Рубин Л.Б. Лекции по биофизике

Подождите немного. Документ загружается.

по

волокну. Нервное волокно можно уподобить электрическому

кабелю, соседние участки которого связаны

между

собой. Од-

нако

в отличие от обычного кабеля распространение нервного

импульса сопровождается его затуханием, поскольку в мембра-

не

имеются молекулярные «генераторы», подпитывающие

бегу-

щий

импульс. Нахождение скорости распространения нервного

импульса

требует

исследования кинетики ионных трансмембран-

ных токов

(£"к+,

^Na), тока утечки, а также знания электриче-

ских свойств нервного волокна (емкость и сопротивление).

Анализ соответствующих математических моделей показывает,

что скорость распространения устойчивого импульса обратно

пропорциональна

квадратному корню из диаметра волокна, что

совпадает с экспериментальными данными. В организме нерв-

ные

волокна объединены в нервные стволы, где каждое волокно

может самостоятельно проводить возбуждение. Электрическое

поле,

возникающее при этом в возбужденном волокне, влияет

на

мембранный потенциал соседних волокон, которые тем са-

мым при некоторых условиях

могут

также возбуждаться.

151

Лекция

17.

ПЕРВИЧНЫЕ

ПРОЦЕССЫ

ТРАНСФОРМАЦИИ

ЭНЕРГИИ

ФОТОСИНТЕЗЕ

g-0,9

1-0,6

-0,3

0+0,3

$+0,9

ФСЯ

H-O

[Диурон

«Рерредоксин

1/г

АФ

ФС7

Последовательность отдельных реакций в фотобиологических

процессах включает, как правило, следующие стадии: поглоще-

ние

кванта света хромофорной группой и образование электрон-

но-возбужденных состояний-—эмиграция энергии электронного

возбуждения—>- первичный фотофизический акт и появление

первичных фотопродуктов—>• образование первичных стабиль-

ных химических соедине-

т_ ний —*- физиолого-биохимиче-

~Ср

А (А.) ские процессы •—*- конечный

фотобиологический эффект.

задачу

биофизики

входит

выяснение механизмов началь-

ных стадий, которые

следуют

непосредственно за поглоще-

нием

кванта света. Как мы

увидим, несмотря на большое

разнообразие фотобиологиче-

ских эффектов, именно началь-

ные этапы преобразования

энергии света характеризуют-

ся

общими молекулярными ме-

ханизмами. В основе первич-

ных процессов фотосинтеза

лежит сложная совокупность

окислительно - восстановитель-

ных реакций переноса элек-

Рис.

17.1.

Схема

первичных про-

цессов фотосинтеза высших расте-

ний.

В соответствии с представ-

лениями о последовательном вза-

имодействии

двух

фотосистем в

так называемой Z —

схеме

фото-

синтеза, восстановленные продук-

ты ФС II

служат

донорами элект-

ронов для ФС I.

Возбуждение

светом, который в основном по-

глощается ФС II, должно приво-

дить

к восстановлению

промежу-

пластохинонов

Цитохрсм

Пласто-

цианин

^700

точных переносчиков в ЭТЦ,

возбуждение

ФС I, наоборот,

их окислению

трона в электрон-траспортной

цепи

(ЭТЦ).

Общая

схема.

На рис. 17.1

приведена общепринятая Z-cxe-

ма первичных стадий фотосин-

теза высших растений, где ука-

заны также времена переноса

электрона на отдельных эта-

пах. Как видно, фотосистемы

ФС2 и ФС1 функционируют

последовательно: донором элек-

тронов дляФС!

служат

восста-

152

новленные

результате

действия ФС2 фотопродукты. Дальний

красный

свет

(Х>680

нм) поглощается преимущественно пигмен-

тами ФС1 и вызывает окисление цитохрома, который восстанавли-

вается ФС2 при поглощении коротковолнового света (А,<680нм).

Оптимальная интенсивность фотосинтеза наблюдается при опре-

деленном соотношений

между

количеством возбужденных ФС1 и

ФС2,

которое зависит от спектрального состава света. Поглоще-

ние

света происходит пигментами светособирающего (СС) пиг-

мент-белкового (ПБ) комплекса

(ССПБК),

от которого, как из

резервуара, энергия возбуждения передается на пигмент-белко-

вые комплексы ФС1 и ФС2 (ПБК1 и

ПБК2)

и далее непосредст-

венно

к реакционным центрам РЦ1

РЦ2 (рис. 17.2). В зависимости от

ССПБК

конформационного

состояния фото- / \ о,5нс

синтетических мембран изменяется ' У \

топография

расположения

ПБКЛ

ПБКТ

ПБК2

ПБК2,

их связь с

ССПБК,

и I

распределение энергии возбужде-

nn4u

J ообнс

ния

между

ФСЛ и ФС2. ото опре- |

деляется присутствием ионов в 'Ц1 РЦ2

среде, рН среды, степенью фосфо-

рилирования

и поверхностным

Рис 17

.2. Схема миграции

зарядом белков

ССПБК-

В различ- энергии в фотосинтетическом

ных физиологических условиях из- аппарате высших растений

меняется

роль этих факторов, что

таким

образом имеет регуля-

торное значение для распределения энергии возбуждения

между

фотосистемами. Показателем эффективности дезактива-

ции

электронного возбуждения является сокращение длитель-

ности

возбужденного состояния молекул. Измерения длительно-

сти (т) синглетного возбужденного состояния (Si) хлорофилла

показали,

что величина т в растворе составляет 5 не, а в хлоро-

пластах она сокращается в

20—30

раз. Очевидно, при попада-

нии

возбуждения в РЦ происходит эффективный процесс ис-

пользования

электронной энергии состояния S

в первичном ак-

те фотосинтеза. Тем самым время (т) пребывания хлорофилла

возбужденном состоянии (Si) в листе сокращается. Тушение

флуоресценции разных форм пигментов носит сложный харак-

тер. Сокращение времени жизни возбужденного состояния пиг-

ментов до 0,5 не происходит в

ССПБК,

передающем энергию

на

ПБК1 и

ПБК2.

Затем уже осуществляется непосредственно

более эффективное тушение возбуждения в РЦ1 и РЦ2 за вре-

мя

0,03—0,05

не (рис. 17.2). По мере приближения к РЦ1 и

РЦ2

поток энергии возбуждения ускоряется. Миграция энергии

между

отдельными комплексами

(ССПБК

и ПБК1 и

ПБК2)

осуществляется по механизмам индуктивного резонанса, а в

пределах одного комплекса она носит экситонный характер.

Основной

принцип работы РЦ заключается в том, что при

попадании

возбуждения от (ПБК) в фотоактивный пигмент

153

(Р)

самого РЦ происходят отрыв электрона и восстановление

первичного акцептора (Ai), который затем передает электрон

следующему акцептору (А

) и так далее по ЭТЦ:

P+A-

—»-P+AiA-

(17.1)

Восстановление Р+ происходит затем от доноров электрона

ЭТЦ. В качестве Ai в РЦ выступают производные порфири-

новых молекул (например, феофитин в РЦ2), а роль вторично-

го акцептора выполняют молекулы хинона (РЦ пурпурных бак-

терий),

пластохинона (РС2) или железосерные белки

(РЦ1).

Эффективность

отрыва электрона от Р+ и переноса его на Ai

достигает

95—98%

и происходит за времена несколько

пико-

секунд (1 пс= 10~

с). Заметим, что если в РЦ исходно в тем-

ноте вторичный акцептор химически восстановлен, то после

появления

электрона на А! происходят его рекомбинация с Р+

за 5—10 не и появление Р+. Это сопровождается замедленным

свечением

<10 не 5—10 не

Р*А, А-

—> Р+А-,А

—•>

P*AiA-

—у

PAiA

+ft v.

В РЦ пурпурных бактерий была расшифрована кинетика пе-

реноса электрона

между

Р (димер бактериохлорофилла), A

(бактериофеофитин

БФФ), А

(первичный хинон Q

), A

(вто-

ричный

хинон Q

Схема переноса имеет вид

"7 150—200 пс

ФФ

QAQB У

2 мкс

В этих опытах возбуждение осуществлялось короткой лазер-

ной

вспышкой (1—2 пс), что позволило изучить кинетику после-

дующих,

более медленных стадий переноса электрона. Общая

схема первичных процессов бактериального типа имеет вид

Си-*

(17.3)

где внешним источником электронов для восстановления HAD

служат

сероводород, органические молекулы. Цитохром Сн-

обеспечивает циклический поток электронов, а цитохром C

—

связь

циклического переноса с внешними донорами электронов.

Физические

механизмы.

Важнейшая особенность функциони-

рования

РЦ состоит в том, что отдельные стадии переноса

электрона

могут

протекать эффективно и при низких темпера-

турах,

вплоть до температур жидкого азота и жидкого гелия.

На

рис. 10.5 была приведена типичная двухфазная кривая тем-

154

пературной зависимости фотоокисления «нециклического» цито-

хрома C

фотоактивным пигментом Р и РЦ пурпурных бакте-

рий.

Реакция идет по

схеме

200 пс

V~iA

vCiP+A,A-

•

—1

мкс

-C+PAiA-

Очевидно, туннельный механизм и обеспечивает протекание ре-

акции

окисления Сь при низкой температуре.

Как

уже говорилось (см. лекцию 10), начальная часть кри-

вой на рис. 10.6 указывает на температурно зависимые актива-

ционные

процессы возбуждения ядер и переход их на

высшие

колебательные уровни, с которых уже происходит туннелирова-

ние

донорно-акцепторного комплекса в конечное состояние.

Вместе с тем сам по себе процесс туннелирования

требует

пред-

варительного формирования контактного состояния

между

до-

норной

и акцепторной группами. Это обеспечивается вследствие

внутримолекулярной подвижности белка РЦ, где расположены

простетические группы переносчиков. Тогда свой вклад в тем-

пературную зависимость переноса электрона

будет

давать и

процесс образования контактных состояний. Температурная за-

висимость транспорта электрона должна коррелировать с внут-

римолекулярной подвижностью белка РЦ, что и наблюдается в

экспериментах. На рис. 17.3 показаны температурные зависимо-

Рис.

17.3. Функциональная актив-

ность (1) и конформационная ди-

намика

(2,3) реакционных цент-

ров в спин-меченых хроматофорах

rubrum

в зависимости от тем-

пературы: N — эффективность фо-

тоиндуцированного переноса

электрона от Q

на QB (кри-

вые 1); т' — эффективный пара-

метр времени корреляции враща-

тельной диффузии гидрофобного

спинового зонда (2) и спиновой

метки на SH — группы (3)

0,2-

- 2

290 250 210 МО Г,

сти прямого переноса электрона

между

первичным и вторичным

хинонами, а также характерного времени т/ подвижности спи-

новой метки, присоединенной к белку РЦ. Видно, что при повы-

шении

температуры образцов от

140—180°К

происходит резкое

уменьшение %', что говорит о «размораживании» внутримолеку-

лярных движений в белке РЦ. Как раз в том же температур-

ном

диапазоне увеличивается и функциональная активность РЦ,

приводящая к переносу электрона на вторичный хинон. Анало-

гичная корреляция наблюдается и в опытах, где измеряется

вероятность поглощения у-кванта без отдачи (см. рис. 9.5). Рас-

тормаживание белковой макромолекулы сопровождается ее

155

внутримолекулярными движениями по конформационным под-

состояниям (см. рис. 10.1) с амплитудами

~0,ЗА.

При обезво-

живании РЦ одновременно падает эффективность переноса

электрона и замедляется внутримолекулярная подвижность бел-

ка.

Роль образования контактных состояний в системе хинон-

ных акцепторов можно упрощенно иллюстрировать следующим

образом. Первичный хинон, получив в РЦ электрон, изменяет

характер своего движения и переходит на

другую

конформаци-

онную координату, соответствующую его восстановленному со-

стоянию (см. рис. 11.8). Здесь он, достигнув определенного кон-

тактного состояния со вторичным хиноном,

отдает

ему электрон.

При

низких температурах подвижность первичного хинона па-

дает,

а следовательно, уменьшается и эффективность переноса

электрона от него на вторичный хинон. Если, однако, образец

медленно

охлаждать

в условиях постоянного интенсивного

освещения, когда в

результате

действия света и отрыва элект-

рона от Р молекулы первичного хинона в основном находятся

в восстановленном состоянии, то картина существенно изменя-

ется. В этих условиях, как показали опыты, восстановленный

на

свету

первичный хинон уже исходно успевает перейти в кон-

тактное состояние, в котором перенос электрона от него на

вторичный хинон по туннельному механизму происходит быстра

при низких температурах. Поэтому в таких образцах, охлаж-

денных до низких температур на непрерывном

свету,

эффектив-

ность переноса электрона от температуры практически уже не

зависит. Очевидно, туннелирование происходит здесь эффектив-

но

с низких колебательных уровней и с быстрой диссипацией

части энергии по акцептирующей моде при низких температу-

рах. Таким образом, можно ожидать, что в исходно «приготов-

ленных» контактных состояниях

между

переносчиками темпера-

турная зависимость собственно переноса электрона может быть

слабо выражена. Действительно, первичный акт восстановления

БФФ

в РЦ центрах пурпурных бактерий, происходящий за

т^Ю пс (Р*

БФФ->-Р+

БФФ~),

от температуры практически

не зависит до

—196°.

другом

важном

случае

изучалась тем-

пературная зависимость окисления цитохрома С,

участвующего

в циклическом потоке в РЦ пурпурных бактерий (17.3). В отли-

чие от «нециклического» цитохрома С (рис. 10.5) скорость

окисления

Сн

(СнР

->-С

нР)

практически от температуры не

зависит. Однако, при температурах ниже некоторой критической

происходит уменьшение числа молекул цитохрома С, подверга-

ющихся фотоокислению, вследствие падения количества кон-

тактных состояний

(СнР).

У оставшихся активными молекул

Сн

константа скорости окисления остается практически неиз-

менной.

Распад контактных состояний (СнР) происходит не

только с понижением температуры, но и при дегидратации бел-

ка

РЦ. Роль воды и температуры проявляется как в обеспече-

нии

подвижности, так и стабилизации образованных контактов

между

донорно-акцепторными группами.

156

В последнее время получены интересные

результаты

о моле-

кулярных механизмах фотопревращений зрительного пигмента

родопсина и родственного ему бактериородопсина (Бр), обна-

руженного в пурпурной мембране галофильных бактерий. Каж-

дая молекула Бр содержит один хромофор-ретинал^ь (полиено-

вый

альдегид)

в комплексе с белком-опсином

ретиналь C =

N+

опсин

Энергия света, поглощенная ретиналем, используется для

активного переноса протона через мембрану, создания электро-

химического градиента водорода и синтеза АТФ. Начальный

этап трансформации энергии света протекает за время < 10 пс.

Он

включает транс-, цисизомеризацию ретиналя, сдвиг протона

Шиффова

основания и структурно-поляризационные изменения

ближайшего белкового окружения ретиналя (рис. 17.4). Эта

сн

опсин

Рис.

17.4. Схема первичного акта фотоцикла бактерио-

родопсина

дает

начало каскаду последовательных конформационных пере-

строек в макромолекулярном комплексе ретиналь—опсин, при-

водящих в итоге к транслокации протона через мембрану, воз-

можно, по сетке водородных связей. В

случае

родопсина хро-

мофором также

служит

ретиналь, соединенный с опсином Шиф-

фовым основанием. В исходном состоянии ретиналь находится

в 11-циссостоянии. Начальный акт фотопревращений родопсина

включает цис-, трансизомеризацию ретиналя, сопряженную со

смещением протона Шиффова основания. В обоих

случаях

на-

157

чальная стадия фотоизомеризации ретиналя в комплексе с оп-

сином

происходит намного скорее (за пикосекунды), чем у сво-

бодного ретиналя в растворе (несколько наносекунд). В этом

состоит роль специфического белкового окружения ретиналя,

которое не только обеспечивает его

быструю

изомеризацию, но

создает условия для стабилизации образованных промежу-

точных конформационных состояний в их последующих направ-

ленных изменениях. Конечным

результатом

фотопревращений

родопсина является возникновение зрительного электрического

сигнала в рецепторной мембране сетчатки глаза. В процессе

формирования рецепторного

ответа

зрительной клетки прини-

мают активное

участие

ферментативные системы.

Мы

видим, что первичные стадии трансформации энергии

света в фотоэнергетических и фотоинформационных процессах

протекают с

участием

белкового окружения хромофора. Они

осуществляются согласно принципу фотоиндуцированных элект-

ронно-конформационных

взаимодействий, которые носят на-

правленный характер, соответствующий специфическим струк-

турным особенностям фоточувствительного хромопротеида.

Лекция

18. ТРАНСФОРМАЦИЯ

ЭНЕРГИИ

В БИОМЕМБРАНАХ

Одна из важнейших функций биологических мембран состо-

ит в обеспечении трансформации энергии, сопряженной с пре-

образованием ее из одного вида в

другой.

Это, собственно, и

составляет основу биоэнергетических процессов в клетке. Как

известно, энергия, необходимая для различных видов жизнедея-

тельности клетки, утилизируется в виде энергии химических

связей молекулы АТФ, синтез которой в живой природе осуще-

ствляется главным образом в биологических мембранах мито-

хондрий и хлоропластов (хроматофоров). Во

всех

этих систе-

мах движущей силой является электронный поток, который ге-

нерируется в митохондриях за

счет

окисления

субстрата

и в

хлоропластах

— за

счет

энергии света. Здесь перенос электрона

сопряжен с транслокацией протонов и синтезом АТФ в АТФ-

синтезе.

Возможны различные механизмы переноса протона через

мембрану при транспорте электрона по цепи переносчиков, ко-

торые асимметрично расположены в мембране. Возможно обра-

зование в белковой части переносчика протонного канала, про-

водимость которого зависит от окислительно-восстановительно-

го состояния самого переносчика. Таким образом, переносчик

158

электронов

одновременно выполняет функции протонного насо-

са. Перенос протона может происходить и в

результате

работы

подвижных переносчиков, которые диффундируют через мем-

брану от одной ее стороны на

другую.

Они восстанавливаются

ЭТЦ на одной стороне мембраны и одновременно с электро-

ном

присоединяют протон, затем, диффундируя на

другую

сто-

рону мембраны, окисляются и выбрасывают протон в примем-

бранную область. Именно так осуществляются эти функции в

мембранах тилакоида в

хлоропластах,

где таким образом он

передает электроны и протоны с наружной (отрицательной) к

внутренней (положительной) поверхности. Отметим, что в ми-

тохондриях полярность мембраны обратна полярности тилакои-

да (плюс на наружной, минус на внутренней стороне). В тила-

коиде протоны потребляются из наружной фазы и переносятся

во внутреннюю, которая таким образом подкисляется при ра-

боте

ЭТЦ. Это приводит к появлению трансмембранного гради-

ента концентрации протонов (Д рН)

между

наружной и

внут-

ренней

фазами тилакоида. Одновременно создается и транс-

мембранная

разность электрических потенциалов (Дер) за

счет

увеличения положительного заряда внутри тилакоида при на-

коплении

там положительно заряженных протонов. Свой вклад

разность электрических потенциалов на мембране вносит и

собственно фотохимический перенос электрона на

наружную

сторону при работе фотосистем ФС I и ФСП. Образующееся

таким

образом электрическое поле (Дф) влияет в свою очередь

на

перенос

других

проникающих через мембрану ионов, которые

свою очередь изменяют Дф и влияют! на перенос протонов.

результате

наблюдается сложная картина взаимного влия-

ния

д«ух

составляющих Д рН и Дф трансмембранного электро-

химического потенциала. В стационарных условиях величина

электрохимического градиента на мембране

будет

зависеть от

соотношения

скоростей трансмембранного переноса электроген-

ных ионов, транслокации протонов и потока электронов по ЭТЦ.

Хемиосмотический принцип сопряжения Митчелла предпо-

лагает,

что перенос электронов связан с синтезом АТФ именно»

через образование этой трансмембранной разности электрохи-

мических потенциалов ионов водорода

Ар

н+

Aq>

+2,3

RT А рН,

где F — число Фарадея.

Энергия

Дцн+ используется для синтеза АТФ в специальном

ферменте — мембранной АТФ-синтетазе. Надо ясно понимать,,

что сама по

себе

величина электрохимического потенциала ха-

рактеризует термодинамическую

движущую

силу синтеза АТФ,.

но

ничего не говорит о молекулярных механизмах этого про-

цесса.

АТФазный комплекс включает растворимую

АТФазу

(фак-

тор Fi), где происходит синтез АТФ, и мембранную часть (фак-

159*

тор F

), где формируется протонный канал. По этому каналу

протоны

поступают в гидрофобную область к активному цент-

ру, а затем

оттуда

воду

по

другую

сторону мембраны. Кон-

кретный

механизм переноса протонов до конца неясен, но, ве-

роятно,

он представляет собой эстафетную передачу протона по

донорно-акцепторным

группам аминокислот (арг, тир, глу).

Фактор

F\ является полуфункциональным белком, включает не-

сколько

субъединиц и обладает сложной четвертичной

структу-

рой.

Работа АТФазы сопровождается кооперативными конфор-

мационными

перестройками, затрагивающими четвертичную

структуру.

Каким же образом энергия А цн+ может использо-

ваться в этом макромолекулярном

устройстве для синтеза

АТФ? Прежде всего отметим, что величина Д [хн+ определяет

лишь

вероятность или среднее число переноса протонов

между

поверхностями мембраны, но ничего не говорит о

«судьбе»

каждого протона в АТФазе. В одном из вариантов хемиосмати-

ческой гипотезы говорилось о том, что в активный центр АТФа-

зы

нагнетаются

«горячие»

протоны, которые разгоняются элект-

рическим

полем в протонном канале. Предполагалось, что за

счет кинетической энергии этих протонов и происходит переда-

ча энергии, нужной для преодоления активационного барьера

элементарном акте синтеза АТФ. Однако в конденсированной

белково-липидной фазе, где диссипация избыточной кинетиче-

ской

энергии

«горячих»

частиц в

результате

столкновений про-

исходит быстро (10~

— 10~

с), такой механизм невозможен

(см.

лекции, 8 9). По-видимому, в решении этой проблемы сле-

дует

отказаться от упрощенных физико-химических подходов,

заимствованных из теории активных соударений свободных ча-

стиц в растворах. В лекции 12 мы подробно рассматривали со-

временные биофизические теории механизмов ферментативного

катализа.

В последние годы появились биохимические результаты,

подтверждающие плодотворность такого подхода и к проблеме

механизмов сопряжения в Н+-АТФазе. Протонирование

депротонирование аминокислотных остатков в цент-

рах приводят к образованию локальных электриче-

ских полей, которые в свою очередь также влияют на

движение положительно заряженного комплекса АТФ с лиган-

дами. Таким образом, узким местом является перенос исходных

веществ и промежуточных и конечных продуктов реакции син-

теза АТФ, что обеспечивается и за счет влияния компонентов

электрохимического потенциала на процессы внутримолекуляр-

ной

диффузии в фермент-субстратном комплексе Н+-АТФазы.

Конечно,

все стадии

требуют

строгой координации во времени

пространстве и сбалансированности по зарядам этих процес-

сов,

что отражает направленный кооперативный характер функ-

ционирования

Н+-АТФазы в сопрягающих мембранах.

160