, Pt. 2.– P. H2604–H2612.

Chakrabarti A., Kelkar D.A., Chattopadhyay A. Spectrin

organization and dynamics: new insights // Biosci. Rep.–

2006.– Vol. 26, N6.– P. 369–386.

Hagerstrand H., Isomaa B. Amphiphile-induced antihaemolysis

is not causally related to shape changes and vesiculation //

Chem. Biol. Inter.– 1991.– Vol. 79, N3.– P. 335–347.

Kucera W., Meier W., Lerche D. Influence of heat-induced

changes in the mechanical properties of the membrane on

the filterability of human erythrocytes // Biomed. Biochim.

Acta.– 1986.– Vol. 45, N3.– P. 353–358.

Mosior M., Bobrowska M., Gomulkiewicz J. Effect of the

level of ATP and of the state of spectrin on osmotic properties

of bovine erythrocyte // Biochim. Biophys. Acta.– 1990.–

Vol. 1022, N3.– P. 355–360.

10.

11.

12.

13.

14.

Литература

Белоус А.М., Бондаренко В.А. Структурные изменения

биологических мембран при охлаждении.– Киев: Наук.

думка, 1982.– 255 с.

Белоус А.М., Грищенко В.И. Криобиология.– Киев: Наук.

думка, 1994.– 432 с.

Ершов С.С., Орлова Н.В., Шпакова Н.М. Чувствительность

эритроцитов млекопитающих к изменению температур-

ных и осмотических условий среды // Пробл. крио-

биологии.– 2004.– Т.14, № 3.– С. 51–57.

Єршов С.С., Шпакова Н.М. Вплив попередньої інкубації

при температурі 49°С та обробки фенілгідразином на рі-

вень гіпертонічного шоку та гіпертонічного кріогемолізу ерит-

роцитів ссавців // Збірник тез 2-го з’їзду Укр. товариства

клітинної біології.– Київ, 2007.– С. 62.

Кулешова Л.Г., Орлова Н.В., Шпакова Н.М. Антигемоли-

тическая и трансформирующая активность амфифильных

соединений // Пробл. криобиологии.– 2001.– Т. 11, №1.–

С. 9–15.

Орлова Н.В., Шпакова Н.М. До питання про механізм

захисної дії амфіфільних сполук в умовах гіпертонічного

гемолізу еритроцитів // Фізіолог. журнал.– 2006.– №1.–

С. 55–61.

Писаренко Н.А., Шпакова Н.М.., Орлова Н.В. Влияние

амфифильных соединений на гипертонический стресс

эритроцитов человека и быка // Вестник Харьков. ун-та.

Серия: “Биология”.– 2007.– №768.– С. 145–149.

Цымбал Л.В., Орлова Н.В., Шпакова Н.М. Модификация

хлорпромазином структурно-функционального состо-

яния мембран эритроцитов // Биол. мембраны.– 2005.–

Т. 22, № 2.– С. 105–113.

Шпакова Н.М., Панталер Е.Р., Бондаренко В.А. Антигемо-

литический эффект хлорпромазина при гипертоническом

величин эффективных концентраций и значений

антигемолитической активности веществ. Дена-

турация спектрина уменьшает текучесть мембра-

ны эритроцитов [13]. Снижение антигемоли-

тической активности всех исследуемых амфифиль-

ных соединений в условиях гипертонического шока

модифицированных эритроцитов как при 37, так и

при 0°С свидетельствует, что изменения структурно-

динамического состояния цитоскелета в результате

денатурации спектрина приводит увеличению

жесткости эритроцитарной мембраны.

Âûâîäû

1. Чувствительность эритроцитов лошади к ги-

пертоническому стрессу при 37°С выше, чем при

0°С. Инкубация клеток при 49°С, приводящая к

денатурации спектрина, снижает уровень гипер-

тонического повреждения эритроцитов при 37 и

повышает при 0°С.

2. В то время как антигемолитическая актив-

ность ТФП не зависит от температуры экспери-

мента, эффективность С10 и ДМ в условиях гипер-

тонического стресса эритроцитов лошади выше при

37, чем при 0°С. Инкубация клеток при 49°С

приводит к снижению максимальной антиге-

молитической активности амфифильных веществ

как при 37, так и при 0°С.

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

и холодовом шоке эритроцитов // Биохимия.– 1995.– Т. 60,

№ 10.– C. 1624–1631.

Baskurt O.K., Farley R.A., Meiselman H.J. Erythrocyte

aggregation tendency and cellular properties in horse, human,

and rat: a comparative study // Am. J. Physiol.– 1997.–

Vol. 273, N6, Pt. 2.– P. H2604–H2612.

Chakrabarti A., Kelkar D.A., Chattopadhyay A. Spectrin

organization and dynamics: new insights // Biosci. Rep.–

2006.– Vol. 26, N6.– P. 369–386.

Hagerstrand H., Isomaa B. Amphiphile-induced antihaemolysis

is not causally related to shape changes and vesiculation //

Chem. Biol. Inter.– 1991.– Vol. 79, N3.– P. 335–347.

Kucera W., Meier W., Lerche D. Influence of heat-induced

changes in the mechanical properties of the membrane on

the filterability of human erythrocytes // Biomed. Biochim.

Acta.– 1986.– Vol. 45, N3.– P. 353–358.

Mosior M., Bobrowska M., Gomulkiewicz J. Effect of the

level of ATP and of the state of spectrin on osmotic properties

of bovine erythrocyte // Biochim. Biophys. Acta.– 1990.–

Vol. 1022, N3.– P. 355–360.

Synchykova O.P., Shpakova N.M., Bondarenko V.A. Effect

of alkyl-β, D-glucopyranosides on hypertonic haemolysis of

erythrocytes // Bioelectrochemistry.– 2004.– Vol.62.– P. 163–

167.

Vertessy B.G., Steck T.L. Elasticity of the human red cell

membrane skeleton. Effects of temperature and denaturants //

Biophys. J.– 1989.– Vol. 55, N2.– P. 255–262.

Yawata Y. Cell Membrane: The red blood cell as a model.–

Weinheim: WILEY-VCH Verlag, 2003.– 439 p.

Поступила 04.12.2007

Рецензент Н.Г. Землянских

Synchykova O.P., Shpakova N.M., Bondarenko V.A. Effect

of alkyl-β, D-glucopyranosides on hypertonic haemolysis of

erythrocytes // Bioelectrochemistry.– 2004.– Vol.62.– P. 163–

167.

Vertessy B.G., Steck T.L. Elasticity of the human red cell

membrane skeleton. Effects of temperature and denaturants //

Biophys. J.– 1989.– Vol. 55, N2.– P. 255–262.

Yawata Y. Cell Membrane: The red blood cell as a model.–

Weinheim: WILEY-VCH Verlag, 2003.– 439 p.

Accepted in 04.12.2007

15.

16.

17.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

УДК 57.084:547.569.2

Â.Å. ×ÀÄÀÅÂ

Âëèÿíèå äèìåêñèäà íà ôóíêöèîíàëüíûå õàðàêòåðèñòèêè

òåñòèêóëÿðíîé òêàíè êðîëèêîâ

UDC 57.084:547.569.2

V.E. CHADAEV

Effect of Dimexide on Functional Characteristics

of Rabbit Testicular Tissue

Изучено влияние криопротектора димексида на функциональные характеристики тестикулярной ткани кроликов.

Установлено, что низкие концентрации димексида усиливают действие стимуляторов стероидогенеза, а более высокие –

ингибируют.

Ключевые слова: кролики, димексид, тестикулярная ткань.

Вивчено вплив кріопротектора димексиду на функціональні характеристики тестикулярної тканини кролів. Встановлено,

що невеликі концентрації димексиду підсилюють дію стимуляторів стероїдогенезу, а більш великі – інгібують.

Ключові слова: кролі, димексид, тестикулярна тканина.

The effect of dimexide cryoprotectant on functional characteristics of rabbit testicular tissue has been studied. It has been

established that the low concentrations of dimexide strengthen the effect of steroidogenesis stimulators, but the higher ones inhibit.

Keywords: rabbits, dimexide, testicular tissue.

Эндокринные ткани обладают повышенной

чувствительностью к действию ишемических по-

вреждающих факторов [8, 17]. Данное свойство

эндокринных тканей определяет выбор криопротек-

тора. В исследованиях в качестве криопротектора

использовали фармакопейный препарат диметил-

сульфоксида – димексид (ДМ), который быстро

проникает через клеточные мембраны и обладает

мощным противоишемическим действием [8, 14,

19]. Экспериментальные данные [2–4, 6, 7, 11–13,

15, 16, 20, 24] подтверждают полученные результа-

ты использования ДМ в качестве криопротектора

при замораживании эмбриональных тестисов чело-

века [9], органотипических культур из надпочеч-

ников [10] и щитовидной железы неонатальных

тканей суточных поросят [3].

Цель работы – изучить влияние ДМ на функ-

циональные характеристики тестикулярной ткани

кроликов.

Ìàòåðèàëû è ìåòîäû

Эксперименты проводили на 18-месячных кро-

ликах породы Шиншилла массой 3000–3500 г в

соответствии с “Общими принципами эксперимен-

тов на животных”, одобренными II Национальным

Endocrine tissues have hypersensitivity to the action

of ishemic damaging factors[8, 17]. This feature of

endocrine tissues determines a cryoprotectant selec-

tion. The pharmacopeial preparation of dimethyl sulfo-

xide, dimexide (DM), which is utilized as cryoprotectant

rapidly penetrating through cell membranes was

reported to as has a high anti-ishemic action [8, 14,

19]. Experimental data [2–4, 6, 7, 11–13, 15, 16, 20,

24] show the succesfull using of DM as cryoprotectant

at freezing of human fetal testes [9], organotypic

cultures from adrenal glands [10] and thyroid gland of

one day piglets’ neonatal tissues [3].

The research aim was to study the effect of DM

on functional characteristics of rabbits’ testicular

tissue.

Materials and methods

The experiments were carried out in 18 months’

old Chinchilla rabbits of 3000–3500 g, according to the

“General principles of experiments in animals”,

approved by the IInd National Congress on Bioethics

(20.09.01, Kiev, Ukraine) and agreed with the state-

ments of the “European Convention for the Protection

of Vertebrate Animals Used for Experimental and

Other Scientific Purposes” (Strasbourg, 1985). During

* Àâòîð, êîòîðîìó íåîáõîäèìî íàïðàâëÿòü êîððåñïîíäåíöèþ:

óë. Ïåðåÿñëàâñêàÿ, 23, ã. Õàðüêîâ, Óêðàèíà 61015; òåë.:+38

(057) 373-31-19, ôàêñ: +38 (057) 373-30-84, ýëåêòðîííàÿ ïî÷òà:

cryo@online.kharkov.ua

* To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyas-

lavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 3119,

fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-

tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine

Èíñòèòóò ïðîáëåì êðèîáèîëîãèè è êðèîìåäèöèíû

ÍÀÍ Óêðàèíû, ã. Õàðüêîâ

ÊÐÈÎÊÎÍÑÅÐÂÈÐÎÂÀÍÈÅ

ÁÈÎÎÁÚÅÊÒÎÂ

CRYOPRESERVATION

OF BIOLOGICAL SYSTEMS

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

конгрессом по биоэтике (20.09.04, Киев, Украина)

и согласованными с положениями “Европейской

конвенции по защите позвоночных животных,

используемых для экспериментальных и других

научных целей” (Страсбург, 1985). Во время

эксперимента животных содержали в стандартных

условиях при 15–17°С (1,5 месяца), наблюдая за

их состоянием.

Тестисы после экстирпации помещали в охлаж-

денный стерильный физиологический раствор,

измельчали на фрагменты 1–2 мм и отмывали от

крови при 3-кратной замене раствора равными

объемами раствора Хенкса. Показатели получен-

ных на данном этапе исследований фрагментов

ткани далее считали контрольными величинами.

Микрофрагменты тестисов инкубировали 30 мин

при разных концентрациях ДМ и температуре 0 или

37°С. Экстракт гипофиза (ЭГ) получали по мето-

дике [4]. Содержание тестостерона определяли с

помощью полимеразной цепной реакции до начала

инкубации и после гомогенизации микрофрагмен-

тов, затем нормировали на 1 г ткани. Перед измель-

чением ткань взвешивали с точностью до 4-го

знака. Равные навески ткани помещали в раствор

Хенкса (0 или 37°С) с разными концентрациями

ДМ, затем на водяную баню при соответствующих

температурах. Время фиксировали с момента

введения раствора. После инкубации определяли

содержание тестостерона в надосадке. Образцы

центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин. Осадок

ресуспендировали в том же объеме раствора

Хенкса, гомогенизировали и определяли уровень

тестостерона. Жизнеспособность клеток опреде-

ляли колориметрическим методом [4].

Статистическую обработку результатов про-

водили по методу Стьюдента-Фишера с помощью

программного обеспечения Excel и Sigmaplot.

Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå

При работе с эндокринными тканями следует

учитывать, что криопротекторы значительно вли-

яют на секретирующие способности эндокринных

клеток, причем относительно невысокие концент-

рации криопротекторов могут вызывать необра-

тимые изменения в эндокринных клетках на фоне

сохранения их морфологической структуры [14].

Например, для органотипической культуры из

надпочечников новорожденного поросенка предель-

но допустимая концентрация ДМ, которая не

вызывает необратимых изменений в секрети-

рующей способности этих клеток – 5% [10], а для

культур из щитовидной железы – 7% [3]. Поскольку

клетки семенников более чувствительны к дейст-

вию повреждающих факторов, реализующихся при

the experiment (1.5-month) animals were kept under

standard conditions at 15–17°C with monitoring of their

state.

After extirpation the testes were placed into cooled

sterile physiological solution, cut into 1–2 mm

fragments and washed-out of blood with 3-fold change

of solution with equal volume of Hank’s solution. The

characteristics of obtained at this stage of investigation

tissue fragments served as control values.

Microfragments of testes were incubated for 30 min

at various concentrations of DM at either 0 or 37°C.

Hypophysis extract (HE) was obtained using the

method [4]. Testosterone content was determined with

PCR method prior to incubation and after microfrag-

ments’ homogenization, then normalized per 1 g of

tissue. Prior to dissection the tissue was weighted

within the accuracy of 4th figure. The equal tissue

sections were placed into Hank’s solution (0 or 37°C)

at different DM concentrations, and then on water bath

at corresponding temperatures. Time was recorded im-

mediately after introduction the solution. After

incubation a content of testosterone in supernatant was

determined. The samples were centrifuged for 15 min

at 3000 rpm. The supernatant was resuspended in the

same volume of the Hank’s solution, homogenized and

testosterone level was determined. Cell viability was

determined with calorimetric method [4].

Statistical processing of results was carried out by

the Student-Fisher’s method with Excel and Sigmalot

software.

Results and discussion

During the work with endocrine tissues one should

consider the fact, that the cryoprotectants significantly

affect the secreting ability of endocrine cells, moreover

relatively low cryoprotectants’ concentrations may

induce irreversible changes in endocrine cells on the

background of preserving their morphological structure

[14]. For example, for organotypic culture from adrenal

glands of newborn piglets the maximum allowable DM

concentration, not inducing irreversible changes in

secreting ability of these cells is 5% [10], and for the

cultures from thyroid gland is 7% [3]. Whereas the

cells the of testes are more sensitive to the effect of

damaging factors, realizing at temperature decrease

[9, 13], it is expedient to carry out the experiments

under higher concentrations (5–15%).

Studied rabbits’ testicular tissue contained 320 ±

17 ng/g of testosterone. Microfragments of testicular

tissue (1–2 mm), placed into Hank’s solution in 1:4

ratio W/W and containing various DM concentrations

were incubated for 30 min at 0 or 37°C. After incubation

the testosterone concentration in tissue and incubated

medium was determined (Fig. 1, a).

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

Уровень тестостерона, нг/г

Testosterone level, ng/g

Уровень тестостерона, нг/г

Testosterone level, ng/g

Концентрация ДМ, %

DM concentration, %

Концентрация ДМ, %

DM concentration, %

Рис. 1. Влияние инкубации при 37°С (a) и при 0°С (б) с различными концентрациями ДМ на уровень секреции

тестостерона и его содержание в тестикулярной ткани (n = 6): – тестостерон в ткани; – тестостерон в среде; *–

результаты достоверны относительно контроля, P < 0,05.

Fig. 1. Effect of incubation at 37 (a) and 0°C (b) with different DM concentrations on testosterone secretion level and its

content in testicular tissue (n = 6): – testosterone in tissue; – testosterone in medium; *– results are significant as for

the control, P < 0.05.

снижении температур [9, 13], целесообразно прово-

дить эксперименты при более высоких концент-

рациях (5–15%).

Исследуемая тестикулярная ткань кроликов

содержала 320 ± 17 нг/г тестостерона. Микрофраг-

менты тестикулярной ткани (1–2 мм), помещенные

в раствор Хенкса в соотношении 1:4 по весу и со-

держащие разные концентрации ДМ, инкубировали

30 мин при 0 или 37°С. После инкубации определя-

ли концентрацию тестостерона в ткани и инкуба-

ционной среде (рис. 1, а).

В клетках фрагментов тестикулярной ткани кро-

ликов при концентрации ДМ 5% уровень тестосте-

рона в клетках и инкубационной среде не изменял-

ся. При повышении концентрации криопротектора

до 7,5% в инкубационной среде наблюдалось

снижение перераспределения тестостерона между

тканью и инкубационной средой, однако оно было

недостоверным. Дальнейшее повышение концент-

рации ДМ сопровождалось достоверным сниже-

нием уровня перераспределения тестостерона в

среду инкубации. Перераспределение гормона при

концентрации ДМ 10% снижалось на 14%, при

12,5% – на 25% и 15% – на 40%. Уровень тестосте-

рона в инкубационной среде снижался на фоне

повышения его уровня в клетках.

На основании полученных результатов можно

сделать вывод, что увеличение концентрации ДМ

в инкубационной среде влияло на секрецию гормона

и не влияло на его синтез.

Результаты инкубации микрофрагментов тести-

кулярной ткани в присутствии ДМ при 0°С пред-

The testosterone level in cells and incubated

medium did not change in cells of rabbits’ testicular

tissue fragments under 5% DM concentration. When

increasing the cryoprotectant concentration up to 7.5%,

the decrease of testosterone redistribution between

tissue and incubated medium was observed in incubated

medium, but it was insignificant. Further increase of

DM concentration was accompanied with significant

reduction of testosterone redistribution level in the

incubation medium. Hormone redistribution under 10%

DM concentration was reduced down to 14%, under

12.5% down to 25% and under 15% down to 40%.

The testosterone level in incubated medium was

decreased on the background of increase of its level

in cells.

The obtained results allowed to conclude that increa-

se of DM concentration in incubated medium affected

hormone secretion and did not affect its synthesis.

The results of testicular tissue microfragments’

incubation in the DM presence at 0°C are shown in

Fig. 1, b. Incubation of testicular tissue with cryopro-

tectant at 0°C results in change of hormones’ redistri-

bution between cells and incubated medium, as well

as at 37°C. However, these changes are less expres-

sed at 0°C, that is probably due to the slowing of all

processes in cells at low temperature effect. In addition,

there is stabilization of plasmatic membrane cytoske-

leton proteins at 0°C, which may affects on hormones’

secretion.

It is known that all steroid hormones in mammals

are synthesized from cholesterol at serial reactions

[15]. Under the effect of cAMP esterase the activation

Контроль

Control

5 7,5 10 12,5 15

100

150

200

250

300

Контроль

Control

5 7,5 10 12,5 15

100

150

200

250

300

a a б b

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

ставлены на рис. 1, б. Инкубация тестикулярной

ткани с криопротектором при 0°С приводит к изме-

нению перераспределения гормонов между клетка-

ми и инкубационной средой, как и при 37°С. Однако

при 0°С эти изменения менее выражены, что,

вероятно, обусловлено замедлением всех процес-

сов в клетках при действии низких температур.

Кроме того, при 0°С имеет место стабилизация

белков цитоскелета плазматических мембран,

которая может влиять на секрецию гормонов.

Известно, что у млекопитающих все стероид-

ные гормоны синтезируются из холестерола при

последовательных реакциях [15]. Под действием

цАМФ происходит активация эстеразы, а образу-

ющийся в результате ее активации свободный хо-

лестерин транспортируется к месту синтеза сте-

роидных гормонов. Возможно, 5- и 10%-е кон-

центрации ДМ способствуют активации эстеразы

и быстрому запуску биосинтеза стероидных гор-

монов, в результате которых усиливается секреция

тестостерона (рис. 2). При 0°С эстераза не активи-

руется, поскольку указанная температура не явля-

ется физиологической, а ее действие приводит к

замедлению всех биологических процессов. В

виду отсутствия данных относительно регуляции

процессов секреции тестикулярных гормонов, мы

полагаем, что тестостерон, как и другие стероид-

ные гормоны, секретируется по мере образования.

В случае более высоких концентраций криопро-

тектора (12,5 и 15%), вероятно, активация эстеразы

отсутствует или даже ингибируется, т.е. стероидо-

генез может замедляться.

Снижение уровня перераспределяемых гормо-

нов в инкубационную среду можно объяснить

гибелью части клеток под влиянием ДМ. При опре-

делении количества жизнеспособных клеток

колориметрическим методом с использованием

трипанового синего установлено, что после инку-

бации с криопротектором при 0 или 37°С оно не

изменяется (рис. 2). Во всех исследуемых образцах

количество жизнеспособных клеток составляло

72–74%. Гибель остальных клеток связана с дез-

интеграцией кусочков ткани на отдельные клетки

после обработки трипсином. При определении

жизнеспособности клеток с помощью колориме-

трического метода данная процедура обязательна.

Поскольку тестостерон синтезируется только

клетками Лейдига, а количество жизнеспособных

клеток при инкубации с криопротектором не изме-

нялось, то полученные данные о снижении содер-

жания перераспределенного между клеткой и сре-

дой гормона в присутствии концентраций ДМ 7,5–

15% можно объяснить нарушением процессов

секреции.

takes place and free cholesterol, resulting from its

activation is transported to the steroid hormones

synthesis site. Perhaps, 5 and 10% DM concentrations

make possible the esterase activation and rapid

initiation of steroid hormones’ biosynthesis, due to those

the testosterone secretion is increased (Fig. 2). Este-

rase is not activated at 0°C, because this temperature

is not physiological and its activity results into slowing-

down all biological processes. Because of the absence

of data as for regulation of testicular hormones secre-

tion processes, we suppose that testosterone, as other

steroid hormones is secreted along its formation. At

higher concentrations of cryoprotectant (12.5 and

15%), probably the esterase activation is absent or even

inhibited, i.e. steroidogenesis may be slaved-down

moderate.

Increase of redistributed hormone level into incu-

bation medium one may explain with the death of cells’

part under DM effect. When determining a number of

viable cells by calorimetric method with using trypan

blue it has been established that after incubation with

cryoprotectant at 0 or 37°C it does not change (Fig. 2).

In all the studied samples the number of viable cells

consisted 72–74%. Death of other cells has been

associated to disintegration of tissue samples into certain

cells after trypsin treatment. When determining the

viability of cells with calorimetric method this procedure

was compulsory.

As testosterone is synthesized only with Leydig’s

cells and the number of viable cells during incubation

with cryoprotectant did not change, therefore the

Рис. 2. Количество жизнеспособных клеток в микро-

фрагментах тестикулярной ткани кроликов до и после инку-

бации с ДМ (n = 6): – 37° C, 30 мин; – 0° С, 30 мин.

Fig. 2. Number of viable cells in microfragments of rabbit

testicular tissue prior to and after incubation with DM (n =

6): – 37° C, 30 min; – 0° С, 30 min.

Контроль

Control

5 7,5 10 12,5 15

Концентрация ДМ, %

DM concentration, %

Жизнеспособность, % от контроля

Viability, % of control