Сартакова О.Ю. Промышленная микробиология

Подождите немного. Документ загружается.

101

Перифитон изучают путем сбора и осмотра подводных предме-

тов.

Для изучения бентоса либо соскребают биообъекты со дна, либо

снимают поверхностный слой грунта со дна вместе с находящимися в

нем микроорганизмами. Образцы проб микроскопируют.

6.5 Применение биотехнологии в медицине

Медицинская микробиология изучает патогенные для человека

микроорганизмы (бактерии, вирусы, грибы, простейшие), вызываемые

ими заболевания, а также разрабатывает технологию получения из ми-

кроорганизмов разнообразных продуктов – антибиотиков, вакцин, фер-

ментов, белков, витаминов. Последние представляют наибольший ин-

терес в терапевтической практике человека и животных. Получение

этих продуктов с улучшенными свойствами (не аллергенных, не ток-

сичных, устойчивых в условиях окружающей среды) сегодня очень ак-

туально.

6.5.1Антибиотики

Антибиотики - это специфические продукты жизнедеятельно-

сти, обладающие высокой физиологической активностью по отноше-

нию к определенным группам микроорганизмов и к злокачественным

опухолям, задерживающие их рост.

Антибиотики (греч. anti - против, bios - жизнь) – вещества ми-

кробного, животного или растительного происхождения, избирательно

подавляющие жизнеспособность микроорганизмов.

Термин «антибиотики» предложен Ваксманом в 1942 году.

Первые попытки выделения антибиотика

были сделаны Эмме-

рихом (1889г.), изолировавшим из культур синегнойной палочки веще-

ство, которое он назвал пиоциназой, обладавшее бактерицидными

свойствами в отношении возбудителей сибирской язвы, брюшного ти-

фа, дифтерии, чумы и стафилококков. Переворот в учении об антибио-

тиках произошел в результате открытия А. Флемингом пенициллина.

В 1940 г. Флори и Чейн разработали метод

извлечения пенициллина

из культуральной жидкости Penicillium notatum. Вскоре была выявлена

высокая терапевтическая активность этого препарата.

После открытия пенициллина начались интенсивные поиски но-

вых антибиотиков, которые продолжаются до сих пор. Сегодня из-

102

вестно более 7000 антибиотиков, продуцируемых грибами, актиноми-

цетами, бактериями и другими микроорганизмами.

Механизм действия антибиотиков. По характеру действия ан-

тибиотиков на бактерии их можно разделить на две группы: антибио-

тики бактериостатического действия и антибиотики бактерицидного

действия. Бактериостатические антибиотики в концентрациях, ко-

торые можно создать в организме, задерживают рост микробов, но не

убивают их, тогда как воздействие бактерицидных антибиотиков в

аналогичных концентрациях приводит к гибели клетки. Однако в более

высоких концентрациях бактериостатические антибиотики могут ока-

зывать также и бактерицидное действие.

За последние годы большие успехи были достигнуты в изучении

механизма действия антибиотиков на молекулярном уровне. Пени-

циллин, ристомицин (ристоцетин), ванкомицин, новобиоцин, Д-цикло

серин нарушают синтез клеточной стенки бактерий, то есть эти анти-

биотики действуют лишь на развивающиеся бактерии и практически

неактивны в отношении покоящихся микробов.

Механизм действия других антибактериальных антибиотиков –

левомицетина, макролидов, тетрациклинов – заключается в нарушении

синтеза белка бактериальной клетки на уровне рибосом.

Противогрибковые антибиотики полиены нарушают целостность

цитоплазматической мембраны у грибковой

клетки, в результате чего

эта мембрана теряет свойства барьера между содержимым клетки и

внешней средой, обеспечивающего избирательную проницаемость. В

отличие от пенициллина, полиены активны и в отношении покоящихся

клеток грибков.

Противоопухолевые антибиотики, в отличие от антибактери-

альных, нарушают синтез нуклеиновых кислот в бактериальных и жи-

вотных клетках. Антибиотики актиномицины и производные

ауреоло-

вой кислоты подавляют синтез ДНК-зависимой РНК, связываясь с

ДНК, служащей матрицей для синтеза РНК.

Получение антибиотиков. Продуцент выращивают в 10-50 тон-

ных ферментерах в условиях оптимальных (достаточное содержание

азота, углерода) для образования антибиотиков. Для лучшей аэрации

среда постоянно перемешивается, и через нее пропускают стерильный

воздух. Штаммы продуцентов, выделенные из

окружающей среды,

обычно из почвы, как правило, малопродуктивны. Путем их селекции

удается получить штаммы продуцентов в десятки и сотни раз более

продуктивные, чем исходный «дикий» штамм. Большинство антибио-

тиков, представляющих интерес для медицины, накапливается в куль-

103

туральной жидкости. По окончании выращивания продуцента культу-

ральную жидкость отделяют от мицелия фильтрованием и антибиотик,

содержащийся в жидкости, выделяют различными методами в зависи-

мости от его природы. Существуют два основных метода выделения

антибиотика. Первый метод заключается в экстракции антибиотика из

культуральной жидкости органическими растворителями, второй – ос-

нован на способности антибиотика адсорбироваться

на ионообменных

смолах. Для очистки препарата используют, в зависимости от природы

антибиотика, различные физико-химические методы.

Важнейшие антибиотики, применяемые сегодня, часто вызывают

побочные реакции:

- пенициллины, цефалоспорины вызывают аллергические реак-

ции;

- стрептомицин, канамицин, амикацин оказывают разрушающее

действие на слуховой нерв и почки;

- тетрациклины, эритромицины, грамицидин вызывают интокси-

кацию организма

и др.

Токсичность существующих препаратов является причиной повы-

шенного внимания к развитию класса новых антибиотиков. Новые ан-

тибиотики, такие как рокситромицин, султамицин, лифоран и другие

характеризуются высоким уровнем безопасности.

6.5.2. Гормоны

Гормоны (от греч. hormao-возбуждаю, привожу в движение), био-

логически активные вещества, вырабатываемые в организме специали-

зированными клетками или органами

(железами внутренней секреции)

и оказывающие целенаправленное влияние на деятельность других ор-

ганов и тканей. Термин «гормоны» предложил в 1905 г. английский

физиолог Э. Старлинг.

Гормоны влияют на все виды обмена веществ в организме, актив-

ность генов, рост и дифференцировку тканей, формирование пола и

размножения, адаптацию к условиям среды, поддержание постоянства

внутренней

среды организма (гомеостаз), поведение и многие другие

процессы. Совокупность регулирующего воздействия различных гор-

монов на функции организма называется гормональной регуляцией.

Получение и применение гормонов. Гормоны - продукты, полу-

чаемые из органов и тканей животных и человека (крови донора, уда-

ленных при операциях органов, трупного материала). Полипептидные

и белковые гормоны выделяют путем экстракции

из желез домашнего

104

скота с последующей очисткой. Разработана процедура получения не-

которых гормонов с помощью методов генной инженерии. Многие не-

пептидные гормоны получают с помощью химического синтеза.

Гормоны нашли широкое применение в акушерстве и гинеко-

логии. Хорионический гонадотропин помогает при лечении бесплодия,

окситоцин используют для усиления родовой деятельности. Стероид-

ные половые гормоны или их

аналоги применяют при нарушениях в

половой сфере, в качестве противозачаточных средств и т.д. Гормоны

коры надпочечников используют для лечения аллергических заболева-

ний, их назначают при артрите, при воспалительных процессах. Гор-

моны, вырабатываемые вилочковой железой (тимусом), применяют

для лечения онкологических заболеваний, при нарушениях иммуните-

та.

Гормон роста - соматотропин, ранее этот

гормон получали из

гипофиза человека. Каждый гипофиз содержит его не более 4 мг. Для

лечения одного ребенка карлика требуется 7 мг в неделю. С примене-

нием генно-инженерных штаммов Е-coli стало возможно продуциро-

вать 100 мг гормона роста на 1 л среды культивирования. Данная тех-

нология получения соматотропина сделала применение его в терапев-

тической практике

более доступным.

Инсулин - гормон поджелудочной железы, основное средство

лечения сахарного диабета. Раньше получали из поджелудочной желе-

зы быка и свиньи. Препарат отличался от человеческого инсулина тре-

мя аминокислотными звеньями, что вызывало аллергические реакции

при его применении. Путем генно-инженерных модификаций живот-

ного инсулина удалось получить продукт неотличимый от человече-

ского

инсулина.

Интерфероны – вещества, выделяемые клетками человека и жи-

вотных в ответ на инфицирование вирусами. Обладают антивирусной

активностью, стимулируют деятельность иммунной системы и препят-

ствуют развитию рака.

Интерферон ранее получали из крови в количестве до 1 мкг из 1 л

крови, что соответствовало одной дозе. В настоящее время его получа-

ют с применением генно

-инженерных штаммов Е-coli, причем из тако-

го же объема культуры кишечной палочки (1 л), извлекают тысячу доз

продукта.

105

6.5.3 Вакцины, иммунные сыворотки и иммуноглобулины

Одним из важнейших направлений прикладной микробиологии

является создание эффективных препаратов для иммунопрофилактики

и иммунотерапии инфекционных заболеваний.

Вакцины и анатоксины – препараты для индукции в организме

специфического иммунного ответа с формированием активного проти-

воинфекционного иммунитета (от англ. immunity – невосприимчи-

вость) за счет мобилизации механизмов иммунологической памяти.

Вакцины изготавливают на основе ослабленных, инактивиро-

ванных возбудителей

болезней. Разработка современных вакцин осно-

вана на генно-инженерном подходе. Вакцины стимулируют ответ им-

мунной системы так, как будто имеет место реальная инфекция. Им-

мунная система затем борется с "инфекцией" и запоминает микроорга-

низм, который ее вызвал. При этом если микроб вновь попадает в орга-

низм, эффективно борется с ним.

Вакцинация (прививка, иммунизация, от лат. vaccus – корова) —

создание искусственного иммунитета к некоторым болезням. Для этого

используются относительно безобидные антигены, которые являются

частью микроорганизмов, вызывающих болезни. Микроорганизмами

могут быть вирусы или бактерии.

Хорошо известны вакцины первого поколения — вакцина против

бешенства, полиомиелита, кори туберкулеза, чумы, сибирской язвы;

убитые вакцины — вакцина против коклюша, клещевого

энцефалита;

вакцины второго поколения (химические), примером может служить

холерная вакцина; а также субъеденичные вакцины — противогрип-

позная вакцина.

Иммунные сыворотки и иммуноглобулины – биологические

препараты, содержащие готовые специфические антитела (иммуногло-

булины), введение которых в организм приводит к немедленному при-

обретению пассивного гуморального иммунитета, способного защи-

тить организм от интоксикации или инфекции. Иммунные

сыворотки и

получаемые из них иммуноглобулины предназначены для создания

пассивного антитоксического, антибактериального или антивирусного

иммунитета у человека.

Иммунные сыворотки и иммуноглобулины используются как

средства серопрофилактики и серотерапии. В первом случае сыворо-

точные препараты вводятся до возможного заражения или непосред-

ственно после него, пока еще не появились признаки заболевания, а па-

циент

не обладает собственными антителами, способными защитить

106

его от заражения. Во втором случае препараты вводятся для лечения –

нейтрализации токсинов или вирусов, усиления антимикробной защи-

ты.

Все сывороточные препараты делятся на две группы: гетероло-

гичные, полученные из крови животных (чаще лошадей), и гомологич-

ные, полученные из крови человека. Преимущество гетерологичных

препаратов в том, что интенсивная иммунизация животных позволяет

достичь

высокой концентрации антител.

В качестве профилактических и лечебных препаратов могут ис-

пользоваться «чистые антитела» - иммуноглобулины, полученные

сорбцией антител на антигенных сорбентах.

6.5.4 Ферменты

Ферменты (от лат. fermentum - брожение, закваска), специфи-

ческие белки, присутствующие во всех живых клетках и играющие

роль биологических катализаторов.

Ферменты являются регуляторами скорости химических реакций,

строго контролируют

процессы синтеза и распада индивидуальных

химических компонентов клетки и всего организма в целом. Благодаря

этому свойству ферментов живые системы сохраняют постоянство

внутренней среды (так называемый гомеостаз). Ферменты выполняют

важные защитные функции, обезвреживая как экзогенные (поступаю-

щие из внешней среды), так и эндогенные (образующиеся в самом ор-

ганизме) токсические вещества. Последние

подвергаются под действи-

ем ферментов различным реакциям окисления, восстановления и, нако-

нец, распада на продукты, теряющие свои токсические свойства.

Методы выделения и очистки ферментов. Хотя уже осуще-

ствлен лабораторный синтез ряда ферментов - рибонуклеазы, лизоци-

ма, ферредоксина и цитохрома - С, трудно ожидать, что синтетическое

получение ферментов получит широкое распространение в ближайшие

десятилетия

ввиду его сложности и дороговизны, поэтому единствен-

ный реальный в настоящее время способ получения ферментов - это

выделение их из биологических объектов.

Выделяют ферменты так же, как и другие белки, хотя есть прие-

мы, применяемые преимущественно для ферментов. Из них можно от-

метить экстракцию глицерином, в котором сохраняются нативные

свойства ферментов,

а также метод ацетоновых порошков, состоящий в

осаждении и быстром обезвоживании при температуре не выше -10°С

тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты. К их числу отно-

107

сится также получение ферментов путем адсорбции с последующей

элюцией (снятием) с адсорбента. Наряду с ними широко применяют

метод ионообменной хроматографии, метод молекулярных сит, элек-

трофорез и особенно изоэлектрофокусирование. Особое внимание при

выделении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях,

исключающих денатурацию белка, так как она всегда связана с поте-

рей ферментативной

активности. Этому способствует проведение опе-

раций в присутствии защитных добавок, в частности HS-содержащих

соединений (цистеина, глутатиона, меркаптоэтанола, цистеамина, ди-

тиотреитола и др.).

Переломным моментом в усовершенствовании методов полу-

чения высокоочищенных, гомогенных препаратов ферментов было от-

крытие способности их кристаллизоваться, осуществленное впервые в

1906 г. А. Д. Розенфельдом (им была получена

в виде кристаллов ок-

сидаза из корней редьки) и приобретшее с 1926 г. широкую из-

вестность после работы Д. Самнера по получению кристаллической

уреазы из бобов канавалии.

Медицинская энзимология. Существуют три основных направ-

ления исследований в области медицинской энзимологии: энзимопато-

логия, энзимодиагностика и энзимотерапия.

Энзимопатология призвана изучать молекулярные основы раз-

вития

патологического процесса, основанные на данных нарушениях

механизмов регуляции активности или синтеза индивидуального фер-

мента, или группы ферментов. Так как, чаще всего, развитие болезни

непосредственно связано с наследственной недостаточностью или пол-

ным отсутствием синтеза одного единственного фермента в организме

больного.

Так, например, развитие тяжелого наследственного заболевания –

галактоземии (непереносимость молочного сахара) связано с

отсутст-

вием синтеза в клетках печени фермента, катализирующего превраще-

ние галактозы в глюкозу.

Энзимодиагностика призвана заниматься разработкой фер-

ментных тестов, основанных на определении активности (уровня) фер-

ментов и изоферментов в биологических жидкостях организма больно-

го (сыворотка крови, желудочный сок, спинномозговая жидкость, моча

и др.).

В настоящее время разработаны количественные методы

анализа

многих распространенных ферментов, выявляемых в биологических

жидкостях при поражении разных органов. Для каждого из этих фер-

108

ментов определены контрольные величины (уровни) активности и пре-

делы колебания в норме как в сыворотке крови, так и в самом органе.

Диагностическая энзимология достигла значительных успехов

при постановке диагноза болезней многих органов, в частности почек,

сердца, поджелудочной железы, желудка, кишечника и легких. Фер-

ментная диагностика может служить основой не только для

постанов-

ки правильного и, что самое главное, своевременного диагноза болез-

ни, но и для проверки эффективности применяемого метода лечения.

Обладая высокой специфичностью действия, ферменты приме-

няются в качестве самых тонких и избирательных инструментов в на-

правленном воздействии на течение любой патологии. О степени по-

ражения органов, биомембран клеток и субклеточных

структур, о тя-

жести патологического процесса можно судить по появлению (или рез-

кому повышению уровня) органотропных ферментов и изоферментов в

сыворотке крови больных, что составляет предмет диагностической эн-

зимологии.

Энзимотерапия. Ферменты используются для лечения различ-

ных заболеваний, в том числе и наследственных, вызванных наруше-

нием синтеза того или иного фермента

или резким перепадом субстра-

та, на который организм не смог среагировать по причине, например,

ослабленного иммунитета. Также ферменты применяют для лучшего

вживания и устойчивости в организме искусственных органов, проте-

зов, их применяют в различных перевязочных материалах для ускоре-

ния заживления ран и ожогов, для разрушения тромбов.

Основной проблемой при использовании ферментов

является их

быстрая инактивация, аллергенность, токсичность (так как по существу

они чужеродны для данного организма), доставка точно в пораженный

орган или ткань. Для решения этих проблем применяют методы иммо-

билизации ферментов, разработанные инженерной энзимологии.

Иммобилизация ферментов заключается в их физическом (адсорбци-

онном) и (или) химическом (ковалентном) связывании с некой матри-

цей носителя, который защищает фермент от инактивирующего воз-

действия и не влияет на его активные центры.

Основные требования к иммобилизованным ферментам:

- иммобилизованные ферменты должны сохранять свою актив-

ность в течение максимально возможного времени;

- введенные в организм вещества должны быть мало подвержены

действию антител и естественных ингибиторов;

- не должны оказывать

негативного воздействия на организм в це-

лом;

109

- носитель, с которым связан фермент, должен обеспечивать не

только устойчивость, но и направленную доставку исключительно или

хотя бы предпочтительно в зону поражения.

Таким образом, если присутствие данного фермента необходимо

во всех органах и тканях организма или он необходим для длительной

циркуляции в кровотоке, то целесообразно применять растворимые

препараты, то есть

связывать фермент с неким растворимым носителем

(растворимые капсулы, или «искусственные клетки»). В некоторых

случаях идут по пути создания биоразлагаемых и биосовместимых

производных ферментов в виде микрочастиц, гранул или таблеток, ко-

торые способны «добираться» к местам поражения и в течение опреде-

ленного времени диффундировать необходимый фермент. Для наруж-

ного применения соответствующий

фермент иммобилизуют на по-

верхности или в объеме перевязочных материалов, защитных пленок,

дренажа или добавляют содержащие его микрокапсулы в различные

мази и кремы.

6.5.5 Биодатчики в медицине

Большое влияние на развитие медицины оказывает биоэлектро-

ника и биоэлектрохимия. В последние годы здесь достигнуты заметные

успехи. Создан ряд чувствительных биодатчиков. Действие большин-

ства разработанных на сегодня датчиков основано на улавливании

продуктов действия ферментов. Для этого используются обычные

электроды с иммобилилизованной на них биологической системой,

называемые - биодатчики, биосенсоры. Под термином биосенсор сле-

дует понимать устройство, в котором чувствительный слой, содер-

жащий биологический материал: ферменты, ткани, бактерии, дрожжи,

антигены, липосомы, органелы, рецепторы, ДНК, непосредственно

реагирующий

на присутствие определяемого компонента, генерирует

сигнал, функционально связанный с концентрацией этого компонента.

Конструктивно биосенсор представляет собой комбинированное уст-

ройство, состоящее из двух преобразователей (трансдъюсеров) био-

химического и физического, находящихся в тесном контакте друг с

другом.

Новые подходы в этой области ставят своей целью создание бо-

лее чувствительных и эффективных приборов

и расширение сферы их

применения. В основе работы таких устройств лежит процесс прямого

переноса электронов между электродами и окислительно-восстанови-

тельными центрами белков.

110

Так, в медицине широко применяются ферментсодержащие

датчики для определения содержания глюкозы. Основное применение

они находят при регуляции содержания сахара в крови у больных са-

харным диабетом. Недостаточно точный контроль уровня сахара при

этой болезни приводит к развитию опасных для жизни побочных про-

цессов диабета.

6.6 Применение биотехнологии в энергетике

Биоэнергетика -

это область биотехнологии связанная с эффек-

тивным использованием энергии, запасенной при фотосинтезе био-

массой.

В последние годы, часто говорят об "энергетическом кризисе"-

запасы ископаемого топлива ограничены, а население планеты растет,

и потребление энергии все увеличивается.

Известно, что около 99,4%, доступной нам не ядерной энергии

мы получаем от Солнца, и часть ее аккумулируется

в биомассе, хотя и

с малой эффективностью. Усредненная максимальная эффективность

превращения энергии при фотосинтезе составляет от 5% до 6%. В зо-

нах с умеренным климатом эффективность преобразования энергии

составляет от 0,5% до 1,3%. Растения используют свет с длиной волны

от 400 до 700 нм, то есть доля фотосинтетически активной радиации

(ФАР) составляет 50% всего солнечного света.

Основные

процессы фотосинтеза протекают в хлоропластах, ко-

торые поглощают СО

, поступающий в растение путем диффузии.

Фотосинтез состоит из двух этапов:

- преобразование энергии фотонов в химическую энергию, кото-

рая накапливается в форме АТФ и комплекса водорода связанного с

коферментом НАДФ;

• Фотолиз - образование углеводов из СО

с участием Н

и АТФ

12 Н

О свет 12 [Н

] + 6 О

+ АТФ

• Фотоассимилиция

6 СО

+ 12 [Н

] темнота, АТФ С

+ 6 Н