Журнал - Проблемы криобиологии 2009 №1

Подождите немного. Документ загружается.

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå

При морфологическом исследовании яичек

контрольных животных І группы – половозрелых

молодых кроликов – обнаруживается паренхима

органа, состоящая из извитых семенных каналь-

цев, между которыми находится небольшое коли-

чество соединительной ткани, содержащей круп-

ные интерстициальные клетки (клетки Лейдига).

Извитые семенные канальцы выстланы спермато-

генным эпителием, на базальной мембране кото-

рого находятся крупные клетки с гиперхромными

ядрами – предшественники гамет – спермато-

гонии. Между ними располагаются поддержива-

ющие клетки Сертоли (сустентоциты), имеющие

пирамидальную форму и вытянутые в просвет

семенного канальца. Клетки Сертоли выполняют

барьерную роль между половыми клетками и

внутренней средой организма [1]. Они делят спер-

матогенный эпителий на базальное и адлюминаль-

ное пространства. В базальном пространстве обна-

руживаются сперматогонии. Ближе к просвету

канальцев в достаточно свободном адлюминаль-

ном пространстве определяются сперматоциты

первого и второго порядков, а над ними, вблизи

просвета канальцев, – мелкие клетки-сперматиды

на различных этапах развития и зрелые спермато-

зоиды (рис. 1).

При морфологическом исследовании яичек

животных II группы наблюдали деструктивные

изменения сперматогенного эпителия, выража-

ющиеся в запустевании извитых семенных ка-

нальцев. Адлюминальное пространство содержит

набухшие сперматоциты первого и второго поряд-

ков. Поддерживающие клетки Сертоли плохо

Рис.1. Сперматогенный эпителий извитых семенных

канальцев яичка кролика. Контроль. окраска гемато-

ксилином и эозином, ×120.

Fig. 1. Spermatogenic epithelium of convoluted seminiferous

tubules of rabbit testes. Control. Staining with hematoxylin

and eosin, ×120.

Рис. 2. Запустевание извитых семенных канальцев кро-

ликов II группы. Окраска гематоксилином и эозином,

× 240.

Fig. 2. Barren convoluted seminiferous tubules of rabbits

of the 2

group. Staining with hematoxylin and eosin, ×240.

Sertoli’s cells of pyramidal form and elongated into

seminiferous tubule lumen. The Sertoli’s cells realise

a barrier role between sexual cells and organism’s

internal medium [1]. They divide spermatogenic

epithelium in basal and adluminal spaces. Sperma-

togones are revealed in a basal space. Near the tubule

lumen in a quite free adlumnal space there are deter-

mined the spermatocytes of the first and second orders,

and over them close to the tubule lumen there are small

cells: spermatids in different developmental stages and

mature spermatozoa (Fig. 1).

During morphological study of testes of the 2

group animals we observed destructive changes in

spermatogenic epithelium, manifesting in barren con-

voluted seminiferous tubules. An adluminal space

contains the swollen spermatocytes of the first and

second orders. The supporting Sertoli’s cells are poorly

determined. The oedema of testicular parenchyma is

seen. The single interstitial cells: glandulocytes with

pyknotic nuclei are found out between convoluted

seminiferous tubules (Fig. 2).

Morphological study of rabbit’s testes of the 3

group demonstrated the renewal of regenerative func-

tion in convoluted seminiferous tubules (Fig. 3). Thus,

on a basal membrane of spermatogenic epithelium

there were revealed the maintaining Sertoli’s cells,

providing hematotesticular barrier, due to which in

adluminal space of spermatogenic epithelium a specific

hormonal medium with a high testosterone level was

created.

Selective permeability of hematotesticular barrier

is known to isolate the maturing sexual cells from toxic

substances and prevent the autoimmune response

development against surface antigens, being expressed

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

on spermatozoa membrane during their maturation. In

addition, Sertoli’s cells, acting as a barrier function

between sexual cells and organism’s internal medium,

realise a trophic function, by providing the developing

gametes with nutritive substances [1]. In addition to

sustenocytes the spermatogones of A and B types are

located on a basal membrane. Near the lumen of con-

voluted seminiferous tubules there are spermato-cytes

of the first and second orders, over which there are

spermatides at different developmental stages, as well

as spermatozoa.

As a result of the performed researches we have

found out, that the destructive changes, occurring under

conditions, when testes release from mature sper-

matozoa is impossible, are similar to destructive pro-

cesses, progressing after vasoligation or vasotomy. As

we have demonstrated previously, during 2.5–3 months

of sexual abstinence the atrophy of testicular spermato-

genic epithelium occurs [6]. At the same time the most

differentiated layers of spermatogenic epithelium:

forming spermatozoa and spermatides, are first, who

undergo destructive changes. The latter, when swelling,

are getting confluent in typical roundish masses, so-

called spermatic spheres, swimming in tubular lumen.

However, since the inferior layers of spermatogenic

epithelium (spermatogones and first order spermato-

cytes) are preserved longer, sometimes it is sometimes

possible to recover spermatogenesis after removing

damaging agent or unfavourable factor.

Allotransplantation of cryopreserved testicular

tissue to male rabbits, keeping for 2 months without

females, resulting in recovery of morphofunctional state

of testes, proved the possibility of correcting testicular

hypofunction at sexual abstinence.

определяются. Наблюдается отек паренхимы яи-

чек. Между извитыми семенными канальцами

наблюдали единичные интерстициальные клетки

(гландулоциты) с пикнотичными ядрами (рис. 2).

Морфологическое исследование яичек кроликов

ІІІ группы показало возобновление генеративной

функции в извитых семенных канальцах (рис. 3).

Так, на базальной мембране сперматогенного эпи-

телия обнаруживались поддерживающие клетки

Сертоли, обеспечивающие гематотестикулярный

барьер, благодаря которому в адлюминальном

пространстве сперматогенного эпителия создается

специфическая гормональная среда с высоким

уровнем тестостерона.

Известно, что избирательная проницаемость

гематотестикулярного барьера изолирует созрева-

ющие половые клетки от токсических веществ и

препятствует развитию аутоиммунного ответа

против поверхностных антигенов, экспрессиру-

ющихся на мембране сперматозоидов в процессе

их созревания. Кроме того, клетки Сертоли, выпол-

няя барьерную функцию между половыми клет-

ками и внутренней средой организма, осущест-

вляют трофическую функцию, обеспечивая раз-

вивающиеся гаметы питательными веществами

[1]. Помимо сустентоцитов на базальной мембране

располагаются сперматогонии типов А и В. Ближе

к просвету извитых семенных канальцев лежат

сперматоциты первого и второго порядков, над ко-

торыми находятся сперматиды на различных эта-

пах развития, а также сперматозоиды.

В результате проведенных исcледований обна-

ружено, что деструктивные изменения, возника-

ющие в условиях невозможности освобождения

яичек от зрелых сперматозоидов, аналогичны

деструктивным процессам, развивающимся после

перевязки или перерезки семявыводящих каналов.

Ранее нами было показано, что при 2,5–3 месяцах

половой абстиненции наступает атрофия сперма-

тогенного эпителия яичек [6]. При этом деструк-

тивным изменениям подвергаются в первую оче-

редь наиболее дифференцированные ярусы спер-

матогенного эпителия – формирующиеся сперма-

тозоиды и сперматиды. Последние, набухая, сли-

ваются в характерные округлые массы, так назы-

ваемые семенные шары, плавающие в просвете

канальца. Однако, поскольку нижние слои сперма-

тогенного эпителия (сперматогонии и сперма-

тоциты первого порядка) сохраняются более дли-

тельно, то восстановить сперматогенез после

прекращения действия повреждающего агента или

неблагоприятного фактора иногда возможно.

Аллотрансплантация криоконсервированной

тестикулярной ткани кроликам-самцам, содержа-

щимся в течение 2-х месяцев без самок, резуль-

татом которой явилось восстановление морфо-

Рис. 3. Возобновление сперматогенеза в паренхиме яичек

кроликов III группы. Окраска гематоксилином и эозином,

× 240.

Fig. 3. Spermatogenesis renewal in testicular parenchyma

of rabbits of the 3

group. Staining with hematoxylin and

eosin, × 240.

Conclusions

Sexual abstinence in rabbits within 2 months was

shown as not to be irreversible; the method of allotrans-

plantation of cryopreserved testicular tissue enables

to recover morphofunctional state of testes via cor-

recting decrease in their function.

функционального состояния их яичек, доказала воз-

можность коррекции гипофункции яичек при

половой абстиненции.

Âûâîäû

Показано, что половая абстиненция кроликов в

течение 2-х месяцев не является необратимой; ме-

тод аллотрансплантации криоконсервированной

тестикулярной ткани позволяет восстанавливать

морфофункциональное состояние яичек путем кор-

рекции снижения их функции.

Литература

Гистология (введение в патологию) / Под ред. Э.Г.

Улумбекова, Ю.А. Челышева.– М.: ГЭОТАР, 1997.– 960 с.

Ендовицкая И.П., Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К. Динамика

сперматогенеза у кролика oryctolagus cuniculus // Цито-

логия.– 2005.– Т. 47, №1.– С. 44–48.

Киселева А.Ф., Житников А.Я., Кейсевич Л.В. Морфо-

функциональные методы исследования в норме и пато-

логии. – Киев: Здоров’я, 1983.– 164 с.

Сперматогенез и его регуляция // Под ред. Л.В. Дани-

лова.– М.: Наука, 1983.– 232 с.

Чадаев В.Е., Добрунова И.В. Изучение влияния срока

половой абстиненции на поведенческие реакции у

кроликов. Первое сообщение // Клінічна та експеримен-

тальна патологія.– 2006.– Т. 5, №4.– С. 93-95.

Чадаев В.Е., Волина В.В. Изучение влияния срока поло-

вой абстиненции на морфофункциональное состояние

семенников кроликов. Второе сообщение // Клінічна та

експериментальна патологія.– 2007.– Т. 6, №2.– С. 76–

79.

Поступила 27.05.2008

Рецензент Т.М. Шарлай

References

Histology (introduction to pathology) / Ed. by E.G. Ulumbekov,

Yu.A. Chelyshev.– Moscow: GEOTAR, 1997.– 960 p.

Endovitskaya I.P., Zinovieva N.A., Ernst L.K. Sperma-

togenesis dynamics in rabbit Oryctolagus cuniculus //

Tsitologiya.– 2005.– Vol. 47, N1.– P. 44–48.

Kiseleva A.F., Zhitnikova A.Ya., Keysevich L.V. Morpho-

functional methods of research in the norm and pathology.–

Kiev: Zdorov’ya, 1983.– 164 p.

Spermatogenesis and its regulation // Ed. by L.V. Danilov.–

Moscow: Nauka, 1983.– 232 p.

Chadayev V.E., Dobrunova I.V. Study of the effect of sexual

abstinence term on behavioral reactions in rabbits. First

report // Klinichna ta eksperymental’na patologiya.– 2006.–

Vol. 5, N4.– P. 93–95.

Chadayev V.E., Volina V.V. Studying the effect of sexual

abstinence on morphofunctional state of rabbit’s testes.

Second report // Klinichna ta eksperymental’na patologiya.–

2007.– Vol. 6, N2.– P. 76–79.

Accepted in 27.05.2008

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

УДК 615.361:612.649;612.118.7:57.085.2

À.À. ÖÓÖÀÅÂÀ

Â.Â. ÂÎËÈÍÀ

*, Ë.Â.

ÑÎÊÎË

, Î.À. ÆÓËÈÊÎÂ

Âëèÿíèå ëåéêîêîíöåíòðàòà êîðäîâîé êðîâè ÷åëîâåêà

íà ðåãåíåðàòîðíóþ àêòèâíîñòü êîæè

â êóëüòóðå in vitro

UDC 615.361:612.649;612.118.7:57.085.2

A.A. TSUTSAYEVA

, V.V. VOLINA

, L.V. SOKOL

, O.A. ZHULIKOV

Effect of Human Cord Blood Leukoconcentrate

on Skin Regenerative Activity in Culture In Vitro

Изучали характер влияния лейкоконцентрата криоконсервированных клеток кордовой крови человека, взвешенных в

аутологичной плазме (препарат ЛККЧ), на морфологию кожи человека в разные сроки культивирования in vitro. Кожу

культивировали на агаризованной среде с добавлением 17% эмбриональной сыворотки (контроль) и 10% препарата ЛККЧ

(экспериментальная группа). В присутствии препарата ЛККЧ на 5–7 суток дольше поддерживалась жизнеспособность кожи

in vitro по сравнению с контрольной группой. Под влиянием ЛККЧ в культивируемых кожных лоскутах увеличивалось

количество фибробластов и волокнистых структур, что позволяет сделать предположение о стимуляции процессов как

пролиферации фибробластов, так и синтеза волокнистых структур в дерме.

Ключевые слова: кожные эксплантаты, лейкоконцентрат кордовой крови человека, культивирование in vitro, морфофунк-

циональная активность.

Вивчали характер впливу лейкоконцентрату кріоконсервованих клітин кордової крові людини, зважених в аутологічній

плазмі (препарат ЛККЛ), на морфологію шкіри людини в різні строки культивування in vitro. Шкіру культивували на

агаризованому середовищі з додаванням 17% ембріональної сироватки (контроль) та 10% препарату ЛККЛ (дослідна група).

У присутності препарату ЛККЛ на 5–7 діб довше підтримувалась тривалість життя шкіри in vitro у порівнянні з тривалістю

життя шкіри в контрольній групі. Під впливом ЛККЛ в шкірних шматках, які культивувалися, зростала кількість фібробластів

і волокнистих структур, що дозволяє зробити припущення щодо стимуляції процесів як проліферації фібробластів, так і

синтезу волокнистих структур у дермі.

Ключові слова: шкірні експлантати, лейкоконцентрат кордової крові людини, культивування in vitro, морфофункціональна

активність.

The effect of human cord blood cryopreserved cell leukoconcentrate, suspended in autologous plasm (LHCB preparation) on

in vitro cultured human skin morphology in different terms, has been studied. Skin was cultured on an agarised medium, supplemented

with 17% embryonic serum (control) and 10% LHCB preparation (experimental group). The skin viability in vitro was maintained for

5–7 days longer in the presence of LHCB preparation compared to the control group. Under LHCB effect in cultured skin flaps there

was an increase in fibroblast and fibrous structure amount, that enables concluding about the stimulation of both processes of fibroblast

proliferation and synthesis of fibrous structures in derma.

Keywords: skin explants, human cord blood leukoconcentrate, in vitro culturing, morphofunctional activity.

* Àâòîð, êîòîðîìó íåîáõîäèìî íàïðàâëÿòü êîððåñïîíäåíöèþ:

óë. Ïåðåÿñëàâñêàÿ, 23, ã. Õàðüêîâ, Óêðàèíà 61015; òåë.:+38

(057) 373-31-26, ôàêñ: +38 (057) 373-30-84, ýëåêòðîííàÿ ïî÷òà:

cryo@online.kharkov.ua

* To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavskaya

str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 3126, fax: +380 57

373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-

tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine

Kharkov Municipal Clinical Hospital N31, Kharkov, Ukraine

Èíñòèòóò ïðîáëåì êðèîáèîëîãèè è êðèîìåäèöèíû

ÍÀÍ Óêðàèíû, ã. Õàðüêîâ

Õàðüêîâñêàÿ ãîðîäñêàÿ êëèíè÷åñêàÿ áîëüíèöà ¹ 31

Разработка методов культивирования кожных

лоскутов остается актуальной в связи с тем, что

кожа как трансплантат используется при таких

повреждениях кожных покровов, как ожоги и об-

ширные травмы.

В последнее время применяются различные

способы стимуляции процессов репарации пов-

режденной и регенерации утратившей тургор и

эластичность кожи с помощью биологически ак-

тивных препаратов – плаценты и ее экстрактов, а

также клеточных суспензий [1, 3, 5].

Кордовая (пуповинная) кровь является источни-

ком биологически активных веществ [4, 5]. Однако

работы по оценке механизмов действия взвеси

Designing the methods for skin flap culturing has

remained an actual task due to skin usage as a trans-

plant at such skin integument damages as burns and

major traumas.

Recently there have been applied the different ways

for stimulating reparative processes in a damaged skin

and the one, lost the turgor and elasticity, using such

biologically active preparations as: placenta and its

extracts as well as cell suspensions [1, 3, 5].

Umbilical cord blood is the source of biologically

active substances [4, 5]. However the reports on eva-

luating the effect mechanisms of blood nucleated cell

suspensions are single and the obtained results are not

free of contradictions [6–8].

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

ядерных клеток крови единичны, а полученные

исследователями результаты не лишены противо-

речий [6–8].

Цель работы – изучение характера влияния

криоконсервированных суспензий ядерных клеток

кордовой крови, взвешенных в аутологичной

плазме, на морфофункциональные процессы,

происходящие в образцах кожи, культивируемых

in vitro.

Ìàòåðèàëû è ìåòîäû

Исследовали фрагменты кожи человека, полу-

ченные из краев операционной раны в области жи-

вота во время полостной операции. Доноры давали

добровольное информированное согласие. Фраг-

менты кожи размером 0,3×0,3 см отделяли скаль-

пелем от подкожной жировой клетчатки, помеща-

ли на 0,7% бакто-агар (Difco), который готовили в

среде RPMI, содержащей 17% эмбриональной

сыворотки крупного рогатого скота либо 10% крио-

консервированного лейкоконцентрата кордовой

крови человека (ЛККЧ) от объема культуральной

среды и обогащенной L-глютамином, L-аспараги-

ном, аминокислотами и витаминами, pH среды 7,2.

После помещения на агар фрагменты кожи по-

крывали культуральной ростовой средой в объе-

ме 0,5 мл для исключения их подсыхания. Флаконы

с культивируемым материалом плотно закрывали

резиновыми пробками.

Фрагменты кожи были разделены на группы:

– группа I – нормальная кожа (исходный мате-

риал);

– группа II – образцы кожи на 7-, 14- и 21-е сутки

культивирования на агаровой среде (контроль);

– группа III – образцы кожи на 7-, 14- и 21-е

сутки культивирования на агаровой среде, вклю-

чающей препарат ЛККЧ (опыт).

Препарат ЛККЧ, который состоит из ядерных

клеток кордовой крови, взвешенных в аутологич-

ной плазме (“Гемокорд”, разрешен МОЗ Украины

к клиническому применению), криоконсервирова-

ли без традиционных криопротекторов и исполь-

зовали сразу после отогрева [5]. Концентрация кле-

точных элементов составляет 1,71 ± 0,07×10

–7

кл/мл

с сохранностью 86,2 ± 3,1%. Клеточный спектр

ядерных компонентов кордовой крови представ-

лен: лимфоцитами – 74,0 ± 2,0%, моноцитами –

9,0 ± 0,3%, нейтрофилами – 6,0 ± 0,2%, недиффе-

ренцированными клетками – 8,0 ± 0,7%, стволовы-

ми кроветворными и некроветворными клетками –

3,0 ± 0,1% [4, 5].

Культивирование кожи проводили in vitro при

температуре 37°С. Кожные эксплантаты извлекали

на 7-, 14-, 21-е сутки культивирования, фиксиро-

вали в 10%-м формалине, заливали в целлоидин и

The research was aimed to study the character of

effect of cryopreserved suspensions of cord blood nuc-

leated cells, suspended in an autologous plasm on mor-

phofunctional processes, occurring in cultured skin

samples in vitro.

Materials and methods

Human skin fragments, derived from operative

wound edges in abdominal area during major surgery,

were under study. Donors provided a voluntary infor-

med consent. The 0.3×0.3 cm’s skin fragments were

separated with scalpel from a subcutaneous fat, then

placed on 0.7% bacto-agar (Difco), prepared in the

RPMU medium, containing either 17% embryonic

cattle serum or 10% cryopreserved leukoconcentrate

of human cord blood (LHCB) of the cultural medium

volume and enriched with L-glutamine, L-asparagine,

aminoacids and vitamins, medium pH 7.2.

After placing on agar the skin fragments were cove-

red with a cultural growth medium in 0.5 ml volume

to exclude their drying. The flasks with cultured

material were tightly closed with rubber plugs.

Skin fragments were divided into the following

groups:

– the 1

group was normal skin (initial material);

– the 2

one comprised the skin samples to the 7

and 21

culturing days with agar medium (cont-

rol);

– the 3

one were the skin samples to the 7

, 14

and 21

culturing days with agar medium, comprising

the LHCB preparation (experiment).

The LHCB preparation, consisted of nucleated cord

blood cells, suspended in autologous plasm (“Hemo-

cord”, authorized to application by the Ministry of Health

Care of Ukraine) is cryopreserved with no standard

cryoprotectants and applied just after thawing [5]. Cell

element concentration makes 1.71 ± 0.07×10

-7

cells/ml

with 86.2 ± 3.1% integrity. Cell range of cord blood

nucleated components is represented by lymphocytes

(74.0 ± 2.0%), monocytes (9.0 ± 0.3%), neutrophils

(6.0 ± 0.2%), undifferentiated cells (8.0 ± 0.7%), stem

hemopoietic and non-hemopoietic cells (3.0 ± 0.1%)

[4, 5].

Skin was in vitro cultured at 37°C. Skin explants

were removed to the 7

, 14

and 21

culturing days,

fixed in 10% formalin, embedded into celloidin and

5-7 µm histological sections, stained with hematoxylin

and eosin, were prepared from them. In the obtained

histological preparations in 10 visual fields (lens 10,

ocular 40) the fibroblast number in derma was

calculated and the thickness of epidermis, papillary

and reticular derma layers was morphometrically

determined.

The obtained data were statistically processed with

the Student-Fisher method [2].

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

готовили из них гистологические срезы толщиной

5–7 микрон, которые окрашивали гематоксилином

и эозином. На полученных гистологических препа-

ратах в 10 полях зрения (об. 10, ок. 40) подсчиты-

вали количество фибробластов в дерме и произво-

дили морфометрическое определение толщины

эпидермиса, сосочкового и сетчатого слоев дермы.

Статистическую обработку полученных дан-

ных проводили по методу Стьюдента-Фишера [2].

Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå

В опытах in vitro было установлено, что на 7-е

сутки культивирования эксплантатов кожи в конт-

рольной группе наблюдалось достоверно выражен-

ное (Р < 0,05) по сравнению с интактной кожей

(рис. 1) уменьшение толщины эпидермиса за счет

как кератинизации, так и миграции его клеток.

Отмечались сглаженность дермоэпидермальной

границы и расширение эпидермальных выростов,

местами – отслоение эпидермиса. В сосочковом

слое дермы наблюдалось достоверное (Р < 0,05)

увеличение количества фибробластов по сравне-

нию с нормальной кожей (таблица). В сетчатом

слое дермы обнаруживались молодые интенсивно

окрашивающиеся коллагеновые волокна, увеличи-

валось количество клеток в железистых структурах

и волосяных фолликулах (рис. 2).

В эксплантатах кожи группы III, выращенных

на агаризованной питательной среде, в которую

был добавлен препарат ЛККЧ, на этот срок струк-

тура эпидермиса была сравнима с нормальной

(рис. 3). Дермоэпидермальная граница хорошо

контурировалась, местами наблюдалось отслоение

эпидермиса от дермы. Коллагеновые волокна обра-

зовывали плотную сеть, количество фибробластов

достоверно увеличивалось (Р < 0,05) по сравнению

с группами I и II (таблица).

Рис. 1. Интактная кожа человека (группа I). Окраска

гематоксилином и эозином, ×240.

Fig. 1. Human intact skin (1

group). Staining with hemato-

xylin and eosin, ×240.

Рис. 2. Кожа группы II на 7-е сутки культивирования

(контроль). Окраска гематоксилином и эозином, ×240.

Fig. 2. The 2

group’s skin to the 7

culturing day (con-

trol). Staining with hematoxylin and eosin, ×240.

Results and discussion

As in vitro experiments showed, to the 7

day of

skin explant culturing the control group demonstrated

a statistically significant decrease (P<0.05) in epider-

mis thickness due to both keratinisation and its cell

migration, compared to the intact skin (Fig. 1). The

dermoepidermal interface flattening and extension of

epidermal outgrowths and somewhere epidermis exfo-

liation were noted. In a papillary derma layer a statis-

tically significant (P < 0.05) increase in fibroblast num-

ber compared to the normal skin was observed (Table).

In a retinal derma layer the young intensively stained

collagen fibers were revealed, the cell number in glan-

dular structures and hair follicles increased (Fig. 2).

By this term in skin explants of the 3

group, grown

up on an agarised nutritive medium, supplemented

with LHCB preparation, the epidermal structure was

compared to the normal one (Fig. 3). Dermoepidermal

interface was well contoured with here and there

observed epidermal exfoliation from a derma. Colla-

gen fibers formed a dense net, fibroblast number statis-

tically and significantly increased (P < 0.05) compared

to the 1

and 2

groups (Table).

To the 14

day of skin graft culturing free of LHCB

preparation, a decrease in epidermis sizes compared

to the normal skin, was observed. Dermoepidermal

interface was slightly contoured. The structure of con-

nective fibers in derma corresponded to the normal

skin (Fig. 4). The fibroblast number statistically and

significantly increased (P < 0.05) compared to the nor-

mal skin (Table). In glands (sudoriferous and seba-

ceous) as well as in hair follicles the epithelial cell

proliferation was observed.

To the 14

day of skin culturing with LHCB prepa-

ration (Fig. 5) the epidermis sizes augmented compa-

red to the 2

group within the same culturing term,

but its cell layer differentiation was complicated. In a

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

Гистология фрагментов кожи человека в зависимости от сроков культивирования in vitro с ЛККЧ

Histology of human skin fragments depending on in vitro culturing terms with LHCB

Примечание: группа II – фрагменты кожи, помещенные на поверхность культуральной среды (контроль); группа III – фрагменты кожи, помещенные на поверхность культуральной

среды, в которую добавляли 10% препарата ЛККЧ (опыт).

Notes: the 2

group is the skin fragments, placed on a surface of cultural medium (control); 3

group is the skin fragments, placed on a surface of cultural medium, supplemented with 10% LHCB

preparation (experiment).

èæîêûðóòêóðòÑ

serutcurtsnikS

îäàæîK

ÿèíàâîðèâèòüëóê

)Iàïïóðã(

gnirutlucerofebnikS

)puorg

àæîêÿàìåóðèâèòüëóK

èêòóñ,ÿèíàâîðèâèòüëóêèêîðÑ

niksderutluC

syad,smretgnirutluC

74112

IIàïïóðÃ

puorg

IIIàïïóðÃ

puorg

IIàïïóðÃ

puorg

IIIàïïóðÃ

puorg

IIàïïóðÃ

puorg

IIIàïïóðÃ

puorg

,ûðåìçàðåèíäåðÑ × 01

ìêì

,sezisegarevA × 01

µm

ñèìðåäèïÝ

simredipE

7,0±1,36,0±9,17,0±9,25,0±3,27,0±7,27,0±1,25,0±7,2

ûìðåäèîëÑ

sreyallamreD

éûâîê÷îñîñ

yrallipaP

4,1±4,014,1±4,311,2±3,011,2±8,99,2±0,113,1±3,61,1±3,6

éûòà÷òåñ

laniteR

9,3±2,749,6±4,363,3±8,470,9±8,158,6±6,578,3±0,338,8±0,56

)04.áî,01.êî(ÿèíåðçõÿëîï01ââîòñàëáîðáèôîâòñå÷èëîêååíäåðÑ

)04evitcejbo,01snel(sdleiflausiv01nistsalborbifforebmunegarevA

àìðåÄ

amreD

20,1±0,940,2±0,8155,2±3,735,1±6,172,01±3,26150,0±3,55,2±3,27

ðóòêóðòñåèíÿîòñîÑ

serutcurtsfoetatS

ûðóòêóðòñåûòñèíêîëîÂ

serutcurtssuorbiF

ÿàíüëåòèíèäåîÑ

îëõûðñüíàêò

èìûííåæîëîïñàð

èèìûâîíåãàëëîê

èìûâîíèòñàëý

èìàíêîëîâ

htiweussitevitcennoC

detacolylesool

dnasuonegalloc

srebifnitsale

çèüòåñÿàëõûÐ

èõûâîíåãàëëîê

íîêîëîâõûâîíèòñàëý

krowtenesooL

dnasuonegallocfo

srebifnitsale

çèüòåñÿàíòîëÏ

èõûâîíåãàëëîê

íîêîëîâõûâîíèòñàëý

krowtenesneD

dnasuonegallocfo

srebifnitsale

çèüòåÑ

èõûâîíåãàëëîê

íîêîëîâõûâîíèòñàëý

krowteN

suonegallocfo

srebifnitsaledna

çèüòåñÿàíòîëÏ

èõûâîíåãàëëîê

íîêîëîâõûâîíèòñàëý

krowtenesneD

suonegallocfo

srebifnitsaledna

èÿèöàçèíåãîìîÃ

äàïñàðéûòà÷áûëã

èõûâîíåãàëëîê

íîêîëîâõûâîíèòñàëý

adnanoitasinegomoH

dolc - foyacedekil

dnasuonegalloc

srebifnitsale

âåèíåîëññàÐ

õàêòñà÷óõûíüëåäòî

õûííå÷íîòñèâîê÷óï

èõûâîíåãàëëîê

íîêîëîâõûâîíèòñàëý

emosninoitailofxE

sehcnubfosetis

suonegallocdennihtfo

srebifnitsaledna

éèëåòèïýéûòñèçåëåÆ

ûëóêèëëîôåûíÿñîëîâè

muilehtiperaludnalG

selcillofriahdna

ûíàëòñûâûçåëåÆ

ìîäÿðìèíäî

õûíüëàèëåòèïý

êîòåëê

elgniserasdnalG - wor

lailehtipehtiwdeyalni

sllec

éûòñèçåëåÆ

íåíåìçèåíéèëåòèïý

raludnalgdegnahcnU

muilehtipe

îâòñå÷èëîK

õûíüëàèëåòèïý

õûòñèçåëåæâêîòåëê

õàðóòêóðòñ

îíå÷èëåâó

forebmundesaercnI

nislleclailehtipe

serutcurtsraludnalg

éûòñèçåëåÆ

íåíåìçèåíéèëåòèïý

raludnalgdegnahcnU

muilehtipe

éûòñèçåëåÆ

íåíåìçèåíéèëåòèïý

raludnalgdegnahcnU

muilehtipe

åûíâèòêóðòñåÄ

âÿèíåíåìçè

õûòñèçåëåæ

õàðóòêóðòñ

nisegnahcevitcurtseD

serutcurtsraludnalg

éûòñèçåëåÆ

íåíåìçèåíéèëåòèïý

raludnalgdegnahcnU

muilehtipe

На 14-е сутки культивирования лоскутов кожи

без препарата ЛККЧ отмечалось уменьшение раз-

меров эпидермиса по сравнению с нормальной ко-

жей. Дермоэпидермальная граница контурирована

нечетко. В дерме структура соединительно-ткан-

ных волокон соответствовала нормальной коже

(рис. 4). Количество фибробластов достоверно

увеличивалось (Р < 0,05) по сравнению с нормаль-

ной кожей (таблица). В железах (потовых и саль-

ных), а также в волосяных фолликулах наблюда-

лась пролиферация эпителиальных клеток.

На 14-е сутки культивирования кожи с препара-

том ЛККЧ (рис. 5) размеры эпидермиса увеличива-

лись по сравнению с группой II в тот же срок куль-

тивирования, однако дифференциация его клеточ-

ных слоев была затруднена. В ростковом слое эпи-

дермиса обнаружены клетки в состоянии митоза.

Клетки базального слоя эпидермиса имели гипер-

хромные ядра и гиперацидофильную цитоплазму.

Дермоэпидермальная граница контурирована. В

дерме достоверно увеличивалось количество фиб-

робластов (Р < 0,05, таблица) по сравнению с их

содержанием в коже групп I и II, непосредственно

в сосочковом слое дермы. Фибробласты имели

гиперхромные ядра. Соединительная ткань была

представлена плотно расположенными пучками

коллагеновых и эластиновых волокон. Увеличива-

лось количество клеточных элементов, формирую-

щих волосяные и железистые структуры.

На 21-е сутки культивирования фрагментов

кожи группы II

без ЛККЧ в коже отмечены очаги

микронекроза. В эпидермисе увеличивались меж-

клеточные пространства, плохо дифференцирова-

лись слои, в клеточных элементах продолжались

Рис. 3. Кожа группы III на 7-е сутки культивирования в

присутствии препарата ЛККЧ (опыт). Окраска гемато-

ксилином и эозином, ×400.

Fig. 3. The 3

group’s skin to the 7

culturing day at the

presence of LHCB preparation (experiment). Staining with

hematoxylin and eosin, ×400.

Рис. 4. Кожа группы II на 14-е сутки культивирования

(контроль). Окраска гематоксилином и эозином, ×240.

Fig. 4. The 2

group’s skin to the 14

culturing day (con-

trol). Staining with hematoxylin and eosin, ×240.

growth epidermal layer the cells in mitotic stage were

revealed. Cells of basal epidermal layer had the hyper-

chromic nuclei and hyperacidophilic cytoplasm. Der-

moepidermal interface was contoured. Fibroblast num-

ber statistically and significantly increased (P < 0.05,

Table) compared to their content in skin of the 1

and

groups, mostly in papillary derma layer. Fibroblasts

had hyperchromic nuclei. Connective tissue was repre-

sented with the tightly located bunches of collagenous

and elastin fibers. There was the augmentation of the

amount of cell elements, forming hair and glandular

structures.

To the 21

day of skin fragment culturing of the

group free of LHCB, the micronecrotic foci were

Рис. 5. Кожа группы III на 14-е сутки культивирования

в присутствии препарата ЛККЧ (опыт). Окраска гемато-

ксилином и эозином, ×120.

Fig. 5. The 3

group’s skin to the 14

culturing day at the

presence of LHCB preparation (experiment). Staining with

hematoxylin and eosin, ×120.

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

дистрофические и некротические процессы

(рис. 6). Ядра эпителиальных клеток в большин-

стве наблюдений были пикнотичны, цитоплазма

их вакуолизирована. Отмечалась нечеткость

границы между эпидермисом и дермой, наблюда-

лись единичные очаги клеточного детрита. В дерме

происходила дезорганизация соединительной

ткани в виде гомогенизации и глыбчатого распада

коллагеновых и эластиновых волокон, количество

фибробластов среди них достоверно (Р < 0,05)

уменьшалось по сравнению с их содержанием в

нормальной коже и в образцах кожи контрольной

группы в предыдущие сроки культивирования

(таблица). Наблюдались отечность и деструкция

железистых структур и волосяных фолликулов.

При культивировании фрагментов кожи группы

III с добавлением ЛККЧ на 21-е сутки только в

отдельных участках отмечались отслоение эпидер-

миса и микроочаги клеточного детрита (рис. 7).

Толщина эпидермиса кожных эксплантатов досто-

верно не изменялась по сравнению с 14 сутками

культивирования, клетки базального слоя остава-

лись активными. Граница между эпидермисом и

дермой была четко выражена. В дерме сохранялось

достоверно высокое (Р < 0,05) количество фибро-

бластов по сравнению с их количеством в коже

групп I и II в предыдущие сроки наблюдения (таб-

лица). В сетчатом слое дермы четко контурирова-

лись коллагеновые и эластиновые волокна, однако

в отдельных участках их плотность уменьшалась

по сравнению с 14 сутками культивирования, тогда

как в других участках фрагментов кожи сохраня-

лась плотная волокнистая структура соединитель-

ной ткани. Морфология дериватов дермы не изме-

нялась.

Рис. 7. Кожа группы III на 21-е сутки культивирования

в присутствии препарата ЛККЧ (опыт). Окраска гемато-

ксилином и эозином, ×240.

Fig. 7. The 3

group’s skin to the 21

culturing day at the

presence of LHCB preparation (control). Staining with

hematoxylin and eosin, ×240.

Рис. 6. Кожа группы II на 21-е сутки культивирования

(контроль). Окраска гематоксилином и эозином, ×120.

Fig. 6. The 2

group’s skin to the 21

culturing day (con-

trol). Staining with hematoxylin and eosin, ×120.

noted in a skin. The intercellular spaces were increased

in epidermis, the layers were poorly differentiated, the

dystrophic and necrotic processes were in progress in

cell elements (Fig. 6). Epithelial cell nuclei in the

majority of observations were picnotic with vacuolated

cytoplasm. A vague interface between epidermis and

derma was observed, the single foci of cell detritus

were noted. The disorganisation of connective tissue

in the form of homogenisation and clod-like decay of

collagenous and elastin fibers occurred, the fibroblast

amount between them statistically and significantly

(P < 0.05) reduced if compared to their content in nor-

mal skin and the control group’s skin samples in pre-

vious culturing terms (Table). The swelling and dest-

ruction in glandular structures and hair follicles were

observed.

When culturing the 3

group’s skin fragments with

LHCB addition, the exfoliation and cell detritus

microfoci were noted only in some sites to the 21

day (Fig. 7). Epidermis thickness of skin explants was

statistically and significantly unchanged compared to

the 14

culturing day, cells of basal layer remained

active. The interface between epidermis and derma

was distinctly manifested. Statistically and significant-

ly high (P < 0.05) fibroblast number was preserved in

derma if compared to their amount in the skin of the

and 2

groups within previous observation terms

(Table). In a retinal dermal layer the collagenous and

elastin fibers were distinctly contoured, but in some

sites their density reduced compared to the 14

observation days, meanwhile in other sites of skin

fragments a dense fibrous structure of connective

tissue was preserved. The morphology of dermal deri-

vates was unchanged.

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹1

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹1

Âûâîäû

Описанный вариант культивирования позволяет

поддерживать in vitro фрагменты кожи в течение

14 суток практически без изменения их гистологи-

ческого строения и может использоваться как

модель для изучения влияния различных препара-

тов на свойства эксплантатов кожи.

При культивировании фрагментов кожи in vitro

препарат ЛККЧ, внесенный в среду культивиро-

вания, обеспечивает возможность поддерживать

фрагменты кожи в жизнеспособном состоянии в

течение 21 суток.

В присутствии ЛККЧ увеличивается количество

фибробластов и волокнистых структур в дерме, что

позволяет предполагать эффект стимуляции про-

цессов пролиферации и биосинтетической функ-

ции фибробластов.

Под влиянием ЛККЧ увеличиваются количест-

во пролиферирующих клеток в кожных экспланта-

тах, культивируемых in vitro, а также количество

волосяных фолликулов.

Литература

Волков А.В. Краткий обзор коммерчески доступных кле-

точных продуктов для восстановления кожных покровов //

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.–

2007.– №4 (6).– С. 62–65.

Лакин Г.Ф. Биометрия.– М.: Высш. школа, 1980.– 295 с.

Морозова Р.П., Козулина Е.П., Николенко И.А. Плацента –

источник биологически активных веществ // Укр. биохим.

журнал.– 1999.– Т. 71, №4.– С. 21–29.

Цуцаева А.А., Кудокоцева О.В., Щеглов А.В. и др. Кордовая

кровь как компонент поддерживающей терапии // Пробл.

криобиологии.– 2001.– №3.– С. 93–99.

Цуцаєва А.О., Глушко Т.О., Лобасенко Н.П. та інш. Гемо-

корд – препарат комплексної терапії // Трансплантологія.–

2003.– Т. 4, №1.– С. 46–48.

Badiavas E.V., Abedi M., Butmarc J. et al. Participation of

bone marrow derived cells in cutaneous wound healing // J.

Cell. Physiol.– 2003.– Vol. 196, N2.– P. 245–250.

Hematti P., Sloand E.M., Carvallo C.A. et al. Absence of donor-

derived keratinocyte stem cells in skin tissues cultured from

patients after mobilized peripheral blood hematopoetic stem

cell transplantation // Exp. Hematol.– 2002.– Vol. 30, N8.–

P. 943–949.

Krause D.S., Theise N.D., Collector M.I. et al. Multi-organ,

multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived

stem cell // Cell.– 2001.– Vol. 105, N3.– P. 369–378.

Поступила 04.06.2008

Рецензент Т.М. Шарлай

References

Volkov A.V. Brief review of commercially available cell

products to recover skin integuments // Cell transplantology

and tissue engineering.– 2007.– N4 (6).– P. 62–65.

Lakin G.F. Biometry.– Moscow: Vysshaya shkola, 1980.– 295p.

Morozova R.P., Kozulina E.P., Nikolenko I.A. Placenta is the

source of biologically active substances // Ukr. Biokhim. Zh.–

1999.– Vol. 71, N4.– P. 21–29.

Tsutsayeva A.A., Kudokotseva O.V., Scheglov A.V. et al. Cord

blood as a component of supporting therapy // Problems of

Cryobiology.– 2001.– N3.– P. 93–99.

Tsutsayeva A.O., Glushko T.O., Lobasenko N.P. et al.

Hemocord is the preparation of a combined therapy //

Transplantologiya.– 2003.– Vol. 4, N1.– P. 46–48.

Badiavas E.V., Abedi M., Butmarc J. et al. Participation of

bone marrow derived cells in cutaneous wound healing // J.

Cell. Physiol.– 2003.– Vol. 196, N2.– P. 245–250.

Hematti P., Sloand E.M., Carvallo C.A. et al. Absence of donor-

derived keratinocyte stem cells in skin tissues cultured from

patients after mobilized peripheral blood hematopoetic stem

cell transplantation // Exp. Hematol.– 2002.– Vol. 30, N8.–

P. 943–949.

Krause D.S., Theise N.D., Collector M.I. et al. Multi-organ,

multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived

stem cell // Cell.– 2001.– Vol. 105, N3.– P. 369–378.

Accepted in 04.06.2008

Conclusions

The described version of culturing enables the in

vitro maintaining of skin fragments within 14 days

with their practically unchanged histological structure

and may be used as the model to study the effect of

different preparations on skin explant peculiarities.

During skin fragment in vitro culturing the LHCB

preparation, added into culturing medium, provides

the possibility to maintain the skin fragments in a

viable state for 21 days.

At the LHCB presence the number of fibroblasts

and fibrous structures in derma augments, that enables

to assume the stimulation effect of proliferation

processes and fibroblasts’ biosynthetic function.

Under LHCB effect there is an increase in the

number of proliferating cells in skin explants, in vitro

cultured, as well as the augmentation of hair follicle

number.