Журнал Биотехнологии. Теория и практика. 1, 2010 г

Подождите немного. Документ загружается.

51Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

25. Tabaeezadeh Z., Khosh-Khui M. Anther culture of rosa // Sci. Horticult. – 1981. – Vol. 15 (1). – P.

61-66.

26. Arene L., Pellogrino C., Gudin S. A comparison of somaclonal variation level of Rosa hybrida L. cv.

Meirutral plants regenerated from callus or direct induction from different vegetative and embryonic

tissues // Euphytica. – 1993. – Vol. 71. – P. 83-90.

27. Dohm, A., Ludwig, C., Nehring, K., Debener, T. Somatic embryogenesis in roses // Acta Hort. –

2001. – Vol. 547. – P. 341– 347.

28. Asano, G., Tanimoto, S. Agrobacterium-mediated transformation and transgenic plant regeneration

from embryogenic calli derived from an immature seed produced from miniature rose cultivar

‘Shortcake’ // Plant Biotechnol. – 2003. – Vol. 20 (4). – P. 291-296.

29. Furuichi T., Jyutori H. On some conditions for root induction from shoots of rose in vitro and for

subsequent acclimatization of the plantlets potted-up // Bull. Kagawa Agric. Exp. Stn. – 1994. – N.

45. – P. 71-77. In Vitro Cell Dev Biol Plant. – 2006. – Vol. 42 (2). – P. 124-127.

30. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и

биохимии растений. – Киев: Наукова Думка. – 1980. – 488 с.

31. Bressan, R.H., Kim, Y.J., Hyndman, S.E., Hasegawa, P.M., Bressan, R.A. Factors affecting in vitro

propagation of rose // J. Amer. Soc. Hort. Sci. – 1982. – Vol. 107. – P. 979-990.

32. Pati, P.K., Sharma, M., Sood, A., Ahuja, P.S. Direct shoot regeneration from leaf explants of R.

damascena Mill // In Vitro Cell Dev Biol Plant. – 2004. – Vol. 40 (2). – P. 192–195.

33. Roy P.K., Manum A.N.K., Ahmed G. In vitro plantlets regeneration of rose // Plant Tissue Cult. –

2004. – Vol. 14 (2). – P.149-154.

34. Rosa Z.S., Belarmino M.M. In vitro culture of rose species (Rosa spp.) via axillary bud growth //

Annals of Tropical Research. – 2007. – Vol. 29 (1). – P. 57-64.

35. Kamo K., Jones B., Bolar J., Smith F. Regeneretion from long-term embryogenic callus of the Rosa

hybrida cultivar Kardinal // In vitro Cell. and Develop. Biol. – Plant. – 2005. – Vol. 41 (1). – P. 32-36.

36. Kaur N., Pati P.K., Sharma M., Ahuja P.S. Somatic embryogenesis from immature zygotic embryos of

Rosa bourboniana Desp. // In Vitro Cell Dev Biol Plant. – 2006. – Vol. 42 (2). – P. 124-127.

37. Jabbarzadeh, Z., Khosh-Khui, M. Factors effecting tissue culture of Damask rose (Rosa Damascena

Mill.) // Sci. Hort. – 2005. – Vol. 105. – P. 475-482.

38. Bharadwaj R., Singh S.K., Pal S., Kumar S. An improved protocol for micro-propagation of miniature

rose (Rosa chinensis Jacq. var. minima) cultivars // Journal of Ornamental Horticulture. – 2006. –

Vol. 9 (4). – P. 238-242.

39. Pati, P.K., Sharma, M., Ahuja, P.S. 2001. Micropropagation, protoplast culture and its implications in

the improvement of scented rose // Acta Hortic. – 2001. – Vol. 547. – P. 147–58.

40. Nikbakht A., Ka M., Mirmasoumi M., Babalar M. Micropropagation of damask rose (Rosa

damascene Mill.) cvs Azaran and Ghamsar // International. J. of Agricult. and Biol. – 2005. – Vol. 7

(4). – P. 535-538.

41. Sarasan V., Roberts A.V., Rout G.R. Methyl laurate and 6-benzyladenine promote the germination of

somayic embryos of a hybrid rose // Plant Cell Reports. – 2001. – Vol. 20. – P. 183-186.

42. Vu N., Anh P., Nhut D. The role of sucrose and different cytokinins in the in vitro oral mrphogenesis

of rose (hybrid tea) cv. “Firs Prize” // Plant Cell, Tiss. and Org. Cult. – 2006. – Vol. 87 (3). – P. 315-

320.

43. Kunitake, H., Imamizo, H., Mii, M. Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature

seed-derived calli of rose (Rosa rugosa Thunb) // Plant Sci. – 1993. – Vol. 90. – P. 187-194.

44. Hsia, C., Korban, S. Organogenesis and somatic embryogenesis in callus cultures of Rosa hybrida

and Rosa chinensis minima // Plant Cell Tiss. and Org. Cult. – 1996. – Vol. 44. – P. 1-6.

45. Davies, D.R. Rapid propagation of roses in vitro // Sci. Hortic. – 1980. – Vol. 13. – P. 385-389.

46. Dubois, L.A.M., Roggermans, J., Soyeurt, G., Vries, D.P. Comparison of the growth and development

of dwarf rose cultivars propagated in vitro and in vivo by softwood cuttings // Sci. Hort. – 1988. – Vol.

35. – P. 293-299.

47. Ibrahim R., Debergh P.C. Factors controlling high efciency adventitious bud formation and plant

regeneration from in vitro leaf explants of roses (Rosa hybrida L.) // Scientia Horticulturae. – 2001. –

Vol. 88 (1). – P. 41-57.

52 Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

48. Kuusiene S., Kandzezauskaite M. The inuence of genotype and explant for callus induction and

proliferation of rosa oribunda // Proc. of IV Int. Symp. On In Vitro Culture and Horticultural Breeding. –

2001. – P. 560.

49. Li X., Krasnyanski S.F., Korban S.S. Somatic embryogenesis, secondary somatic embryogenesis, and

shoot organogenesis in rosa

Journal of Plant Physiology, 2002, Vol. 159, N 3. – P. 313-319.

50. Ma Y., Byrne D.H., Chen J. Propagation of rose species in vitro // In Vitro Cell Dev Biol Plant. –

1996. – Vol. 32. – P. 103-108.

51. Popowich E.A., Brel N.C. Growth and micropropagation of lilac and rose aseptic cultures for

prolongating cultivation studying // Proc. of 9

Int. Conf. of Horticult. – 2001. – Vol. 3. – P. 665-668.

52. Acker C.A.M. Effect of temperature on development and growth potential of axillary buds in roses //

Sci. Horticult. – 1995. – Vol. 63 (3-4). – P. 241-250.

53. Leyhe, U., Horn, W. A. Contribution to micropropagation of Rosa hybrida // Gartenbauwissenschaft

. – 1994. – Vol. 59(2). – P. 85-88.

54. Rout, G.R., Samantaray, S., Mottey, J., Das, P. Biotechnology of the rose: a review of recent progress

// Sci. Hort. – 1999. – Vol. 81. – P. 201–228.

55. Bredmose N., Hansen J., Nielsen J. Factors intrinsic to the axillary bud determine topophysic effects

on bud and shoot growth and ower development in Rosa hybrida // Int. J. Plant. Sci. – 1990. – Vol.

160 (5). – P. 819-825.

56. Barna K.S., Wakhlu A.K. Effects of thidiazuron on micropropagation of rose // In Vitro Cell Dev Biol

Plant. – 1995. – Vol. 31 (1). – P. 44-46.

57. Kozai, T., Kubota, C., Zobayed, S.M.A., Nguyen, T.Q., Afreen-Zobayed, F., Heo J. Developing a

mass propagation system of woody plants. – In: Challenge of plant and agriculture sciences to the

crisis of biosphere on the earth in the 21st century. Edd. Watanabe K, Komamine A. – 2000. – P.

293–306.

58. Chavan D.K., Shah M.K., Mathur R.C. In vitro propagation of hybrid tea rose varieties for commercial

cultivation // Phytomorphology. – 2007. – Vol. 57 (1-2). – P. 85-90.

Түйін

Мақалада in vitro жағдайында раушандар ұлпаларының өсуі мен дамуына әсер ететін

факторлар анықталған: өсімдік материалды залалсандыру, экспланттардың түрі, қөректік

орталардың құрамы, донор өсімдіктер генотипы, өсімдіктерді in vitro өсіруге әсерететің жағдайлар

мен әдістер, эксплантардың даму сатысы және донор өсімдіктердың жасы.

Summary

In the present article the factors affecting to growth and development of tissue culture of roses in

vitro, include: methods of plant material sterilization, origin of explants, nutrient media compounds, donor

plant genotype, conditions and methods of explants growing, stage of explants development and age of

donor plants is discussed.

53Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

УДК 579.083.13

ОЦеНКа НеКОтОрыХ ПрОБиОтичеСКиХ СВОйСтВ

BACillus suBtilis

М.Ж. Мынбаева, С.С. Ануарбекова, К.Х. Алмагамбетов

lcm@biocenter.kz

ДГП «Республиканская коллекция микроорганизмов», г. Астана

В данной работе представлены результаты изучения адгезивной, протеолитической, антагонистической

активности и антибиотикочувствительности 47 бактерий рода Bacillus. выделенных из почвы, растений,

зерна пшеницы, муки и хлебобулочных изделий. В результате было получено, что исследованные культуры

высокоадгезивные к эритроцитам барана, обладают протеолитической активностью и антагонистической

активностью по отношению ко всем изученным в работе условно-патогенным микроорганизмам. Все

культуры были чувствительны к офлоксацину, амоксиклаву, рокситромицину, гентамицину.

Пробиотики - это бактерийные пре-

параты из живых микробных культур,

предназначенные для коррекции микро-

флоры хозяина и лечения ряда заболеваний.

Они в отличие от антибиотиков не

оказывают отрицательного воздействия

на нормальную микрофлору, поэтому их

широко применяют для профилактики и

лечения дисбактериозов. В то же время

эти биопрепараты характеризуются выра-

женным клиническим эффектом при

лечении (реконвалесценции) ряда острых

кишечных инфекций. Много лет в медицине

широко используются лактобактерин,

бифидум-бактерин, колибактерин, бификол,

ацилакт и другие, основой которых

являются бактерии рода Lactobacillus,

Bidobacterium и вида Escherichia coli [1, 2].

Во всем мире ведутся масштабные

исследования по созданию новых, более

активных пробиотиков. В последнее вре-

мя ведутся работы по использованию в

качестве источников пробиотического

препарата бактерий рода Bacillus, на

их основе разработано более десятка

эффективных препаратов: биоспорин, ги-

неспорин, споробактерин, бактиспорин,

энтерогермин, флонивин, бактисубтил, це-

реобиоген. Они эффективно применяются

в медицинской практике для лечения

стоматитов, гингивитов, ревматических

артритов, гнойных осложнений в хирургии,

в гинекологии, инфекционных заболеваний,

энтеритов, дисбактериозов, также эффек-

тивно используются в ветеринарии [3-9].

Итак, разработан целый ряд про-

биотиков из бацилл для ветеринарии и

медицины, однако продолжается поиск

продуцентов с целью получения препаратов

с новыми или улучшенными свойствами.

Таким образом, перед нами была

поставлена задача, которая заключалась

в поиске бацилл с возможными пробио-

тическими свойствами.

Материалы и методы

В работе использовались 47 изолятов

бацилл, выделенных из различных эко ло-

гических ниш. По фенотипическим приз-

накам и результатам секвенирования с

ис пользованием 16S рРНК они были отне-

сены к виду Bacillus subtilis. Нами были

изучены адгезия, протеолитическая актив-

ность, антагонизм к различным условно-

патогенным микроорганизмам и чувстви-

тельность к антибиотикам.

Метод оценки адгезии по J.P. Duguid, в

модификации Н.Н. Костюковой

Для оценки адгезивной активности

использовали смыв культуры густотой 5 ЕД

по оптическому стандарту ГИСК им. Л.А. Та -

расевича и 0,5% взвесь эритроцитов

человека, барана, курицы. В U-образные

лунки планшета Такачи вносили разведения

культуры в объеме 0,025 мл, в 1 лунку -

54 Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

цельную взвесь, затем титровали путем

последующего переноса по 0,025 мл

для получения разведений 1:2, 1:4 и 1:8.

Закапывали 0,5% взвесь эритроцитов в

объеме, равном объему взвеси культуры.

Смеси выдерживали 2 часа при температуре

37°С, затем оставляли на ночь при 4°С [10].

Метод определения протеолитической

активности

К 100 мл стерильного питательного

агара добавляли 30 мл снятого стерильного

молока, затем разливали в чашки Петри.

Исследуемые культуры микробов засевали

бляшками (18-24 часа при 37°С).

Бактерии, продуцирующие протео-

литический фермент, провоцируют пепто-

низацию молочного белка - казеина, в

результате чего вокруг этих колоний

образуются прозрачные зоны, чётко

выделяющиеся на общем молочно-мутном

фоне среды [10, 11].

Метод определения чувствительности

микроорганизмов к антибиотикам

Для определения чувствительности

микробов к антибиотикам использовался

метод диффузии в агар с применением

дисков. Для засева чашек используют чаще

всего 18-20-часовые (при интенсивном

росте 4-5-часовые, при замедленном росте

2-3-суточные) бульонные и агаровые

культуры микробов. Из агаровых культур

готовят микробную взвесь, содержащую 1

млрд. микробных тел в 1 мл.

На поверхность подсушенной среды

наносят исследуемую культуру микробов

в объеме 1 мл. Посредством покачивания

чашки культуру равномерно распределяют

по поверхности среды с последующим

отсасыванием избытка жидкости пипеткой.

Засеянные чашки 30-40 мин подсушивают

при комнатной температуре, затем на

поверхность засеянной и подсушенной

среды с помощью стерильного остро-

конечного пинцета кладут диски, пропи-

танные разными антибиотиками. Каждая

чашка может служить для одновременного

испытания штамма к действию 5-6

антибиотиков. Засеянные чашки с нане-

сенными на них дисками на 18-24 ч

помещают в термостат при 37°С вверх

дном, чтобы избежать попадания конден-

сационной воды на поверхность посевов.

Бактерии, чувствительные к анти био-

тикам, образуют вокруг соответ ствующих

дисков зоны угнетения роста.

По степени чувствительности бакте-

рии были разделены на чувстви тельные,

умеренно устойчивые и устой чивые [12, 13].

Метод определения антагонис ти ческой

активности

Суточную культуру пересевали петлей

методом укола на чашки Петри с 2%

мясопептонным агаром (МПА). После су-

точной инкубации при 37°С, с целью унич-

тожения выросших культур, чашку Петри

выдерживали в парах хлороформа (1 мл на

крышку чашки) 30 минут, проветривали 20

минут. Затем поверхность чашек заливали

вторым тонким слоем расплавленного и

остуженного до 46°С 0,7% МПА, смешанной

с взвесью индикаторной культуры (0,1 мл

взвеси индикаторной культуры бактерий

в концентрации 1×10

мкр.кл./мл). Об

антагонистической активности судили по

зоне отсутствия роста тест-штаммов вокруг

колонии испытуемого штамма бацилл.

Антагонистическая активность ис-

следованных культур бацилл считалась

нулевой при ширине зоны отсутствия роста

тест-штаммов до 1,0 мм, низкой – при 1,1-

4,9 мм, средней - при 5,0-8,9 мм, высокой –

при 9,0 мм и более [14].

результаты и обсуждения

Нами была изучена адгезивная актив-

ность у штаммов бацилл к эритроцитам

человека, барана, курицы. На рисунке 1

продемонстрирована реакция адгезии на

стекле с эритроцитами человека.

Это качественная реакция, по которой

можно определить, обладают ли изучаемые

объекты способностью взаимодействовать

с объектами, имеющими идентичные сайты

узнавания.

55Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

Все культуры обладали способностью

к адгезии с клетками крови данных макро-

организмов.

В дальнейшем адгезивную активность

изучали в реакции гемагглютинации по J.P.

Duguid, в модификации Н.Н. Костюковой,

по результатам которой мы можем оценить

степень адгезивной активности.

Рис. 1. реакция адгезии клеток бацилл с

эритроцитами человека на стекле

По степени адгезии штаммы были

разделены на три группы: слабоадгезивные

– агглютинирующие эритроциты только в

неразведенной взвеси, среднеадгезивные,

дающие гемагглютинацию в разведении

взвеси 1:2 и 1:4, и высокоадгезивные,

вызывающие гемагглютинацию в разве-

дении 1:8.

При этом высокую степень адгезии

показали: к эритроцитам барана – все

изоляты, к эритроцитам человека – 14, к

эритроцитам курицы – 18 исследованных

культур бацилл.

Таким образом, более активные из

47 являются 14, которые подвергнутся

дальнейшему анализу с учетом оценки

других свойств.

Протеолиз - это процесс расщепления

белков и пептидов в организме с участием

специальных ферментов. Одна из важ нейших

ролей протеолиза состоит в том, что он

приводит к необратимой инактивации белков

и, таким образом, участвует в кругообороте

белков в клетке. Существует множество

ферментов, осуществляющих протеолиз -

это разнообразные протеазы (лизосомные,

митохондриальные, кальций-зависимые и

др.), а также сложные белковые комплексы,

«протеасомы». У эукариот протеасомы

присутствуют в цитозоле и ядрах. Протео-

литические ферменты в комплексе с другими

свойствами микро организма оказывают

пробио тический эффект, но также могут

приме няться самостоя тельно в лечении

различных заболеваний.

Протеолитическая активность, опре-

деленная на молочном агаре Эйкмана,

проявилась у всех 47 исследуемых культур.

Наиболее активные штаммы: Bacillus subtilis

5 ПП, 7 ПП, 33 ПП, 37 ПП, 42 ПП, 45 ПП,

46 ПП, 47 ПП. По полученным результатам

мы разделили их на высокую степень - 9

штаммов с зоной протеолиза от 25 до 43 мм,

среднюю - 34 штамма с зоной протеолиза от

15 до 25 мм и низкую - 4 штамма с зоной

протеолиза от 15 до 10 мм (рис. 2).

Основной проблемой последних

лет является широкое распространение

резистентных форм патогенных микро-

организмов и снижение эффективности

ряда антибиотиков. Главную, а порой и

решающую роль в эффективности лечения

играет определение чувствительности бак-

терий к антибактериальным препаратам.

Для изучения чувствительности бацилл

к антибиотикам были использованы

7 антибиотиков: офлоксацин - группа

фторхинолонов, амоксиклав - группа

амино пенициллинов, полимиксин - группа

полипептидов, линкомицин - группа

линкозамидов, рокситромицин - группа

макролидов, гентамицин - группа амино-

глюкозидов, цефазолин - группа цефа-

лоспоринов 2-го поколения, результаты

этой части работы отражены в таблице 1.

Все исследуемые культуры обладали

антибиотикочувствительностью. В основ-

ном исследуемые штаммы были чувстви-

тельны к офлокацину, амоксиклаву, рок-

ситромицину, гентамицину. К поли миксину

и цефазолину бациллы были чувствительны

и умеренно устойчивыми. А к линкомицину

основная часть исследован ных культур

были устойчивы, умеренно устойчивые и

небольшое количество чувстви тельны.

56 Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

Таблица 1

изучение чувствительности к антибиотикам штаммов Bacillus subtilis

Наименование

антибиотика

Контроль Опыт

абс Зона задержки роста (мм) % абс Зона задержки роста (мм) %

Офлоксацин 6 32±0,7 100 47 35±0,3* 100

Амоксиклаф 6 27±1,0 100 47 29±0,5** 100

Рокситромицин 6 29±0,6 100 47 32±0,3* 100

Гентамицин 6 29±0,6 100 47 30±0,3** 100

Линкомицин 6 18±1,0 100 47 20±0,4 100

Цефазолин 6 17±1,0 100 47 20±0,4** 100

Полимиксин 6 11±0,7 100 47 13±0,2*** 100

Примечание: * р < 0,001; ** р < 0,05; *** р < 0,02

Рис. 2. Протеолитическая активность бацилл

на молочном агаре Эйкмана

Рис. 3. антагонистическая активность бацилл,

выделенных из различных экологических ниш

Антагонизм – одна из состав ляющих

пробиотического действия микро орга-

низ мов. Антагонистическая ак тивность

опре делялась методом отсро ченного анта-

гонизма.

Была изучена антагонистическая ак-

тивность бацилл, выделенных из различных

экологических ниш по отношению к тест-

культурам: C. utilis ЛИА-01 Y-BRM – 0097,

E.сoli 157 B-BRM – 0040, S. typhimurium ТА

- 98 B-BRM – 0162, S. аureus 6538 B-BRM –

0039, P. mirabilis 257 B-BRM – 0037, нахо-

дящихся на хранении в Республиканской

коллекции микроорганизмов. Также анта-

гонистическую активность изучали к кли-

нической культуре Ps. aeruginosa, выде-

ленной из кишечника больного (рис. 3).

Нами установлено, что антагонис-

тической активностью обладают культуры

по отношению ко всем изученным в работе

условно-патогенным микроорганизмам.

Получены следующие результаты. Все

бациллы подавляли Ps. aeruginosa – 100%,

размеры зоны колебались в пределах 10-

21 мм. C. utilis подавляли 79% штаммов,

размеры зоны колебались в пределах 2-17

мм. Количество активных штаммов по

отношению к P. mirabilis составило 76%,

размеры зоны колебались в пределах 6-60

мм. К E. сoli активность проявили 42%,

что соответствовало 20 штаммам, размеры

же зоны колебались в пределах 2-16 мм.

13 штаммов бацилл были активны по

отношению S.typhimurium, соответственно

это составило 28%, размеры зоны

колебались в пределах 1-11 мм. К S. аureus

антагонизм проявили 25% изученных нами

бацилл, т.е. 12 штаммов, размеры зоны

колебались в пределах 3-40 мм.

Таким образом, в результате данной

работы была изучена адгезивная, протео-

литическая, антагонистическая ак тивность

и антибиотикочувствительность, которая

выявила следующее: все изученные куль -

туры обладали всеми изученными свой-

ствами и подтверждается факт чувстви-

тельности культур к антибиотикам нового

поколения и постепенное развитие устой-

чивости.

Подводя итоги исследования, можно

утверждать о перспективности проводимых

57Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

исследований с целью разработки сырья

для биологически активных продуктов,

способствующих нормализации микро-

экологии кишечника человека и укрепления

его иммунной системы.

Литература

1. Подгорский В.С., Лясковский Т.В. Рекомендации международных организаций по оценке

пробиотических свойств препаратов // Микробиол. журн. - 2005. – 67, №6. – С. 104-109.

2. Смирнов В.В., Подгорский В.С., Коваленко Н.К. Пробиотики на основе живых культур

микроорганизмов // Микробиол. журн. - 2002. – 64, № 4. – С. 62-80.

3. Шендеров Б.А. Социально-экологические и клинические последствия дисбаланса микробной

экологии человека и животных // Медицинская микробная экология и функциональное

питание. Т. 2. - М.: ГРАНТЪ, 1998. - 416 с.

4. Ноздрин Г.Л., Крачковская В.А., Наумкин И.В. и др. // Акт. вопр. ветеринарии / Тез. докл. науч.-

практ. конф. факультета вет. мед. - Новосибирск: НГАУ, 1997. - С. 20-21.

5. Осипова И.Г., Сорокулова И.Б. Изучение безопасности бактерий рода Bacillus, составляющих

основу некоторых пробиотиков // Журн. микробиол., эпидемиол. - 1998. - № 6: - С. 68-71.

6. Резник С.Р., Вьюницкая В.А., Сорокулова И.Б. Биологические свойства споровых аэробных

бактерий, выделенных из организма человека и животных / Фитонциды. - Киев: Наукова думка,

1981. - С. 35-40.

7. Белявская В.А., Чердынцева Н.В., Бондаренко В.М. и др. Биологические аспекты интерферона,

продуцируемого рекомбинантными бактериями препарата пробиотика Субалина / Журн.

микробиол., 2003, №2. - С. 102-109.

8. Методы определения патогенных свойств возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний:

Метод. рекомен. для студ. мед. вузов и врачей инфекционистов, микробиологов, эпидемиологов,

гигие нистов / Под ред. Ш.И. Сарбасовой. – Астана, 2000. – 19 с.

9. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований / Изд. 4-е,

перераб. и доп. - М.: Медицина, 1978. - 394 с.

10. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования.

- М.: Медицина, 1982. – С. 168.

11. Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

методом диффузии в агаре с использованием дисков. Министерство здравоохранения СССР. -

М., 1983.

12. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / А.И. Нетрусов,

М.А. Егорова, Л.М. Захарчук и др.; Под ред. А.И. Нетрусова. – М.: Академия, 2005. - 608 с

Түйін

Бұл жұмыста топырақтан, өсімдіктерден, бидай дәндерінен, ұннан және нан өнімдерінен

бөлініп алынған Bacillus туысына жататын 47 бактериялардың адгезивты,протеолитикалық,

антогонистикалық белсенділігіне және антибиотиктерге сезімталдығына тексеру нәтижелері

берілген. Соның нәтижесінде зерттелген культуралар қой эритроциттеріне жоғары адгезивтілік

көрсетті және жұмыс барысында қолданылған барлық шартты – патогенді микроорганизмдердің

протеолитикалық және антогонистік белсенділігі анықталды. Офлоксацин, амоксиклав,

рокситромицин, гентамицинге барлық культуралар сезімтал болды.

Summary

In this article was given results of study of adhesion, proteolytic, antagonistic activity and sensivity to

antibiotic of 47 strains of Bacillus spp. isolated from the soils, plants, wheat our and wheat’s granules.

This study have show, that studied cultures have high adhesive property to sheeps red blood cells and

have an antagonistic and proteolytic activity to the all studied conditionally pathogenic microorganisms.

All studied cultures had high sensivity to the number of antibiotics:ooxacin, amoxylave, roxytromycine

and gentamycine.

58 Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

УДК 576.3.312:32

яДерНая траНСФОрМаЦия NiCOtiANA tABACuM НУКЛеОтиДНОй

ПОСЛеДОВатеЛьНОСтьЮ МеМБраННОГО ПрОтеиНа

BRuCEllA ABORtus OMP 16.

А.А. Чистякова

Евразийский национальный университет им. Л.Н. Гумилева, г. Астана

Данная работа была проведена в лаборатории «Молекулярной биологии и биотехнологии растений»

Дармштадского технологического университета (Германия), под непосредственным руководством моего

научного консультанта профессора Дармштадского технологического университета, руководителя

лаборатории – Prof. Dr. Dr. ch. Heribert Warzecha.

Введение

За последние несколько лет в ведущих

научно-исследовательских центрах мира

созданы трансгенные растения продуценты

широкого спектра гормонов, цитокинов,

факторов роста и ферментов, имеющих

потенциальное применение в фармакологии.

Все они не уступают по биологической

активности аналогам, получаемым в

фармакологической промышленности тра-

диционными способами [1].

Растения как «фабрики» для про-

дукции чужеродных иммуногенных бел-

ков – «растительные (съедобные) вакцины»

– имеют ряд преимуществ по сравне-

нию с клетками бактерий, дрожжей и

млеко питающих. Так, например, клетки

расте ний не содержат патогенных для

человека вирусов и прионов. Наработка

целевых вакцинных белков в растениях не

требует применения дорогостоящей аппа-

ратуры, культуральных сред и системы

стерильности. Стоимость выращивания

исходных опытных растений несравнимо

ниже стоимости культивирования клеток

бактерий, дрожжей или животных. Таким

образом, стоимость иммуногенных бел-

ков, выделяемых из растений, в 10-30 раз

ниже, чем при культивировании транс-

формированных бактерий [2].

В настоящее время уже получены и

изучаются «съедобные вакцины» против

вирусов бешенства, ящура, ВГВ и других

патогенных организмов. Исследования про-

водятся на основе трансгенных растений

картофеля, салата, кукурузы, шпината,

люцерны и др.

В качестве объектов нашего иссле-

дования были выбраны растение Nicotiana

tabacum и патогенная бактерия Brucella

abortus. При выборе растения мы руко-

водствовались тем, что оно должно было

быть легко возделываемым как в лабо-

раторных, так и в полевых условиях, а

также должно быть организмом, хорошо

изученным с молекулярно-генетической

точки зрения. Это условие необходимо

для успешного проведения с ним всего

комплекса генно-инженерных манипуляций.

Другой объект нашего исследования

– грамотрицательная бактерия Brucella

abortus, возбудитель бруцеллеза людей и

животных – был выбран по нескольким

причинам, главная из которых та, что до

сих пор не найдено вакцины, которая бы

полностью предохраняла от заболевания

привитых ею людей и животных [3]. В

силу сложности антигенной структуры

возбудителя, разнообразия и изменчивости

его антигенных свойств, а также высокой

вирулентности, вакцинные средства, при-

готовленные из него по традиционной

технологии, не безопасны для человека и при

вакцинации могут провоцировать развитие

инфекционного процесса. Практическое

использование таких вакцинных средств

приводило в большинстве случаев к

59Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

развитию вялотекущей бруцеллезной ин-

фекции с разнообразными осложнениями

аллергенного характера. В связи с этим,

задача нахождения альтернативных вари-

антов эффективной и безопасной вакцины

против бруцеллеза, способной решить

проблему защиты человека и животных

от патогенного возбудителя, остается

актуальной.

В данной работе описано проведенное

на базе лаборатории «Молекулярной био-

логии и биотехнологии растений», техно-

логического университета г. Дарм штадт

(Германия) исследование по изучению

ядерной трансформации Nicotiana tabacum

нуклеотидной последовательностью мем-

бранного иммуногенного белка Brucella

abortus Omp16. Среди способов генети-

ческой трансформации растений наиболее

эффективным и надежным считается

введение чужеродных генов, с помощью

Agrobacterium tumefaciens. При этом

чужеродные гены, как правило, стабильно

интегрируются и передаются от поколения

к поколению согласно законам Менделя

[4]. Данный метод основан на природной

способности Agrobacterium tumefaciens

проникать в ядро растительной клетки

и встраивать свою ДНК в геном клетки-

хозяина. Благодаря этому появляется реаль-

ная возможность модификации ядер ного

генома в соответствии с целями и задачами

экспериментатора.

Но здесь могут возникать некоторые

трудности. Очень часто экспрессионные

системы, идеальные для экспрессии

одного гена, оказываются совершенно

непригодными для экспрессии другого.

Кроме того, гиперпродуктивность неко-

торых генов может приводить к гибели

растения, так как синтезируемый белок

в большом количестве приобретает

токсичные свойства. Поэтому все спорные

моменты требовалось выяснить в ходе

предстоящего исследования.

Таким образом, целью нашего экс-

перимента являлась апробация моле ку-

лярного вектора pPSI, сконструи ро ван ного

на основе Т-области Ti-плаз ми ды Agrobac-

terium tumefaciens, пред наз на ченного для

осуществления про цесса ядерной транс-

формации Nicotiana tabacum, и получения

рекомбинантной ядер ной ДНК, стабильно

экспрессирующей целе вой иммуно генный

мембранный белок Brucella abortus Omp16.

Материалы и методы

В работе были использованы бакте-

риальные штаммы Escherichia coli ТОР10 и

Agrobacterium tumefaciens GV3101, а также

растения табака Nicotiana tabacum, которые

высаживали в виде семян непосредственно

на питательную агаризованную MS-среду,

и выращивали в течение 4-8 недель при

дневной (ночной) температуре +22ºC

(+16ºC), а также 16-часовом освещении

мощ ностью 6000 люкс в стерильных усло-

виях.

В качестве полноценной жидкой и

твердой (1,5% агар) среды для размножения

бактериальных культур использовали LB-

среду, в которую добавляли следующие

антибиотики: канамицин (Kan) - 100 мг/л,

рифампицин (Rif) - 100 мг/л и гентамицин

(Gent) – 100 мг/л. Для образования каллуса

использовали твердую (1,5% агар) RMOP-

среду, в которую добавляли канамицин (Kan)

- 100 мг/л и тикацелин (Tic) – 100 мг/л (для

подавления роста агробактерий). MS-среду

без добавления антибиотиков использова-

ли для выращивания из семян целого

растения Nicotiana tabacum в стерильных

услови ях [5].

Используемая в работе нуклеотидная

последовательность мембранного имму-

ногенного протеина Brucella abortus Omp16

была предоставлена нам в виде вектора

pO16 1421 (на основе вектора PCR-Blunt)

доктором Juliana Cassataro, работающей

в лаборатории иммуногенетики города

Буэнос-Айрес, Аргентина. В предостав-

ленном материале нуклеотидная последо-

вательность Omp16 синтезирована в

соот ветствии с таковой, представленной

в банке данных – Gene bank accession

number L 27996.1 – и доработана тем,

что на С-терминальном конце содержит

60 Биотехнология. Теория и практика. №1 2010

6 триплетов, кодирующих аминокислоту

гистидин (His-tag). Количество аминокислот

в белке – 152, вес – 21 килодальтон (кДа),

длина - 500 пар нуклеотидов (пн). Иммунные

свойства белка, кодируемого этой после-

довательностью, были апробированы на

мышах в вышеупомянутой лаборатории,

в результате чего была подтверждена им-

му ногенность синтезированного про теина

Omp16.

Для осуществления процесса ядер-

ной трансформации Nicotiana tabacum,

был использован молекулярный вектор

pPSI (рис. 1), любезно предос тав лен ный

профессором Dr.Ralf Kaldenhoff, лабо-

ратория иммуногенетики Дармштад ского

технологического университета (Гер мания).

Рис. 1. Векторная карта pPSI

Реакционная смесь для амплификации

гена Omp16 содержала: 1 мкл вектора pO16

1421(10 мМ раствор), 2 мкл дНТФ(10 мМ

раствор), по 2 мкл праймеров PO16 104

и PO19 204 (10 мМ раствор) и 1 мкл Taq

ДНК-полимеразы (2,5 ед.). Полимеразную

цепную реакцию (ПЦР) проводили в

течение 35 циклов (денатурация 1 мин при

94°С, отжиг 40 с при 62°С, синтез 1 мин

при 72°С) в амплификаторе “T-Gradient

Thermocycler” (“Biometra GmbH”, Герма-

ния). Продукты амплификации разделяли

электрофорезом в 1,0% агарозном геле

и окрашивали бромистым этидием. В

качестве маркера длины фрагмента ДНК

при электрофоретическом разделении век-

торных фрагментов использовали ДНК

фага λ, обработанного ферментом AvaII.

Клонируемые в клеточных культурах

Escherichia coli ТОР10 вектора очищали по

методу Birnboim & Doly [6].

ПЦР-продукт амплификации гена

Omp16 (Eluat), а также вектор pPSI были

подвержены ферментативному рас щеп-

лению рестриктазами по следующей схеме:

1 этап: 6 мкл – Miniprep pPSI (Eluat);

2 мкл - Tango Puffer; 1 мкл – XbaI; 1 мкл -

O. Полученную смесь инкубировали в

течение часа в термостате при температуре

+37ºС, затем на 20 минут на водяной бане

при температуре +65ºС.

2 этап: в эту смесь добавили 6 мкл -

O; 2 мкл – буфер-KpnI; 1 мкл – KpnI; 1

мкл – РНКза. Полученную новую смесь

инкубировали в термостате в течение часа

при температуре +37ºС. Затем фрагменты

рестрикции разделяли при помощи гель-

электрофореза, и необходимые участки

элюировали из геля при помощи Nucleo

Spin Extract II Kit (США) [7].

Продукты рестрикции: фрагмент ДНК,

несущий информацию о строении имму-

ногенного протеина Omp16, и лини аризи-

рованный вектор pPSI, были сшиты по

комплиментарным «липким концам». Реак-

цию осуществляли под контролем фермента

Т-4 лигазы: 6 мкл – Eluat (KpnI, XbaI);

2 мкл

- pPSI (KpnI, XbaI); 1 мкл – лигаза-буфер; 1

мкл - T-4 лигаза. Смесь инкубировалась не

менее часа при комнатной температуре [6].

Для трансформации культуры ком-

петентных клеток Escherichia coli TOP10

продуктами лигирования (pO16 7132), на

1-1,5 мкл плазмидного материала исполь-

зовали 50 мкл компетентных клеток

E.coli, хранящихся в морозильной камере

при -80ºС. После добавления плазмид

клетки погружали на 20 минут в лед,

затем переносили на 1 минуту на водяную

баню, нагретую до +42ºС (тепловой

шок). Затем к культуре клеток добавляли

500 мкл LB-среды без антибиотиков, и

оставляли в течение часа для инкубации

в термошейкере при температуре +37ºС.