Войнов Н.А., Волова Т.Г., Зобова Н.В. Современные проблемы и методы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»

1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 41

Молекулярное, или генетическое, клонирование – процесс создания ге-

нетически идентичных молекул ДНК – является основой молекулярной био-

логии, фундаментальным методом биотехнологических исследований, а так-

же основой развития и коммерциализации биотехнологии. Подавляющее

большинство практических приложений биотехнологии, начиная с разработ-

ки лекарственных препаратов и заканчивая созданием трансгенных культур,

основывается на методах генетического клонирования. С помощью молеку-

лярного клонирования стали возможными: идентификация, локализация и

описание генов; создание генетических карт и секвенирование целых гено-

мов; проведение параллелей между генами и ассоциированными с ними при-

знаками; установление молекулярной основы проявления признаков. Область

применения клонирования чрезвычайно широка.

К числу перспективных направлений биотехнологии относится моди-

фикация генома культурных растений с целью повышения урожайности и

улучшения их устойчивости к вредителям и неблагоприятным условиям

среды. Наибольший интерес вызывает, естественно, возможность трансфор-

мации однодольных растений (прежде всего, злаковых).

Трансформация генома высших растений реализуется двумя методами:

баллистическим и с использованием природной системы переноса генетиче-

ского материала – части Ti-плазмиды (Т-ДНК) – Agrobacterium tumefaciens –

возбудителя бактериального рака или корончатого галла у двудольных рас-

тений. В качестве маркерной системы используют гены антибиотикоустой-

чивости, а также новые системы – Lux-гены или ген бактериальной

β-глюкуронидазы, вызывающий окрашивание селективной среды.

Ti-плазмиды, модифицированные разными генами, переносят в растения.

Перенос генетической информации с помощью Ti-плазмиды осуществлен и

на примере однодольных растений: использовали ткани луковицы гладиолу-

са с удаленными боковыми частями. Цилиндрические эксплантанты заража-

ли вирулентными штаммами агробактерии, несущими Ti-плазмиду, которая

содержит гены, кодирующие синтез опинов; спустя 24 ч на поверхности за-

раженного растения появлялись опухоли. Специалисты Карнелского универ-

ситета (США) предложили новый метод – стрелять по клеткам растений

вольфрамовыми пулями, покрытыми генетическим материалом. «Обстрел»

клеток-хозяина происходит со скоростью свыше 1 000 км/ч миллионом ме-

таллических дробинок, покрытых слоем фрагментов ДНК; метод оказался

универсальным.

С помощью генетического конструирования стало возможным получе-

ние соле-, гербецидо- и морозоустойчивых растений. По оценкам специали-

стов, в США ежегодный ущерб от заморозков оценивается в 6 млрд дол. Ока-

залось, что наиболее активными центрами кристаллизации являются отдель-

ные бактерии (представители Pseudomonas, Erwinia), способные вызывать

образование льда при 0

С; их назвали INA-бактерии – активные кристалли-

заторы воды (Ice-nucleation Active). В этих бактериях идентифицирован спе-

цифический мембранный белок, вызывающий кристаллизацию; ice-гены бы-

ли клонированы и модифицированы. Удаление средней части привело к по-

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»

1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 42

тери способности экскретировать белок кристаллизации. В результате бакте-

рии с модифицированным ice-геном утратили способность кристаллизовать

воду при −1–5

С. Посев этих генетически модифицированных бактерий на

растения в момент распускания почек препятствует колонизации другими

бактериями, поэтому растения фактически иммунны для заражения INA-

бактериями дикого типа и им не страшны кратковременные заморозки.

Вторая волна «зеленой революции» ориентирована на получение гене-

тически модифицированных «самоудобряющихся» растений. Установлено,

что в составе генома азотфиксирующих симбиотических бактерий имеется

группа генов, ответственных за симбиоз с растениями и локализованных в

крупных симбиотических плазмидах pSym; процесс формирования клубень-

ков контролируют nod-гены и, наконец, nif-гены ответственны за синтез нит-

рогеназы, т.е. азотфиксацию. В настоящее время большие средства в США и

других странах вкладываются в программу получения трансгенных злаковых

с генами азотфиксации. Однако при переносе генов азотфиксации в высшие

растения, помимо трудностей генетического характера, имеются и другие.

Пока не изучена в должной мере регуляция взаимосвязи генов фиксации азо-

та с генами, ответственными за синтез переносчиков электронов и ко-

факторов, необходимых для функционирования фермента нитрогеназы. По-

следняя должна быть защищена от ингибирующего воздействия кислорода.

Ведутся также интенсивные исследования генетики растений для подбора

эффективных растений-хозяев, а также исследования, направленные на мо-

дификацию генома микроорганизмов для получения организмов, способных

существовать в симбиозе не только с бобовыми растениями (например, хлеб-

ными злаками). Фундаментальные исследования по переносу генов азотфик-

сации в высшие растения, по-видимому, приведут к многообещающим от-

крытиям и коренному перевороту практики азотного питания растений.

Второе, весьма важное направление применения генетической инжене-

рии, – придание культурным растениям устойчивости к заражению листог-

рызущими насекомыми. Природные фитопатогены, например бактерии

Bacillus thuringiensis (Bt), синтезирующие токсины, эффективные против

листогрызущих насекомых, стали источником генов для придания растениям

устойчивости к этим вредителям. Синтез токсинов Bt контролируется одним

геном, имеющиеся методы позволяют проводить работы, направленные на

улучшение существующих продуцентов и продуктов Bt. Известно, что гены,

контролирующие синтез кристаллов Bt, локализованы на небольшом числе

плазмид значительной молекулярной массы. Токсический белок, синтези-

руемый Bt, клонирован в E. coli и B. subtilis, его экспрессия получена даже в

течение вегетативной фазы роста. Есть сведения о клонировании белка, ток-

сичного для бабочек, в клетках табака. В выросшем целом растении табака

каждая клетка вырабатывала токсин. Таким образом, растение, приобретшее

токсин, само становится устойчивым к насекомым: поедая листья, гусеница

погибает, не причинив существенного вреда растению.

Американскими компаниями «Монсанто» и «Агроцетус» проведены

полевые испытания и районированы сорта хлопчатника, сои и ряда других

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»

1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 43

культур с внедренным в хромосому геномом Bt. Резистентность к гусеницам

передается семенам и последующим поколениям растений. Начато получе-

ние рассады трансгенного картофеля и томатов с внедренным геном Bt, ток-

сичного для чешуекрылых. Создан трансгенный инсектоустойчивый тополь с

внедренным геном антитрипсиназы в клетки тканей. Фермент снижает ус-

воение белка насекомыми, что приводит к сокращению популяции.

Клонированы гены устойчивости к гербицидам; их клонирование в

растения призвано обеспечить безопасность применения ядохимикатов в

сельском хозяйстве. Однако клонирование генов в культурные растения со-

пряжено с определенным риском. Опасения связаны с возможностями выхо-

да генетических векторов и трансгенных растений из-под контроля биотех-

нологов. Поэтому высказываются опасения превращения генно-инженерных

растений в сорняки, хотя комплекс «сорняковости» (комплекс признаков,

обеспечивающих быстрое распространение в ущерб культурным растениям,

устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов, эффективные меха-

низмы рассеивания семян и пр.) едва ли может сформироваться в результате

трансплантации одного или немногих генов. В то же время устойчивость к

гербицидам, кодируемая одним геном, может вызвать существенные пробле-

мы в практике севооборотов. Так, устойчивое к некоторому препарату расте-

ние, культивируемое на определенной площади, на следующий год при смене

на этом поле культуры будет выступать по отношению к ней как сорняк, ус-

тойчивый к данному гербициду. Это предусматривает необходимость тща-

тельного тестирования всех генно-инженерных растений перед их переносом

в полевые условия.

Новый путь модификации генома – применение антисмысловых РНК,

т.е. подавление синтеза определенного белка. Введение в клетку комплемен-

тарного олигонуклеотида мРНК препятствует считыванию информации. Ис-

пользование данной технологии позволило получить сорт томатов, сохра-

няющихся длительное время за счет блокирования функции гена полигалак-

туроназы (расщепляет углеводы в клетке, стимулируя созревание), или кофе

с низким уровнем кофеина в результате введения гена, подавляющего про-

дукцию; т.е. это путь удаления неприятных горьких и прочих веществ из

сельскохозяйственной продукции, подавления вирусных инфекций и т.д.

Генетическая инженерия животных направлена на выведение живот-

ных с высокими эксплуатационными свойствами. Методы генетической ин-

женерии совместно с методом клонирования животных позволяют также по-

лучать модели для изучения заболеваний человека, процессов старения и

формирования злокачественных новообразований. В будущем эти приемы

могут быть использованы для разработки новых лекарственных средств и

оценки эффективности таких методов лечения, как генная и клеточная тера-

пии. Клонирование животных также предоставляет возможность спасения

видов, находящихся под угрозой вымирания.

К биотехнологическим методам репродукции животных относятся ис-

кусственное осеменение, индукция родов, трансплантация, регулирование

соотношения особей мужского и женского рода в популяции, это также ран-

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»

1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 44

няя диагностика беременности, применение гормонов для регулирования ре-

продуктивных функций и роста и пр.

Искусственное разделение эмбриона является рутинным методом кло-

нирования. Метод дает возможность получения большого числа копий жи-

вотных от высокоценных производителей. Возможно получение большого

числа копий однояйцовых близнецов путем разделения зародышей в стадии

бластулы или морулы на части. Эти части зародыша вводятся в пустые обо-

лочки яйцеклеток свиньи, помещают в агаровые цилиндры на несколько

дней, далее вводят в яйцеводы овец. Нормально развившиеся зародыши пе-

ресаживают хирургическим путем коровам-реципиентам на 6-7 день полово-

го цикла. Выживаемость у половинок составляет до 75 %, у четвертинок –

ниже, около 40 %. Образующиеся в результате этого эмбрионы внедряются в

матку суррогатной матери, которая обеспечивает их вынашивание и рожде-

ние. Так как эмбрионы происходят из одной зиготы, они являются генетиче-

ски абсолютно идентичными.

Манипуляции на эмбрионах используют для получения эмбрионов раз-

личных животных. Подход позволяет преодолеть межвидовой барьер и соз-

давать химерных животных. Таким образом получены, например, овце-

козлиные химеры. Первые эксперименты показали возможность трансфор-

мации генома животных генами человека, в США удалось получить свиней,

несущих ген гормона роста человека. В Эдинбургском центре биотехнологии

получены овцы с перенесенным фактором 9 человека, который секретируется

в составе молока.

Новый метод – перенос ядра соматической клетки (или перепрограм-

мирование яйцеклеток) начинается с выделения из организма соматической

клетки – любой клетки, не участвующей в процессе репродукции (т.е. любой,

кроме половых клеток – сперматозоидов и яйцеклеток). У млекопитающих

любая соматическая клетка содержит полный двойной набор хромосом

(в каждой паре одна хромосома получена от материнской яйцеклетки, вторая –

от отцовского сперматозоида). Геном любой половой клетки состоит только

из одного хромосомного набора.

Для создания овцы Долли исследователи переместили ядро соматиче-

ской клетки, полученной от взрослой овцы, в яйцеклетку, ядро которой было

предварительно удалено. После проведения определенных химических ма-

нипуляций яйцеклетка с подмененным ядром начала вести себя как свежеоп-

лодотворенная яйцеклетка. В результате ее деления сформировался эмбрион,

который был имплантирован суррогатной матери и выношен в течение пол-

ного срока беременности. Появление Долли продемонстрировало возмож-

ность удаления генетической программы ядра специализированной сомати-

ческой клетки и его перепрограммирования в лабораторных условиях мето-

дом помещения в яйцеклетку.

В течение 5-6 дней яйцеклетка развивается в эмбрион, генетически

идентичный животному-донору. Клетки этого эмбриона могут быть исполь-

зованы для получения любого типа ткани, которая при пересадке не будет

отторгаться организмом донора ядра. Этот метод вполне может быть исполь-

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»

1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 45

зован для выращивания клеток и тканей для заместительной терапии. Дан-

ный метод клонирования животных весьма активно используют в настоящее

время. Совершенствование биотехнологических методов и средств диагно-

стики и лечения, возможности ускоренными методами создавать эффектив-

ные породы сельскохозяйственных животных и сортов культурных растений –

все это способствует повышению качества жизни человека.

Ощутим вклад биотехнологии в увеличение ресурсов минерального

сырья и энергоносителей, а также в охрану окружающей среды. В связи с по-

следним особо значимым становится направление, ориентированное на ос-

воение экологически чистых новых материалов. Создание экологически чис-

тых материалов с полезными свойствами остается одной из ключевых про-

блем современности. К настоящему моменту объемы выпуска не разрушае-

мых в природной среде синтетических пластмасс достигли 180 млн т/год, что

создало глобальную экологическую проблему. Радикальным решением этой

проблемы является освоение полимеров, способных биодеградировать на

безвредные для живой и неживой природы компоненты. В этой связи в по-

следние годы наметился существенный прогресс в области синтеза разру-

шаемых биополимеров – высокомолекулярных полимерных материалов, спо-

собных деградировать в природной среде до безвредных продуктов (диокси-

да углерода и воды).

Необходимость повышения качества жизни человека делает все более

актуальной разработку новых средств диагностики и лечения, целевых про-

дуктов, в том числе пищевого и технического назначения, экологически чис-

тых материалов, усовершенствования способов воспроизводства энергоноси-

телей и минерального сырья, а также утилизации промышленных, сельскохо-

зяйственных и бытовых отходов. Все новые продукты биотехнологии, осо-

бенно пищевого и медицинского назначения, должны быть проверены на

безопасность прежде, чем они будут допущены в практику. Для получения

законодательного разрешения на применение новых биотехнологических

продуктов, препаратов и технологий необходимо пройти серию этапов. Про-

цесс прохождения всех этапов до промышленного выпуска называется пере-

дачей технологии.

На рис. 1.2

в обобщенном виде представлены этапы, обязательные для

успешной передачи технологии производства продуктов биотехнологии био-

медицинского назначения. Каждое направление передачи технологии имеет

временные рамки, регулирующие последовательность шагов (этапов) про-

цесса передачи технологии.

Успех продвижения новой технологии зависит от многих составляю-

щих и, прежде всего, от организационного – правового процесса регулирова-

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»

1.4. Инновации в биотехнологии: процедура коммерциализации и передачи технологий

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 46

ния всех этапов прохождения разработки, от стадии поисковых научных ис-

следований до маркетинговых исследований и выхода на рынок. В России

еще предстоит создать условия и механизмы для эффективной разработки и

коммерциализации биотехнологических разработок, особенно в области ме-

дицинского материаловедения, тканевой инженерии и конструирования био-

искусственных органов. В США и странах ЕС это уже сложившийся и регла-

ментированный путь.

Каждый этап передачи технологии дает разный конечный результат и

выдвигает разные требования к бюджету и персоналу. Прибыльность часто

зависит от времени и затрат, вложенных в каждое направление. Финансовые

затраты, связанные с направлениями, суммируются и должны точно прогно-

зироваться и выполняться, если нужно, чтобы процесс передачи был успеш-

ным. Движение к коммерциализации биотехнологической разработки состо-

ит из серии последовательных этапов (рис. 1.3).

Исследовательское направление (2–10 лет) на практике зачастую быва-

ет гораздо продолжительнее вследствие необходимости проведения испыта-

ний новых материалов не только в системах in vitro, но и опытах над живот-

ными. Результатами этого этапа могут быть не только научные публикации

и диссертационные работы, но также и патенты.

Практика показывает, что если есть возможность реализовывать одно-

временно все пять направлений, то суммарное время, необходимое для ус-

пешного процесса передачи технологии, может составить 8–10 лет. Однако,

если приходится выполнять этапы последовательно, суммарное время почти

удваивается (до 14–16 лет). Часто это происходит потому, что затраты, свя-

занные с патентной защитой и демонстрацией технологии, обычно значи-

тельно больше затрат на исследования. При переходе от уровня исследова-

ний к последующим (патентование, маркетинг, демонстрация опытных об-

разцов) в процесс принятия решений вовлекаются новые уровни управления;

количество лиц, принимающих решения, увеличивается. Затраты на реализа-

цию каждого последующего этапа возрастают, и при приближении к завер-

шающим этапам процесса передачи технологии необходимые для этого объ-

емы финансирования превосходят средства, которые выделяются университе-

тами, фондами, мелкими компаниями. Критическим является переход от эта-

па 3 (маркетинговые исследования и оценка рынка) к этапу 4 (демонстрация

технологии). На этом этапе потребность в финансировании возрастает на

порядок. Помимо существенных финансовых затрат, переход на этот этап

требует дополнительного персонала, управления, мощностей.

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»

1.4. Инновации в биотехнологии: процедура коммерциализации и передачи технологий

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 47

Рис. 1.2. Продолжительность и последовательность этапов процесса передачи технологии

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»

1.4. Инновации в биотехнологии: процедура коммерциализации и передачи технологий

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 48

Как правило, средства, направленные на реализацию этапа демонстра-

ции технологии, выделяются без завершения этапа маркетинга и бизнес-

исследования. В маркетинге и бизнес-анализе предпринимается попытка

прогноза соотношения затрат/доходов, необходимого капитала, размера рын-

ка, времени выхода на рынок, процента проникновения на рынок, конкурен-

тоспособности новой технологии, времени выполнения заказа по сравнению

с конкурентами и т.д. Университетская и академическая наука не имеют пер-

сонала и опыта для проведения такого анализа. Для этого требуется заклю-

чить лицензионное соглашение. Зачастую происходят задержки, потому

средства редко выделяются для запуска этапа 3 до тех пор, пока не будут вы-

даны патенты (конечная точка этапа 2) и пока не будут подписаны лицензи-

онные соглашения, но на это нужны время и деньги.

Рис. 1.3. Этапы, необходимые для проведения

полного цикла процесса передачи технологии

Этап 1

Проведение исследований

Этап 2

Патентование

Этап 3

Маркетинговые исследования

и оценка рынка

Этап 4

Демонстрация технологии

Этап 5

Организация производства

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»

1.4. Инновации в биотехнологии: процедура коммерциализации и передачи технологий

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 49

Опыт реализации биологических технологий показывает, что чем со-

временней новая технология, тем труднее бывает провести маркетинговые и

бизнес-оценки. Поэтому чем больше потенциал новой технологии, тем боль-

ше риск и дольше время, необходимое для принятия решение о том, что

нужна поддержка для выхода на этап демонстрации технологии и проведения

контроля качества продукта.

Переход от этапа 4 к этапу 5 (наращивание объемов от эксперимен-

тального уровня до уровня производства) требует еще более серьезных вло-

жений средств и оценок рынка. При этом важно знание объема производст-

венной базы, необходимой для достижения прогнозируемых небольших до-

ходов. Тем не менее, при этом планируемая производительность производст-

ва должна быть сопоставимой с прогнозом продаж. Поэтому выделение при-

быльных ниш на рынках в первые годы наращивания производства является

ключевым требованием прогнозирования соотношения прибыли/риска для

новой технологии. Большие корпорации обладают опытом и знаниями, для

того чтобы выполнить такие оценки, но их большие накладные расходы при-

водят к раздуванию доходности, необходимой для успешной работы пред-

приятия. Маленькие компании, наоборот, имеют низкие накладные расходы,

но часто не обладают способностями точно оценить многочисленные факторы,

действующие при переходе к промышленному этапу производства продукта.

Среди факторов, позитивно влияющих на ускорение процесса передачи

технологии, можно выделить следующие:

– исследователи, отвечающие за создание технологии (этап 1) и патен-

тование (этап 2), должны принимать участие в начальных этапах оценки

рынка (этап 3), а также демонстрации технологии (этап 4);

– переходы между этапами 1-2-3 должны быть быстрыми и эффектив-

ными;

– лицензионные соглашения должны быть гибкими, для того чтобы

обеспечивать быструю реализацию этапов 2, 3 и 4 одновременно, даже если

информация по проведению оценки рынка (этап 3) является неполной;

– этапы с конкретными сроками реализации должны быть согласованы

исследовательской командой, управленческой командой, командой марке-

тинга и разработки продукции, которые отвечают за этапы 3 и 4. Эти сроки

должны быть согласованы вместе с бюджетами, в которые необходимо зало-

жить премиальные стимулы, для того чтобы обеспечить приложение усилий

по своевременному достижению целей;

– для реализации этапов 3 и 4 следует предусмотреть достаточный объ-

ем финансовых средств; которые должны предоставляться этапами, соответ-

ствующими этапам по выполнению каждого направления; при этом увязыва-

– это один из путей обеспечения того,

что капитал будет ориентирован на конечные результаты направлений, а не

на то, чтобы его тратили для продолжения исследований.

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»

1.4. Инновации в биотехнологии: процедура коммерциализации и передачи технологий

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 50

Не секрет, что одной из причин задержки процесса передачи техноло-

гии является продолжение выполнения исследований на этапе 1 при ограни-

ченных ресурсах вместо перемещения программы на этапы 3 и 4. Это часто

происходит в университетах и академических учреждениях, где продвижение

по службе, поощрения зависят от публикаций, что является основным конеч-

ным результатом этапа 1.

Если же технология создается внутри крупной коммерческой компа-

нии или корпорации, обычно действует структура управления, принимающая

решения и бюджеты для этапов 2, 3, 4 и 5. Этапы и сроки часто навязываются

как часть требований к выполняемой работе участвующих команд. В отличие

от этого подхода, в условиях, когда технология создается внутри университе-

та или государственной лаборатории, структура управления или бюджет для

этапов 3 и 4 отсутствуют. В этом случае принцип состоит, как правило, в за-

ключении лицензионного соглашения с компанией. Каждый этап процесса

передачи технологии имеет разную степень риска, время и личные капитало-

вложения, связанные с ним.