Рубин Л.Б. Лекции по биофизике

Подождите немного. Документ загружается.

резко

в узком диапазоне увеличения числа молекул воды (10—

20) на одну молекулу белка. В этой области происходит ра-

стормаживание определенных внутримолекулярных степеней

свободы, нужных для обеспечения ферментативной активности.

Можно

рассматривать систему белок — вода как единую коо-

перативную систему, где изменения в состоянии как раствори-

теля, так и белка носят взаимосвязанный характер.

Уникальность

структуры

белка.

Белок обладает определен-

ной

плотной структурой, которая образуется из первичной ами-

нокислотной

последовательности в

результате

согласованного

характера ближних и дальних взаимодействий. В этом смысле

структура

белка уникальна. Возникает вопрос, в какой степени

первичная

последовательность однозначно определяет тополо-

гию и функциональные свойства белковой

глобулы?

Известно,

что белки, выполняющие одинаковые функции в

разных организмах, отличаются по своей первичной последо-

вательности (например, цитохромы). Однако третичные струк-

туры

у них сходны. Но есть белки, обладающие сходными тре-

тичными

структурами, но выполняющие различные функции.

Оказалось также, что способностью формировать а- и

р-участ-

ки

с непрерывными гидрофобными поверхностями обладают не

только природные, но и случайные аминокислотные последо-

вательности полярных и неполярных групп. Таким образом,

для получения плотной упаковки белка нет необходимости аб-

солютно однозначно задавать его первичную последователь-

ность,

хотя функциональные свойства белка определяются срав-

нительно небольшим числом активных групп. И здесь уже си-

туация совершенно

иная.

В активном центре белка (фермен-

та),

где имеются, как правило, 5—6 остатков, нельзя заменить

ни

одного из них без нарушения функциональных свойств.

Поэтому комбинация незаменимых остатков в активном центре

белка должна воспроизводиться совершенно однозначно при

обязательном сохранении лишь общих топографических черт

глобулярной пространственной структуры.

Теперь, пользуясь формулами теории информации (6.2—6.3),

можно оценить вероятность случайного одноактного синтеза

белка. Вначале найдем количество информации, содержащей-

ся

в активном центре с аминокислотными остатками, число ко-

торых п = 5—6. Общее число способов W, которыми конструи-

руют

такой активный центр, выбрав из 20 аминокислот нужные

нам

5—6, составляет, очевидно,

№

= 20" = 20

— 20

. В таком

центре содержится количество информации, равное I =

\og

/ =

log

20"

4,3-JV

2O—30

бит.

Очевидно, это самое минимальное количество информации,

необходимое для синтеза белка. На самом

деле

незаменимы в

белке также и отдельные его характерные участки, которые

содержат, как правило, не менее N =

20—25

аминокислот. Тогда

количество биологически уникальной информации в белке бу-

дет уже больше. Оно составит величину

=log

«4,3-Ar«90—100

бит.

Вероятность случайного одноактного синтеза такой структуры

очень мала:

Р = ~ = 2-' Б =2-(

°-

100

)~10-

Это значит, что создание емкой информационной системы

белка не могло произойти в один акт, а осуществляется посте-

пенно

с обязательным закреплением синтезированных элемен-

тов структуры в процессах воспроизведения.

Особенности

пространственной

организации

нуклеиновых

кислот.

В отличие от белков

структура

ДНК более стабильна.

Тепловые флуктуации не приводят к разрыву водородных свя-

зей

и не меняют межплоскостные расстояния

между

основания-

ми.

В моделях жесткость служит основным параметром. Двой-

ная

спираль ДНК обладает общей жесткостью по длине спи-

рали и одновременно ограниченным числом вращательных сте-

пеней

свободы вокруг единичных химических связей. Все кон-

формации

ДНК относятся либо к А-, либо к В-формам. В слу-

чае В-форм ось спирали проходит через пары оснований вбли-

зи

их центра тяжести, а в Л-форме в центре остается отверстие

около

4 А, а основания оттеснены к периферии молекулы. Ос-

СЗ-эндо

О-

СЗ-экао

С2-экзо

С2-эндо

Рис.

8.7.

Формы

спирали

ДНК: четыре

наиболее

устойчи-

вые

конформации

сахарного

кольца

в нуклеотиде

новная

трудность полного описания энергетически разрешен-

ных конформаций двойных спиралей состоит в чрезвычайно-

большом наборе

всех

структурных вариантов.

Конформация

мономера нуклеиновой кислоты задается кон-

формацией

сахарного кольца, пятью двугранными углами вра-

щения

вокруг единичных связей в сахарофосфатной цепи и

одним

углом

х, определяющим ориентацию основания относи-

тельно сахарного кольца. Различие Л- и В-форм состоит в^том,

что у Л-формы отличаются значения

угла

х и

угла

поворота т

между

соседними парами, а также большие значения расстоя-

ния

D пары от оси спирали (рис. 8.7). Кроме того, альтернатив-

ная

геометрия сахарного кольца у Л- и В-форм определяется

тем, какой из атомов

углерода

выдвинут из плоскости сахар-

ного кольца. Наличие столь большого числа внутренних степе-

ней

свободы позволяет рассматривать процесс изменения кон-

формации

двойной спирали как непрерывный. Однако можно

ограничиться лишь «разумными» взаимоположениями пар ос-

нований.

Тогда оказывается, что для регулярной спирали суще-

ствует

только ограниченное число конформаций сахарофосфат-

ного остова. Расчеты показывают, что энергия Л-форм в целом

выше,

а ширина энергетической ямы уже, чем у В-форм. Это-

является следствием того, что расстояние

между

одноименно

заряженными

фосфатами одной и той же цепи примерно на

.1 А короче в Л-формах. Полный

учет

всех

взаимодействий по-

казывает, что В-форма является единственной устойчивой фор-

мой

ДНК.

В последние годы получены данные о существовании так

называемой z-формы ДНК, в которой спираль с антипараллель-

ными

нитями закручена влево, а повторяющаяся единица со-

держит не один, а два нуклеотида.

Лекция

9. ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНАЯ

ДИНАМИКА БЕЛКОВ

Зависимость функциональных свойств белков от их конфор-

мационного

состояния давно известна в биохимии. Однако оста-

ется неясным, под влиянием каких сил и механизмов изменя-

ется

это

состояние и какую роль оно играет в обеспечении их

активности.

В современной молекулярной биофизике централь-

ное

место занимает проблема механизма и функциональной

роли внутримолекулярной подвижности биополимеров, прежде

всего белков.

Решение

этой проблемы предусматривает получение количе-

ственных характеристик подвижности отдельных частей и атом-

ных групп и сопоставление их с функциональным состоянием

молекулы белка при различных условиях (температура, рН,

ионная

сила). Поскольку белок обладает гетерогенной прост-

ранственной

организацией, подвижность его отдельных струк-

турных единиц

будет

различной по своим характерным време-

нам

и амплитудам смещений. Кроме того, глубокие конформа-

ционные

перестройки всей молекулы белка не

могут

происхо-

дить сразу, а складываются из локальных микроинформацион-

ных смещений отдельных атомных групп. В итоге они приводят

уже к направленным перестройкам всей конструкции молекулы

белка вследствие взаимного смещения его отдельных частей по

определенным детерминистским степеням свободы. Приведем в

качестве примера последовательных, функционально значимых

перестроек в белке конформационные изменения гемоглобина

(НЬ).

Присоединение кислорода к атому железа

Fe+

приводит

смещению его на 0,7 А в плоскость гемовой группы. Это пер-

вичное микроинформационное смещение индуцирует в НЬ кас-

кад последовательных перестроек. Они включают смещение ги-

стидина к центру молекулы, смещение субъединиц с перестрой-

кой

системы водородных связей. При этом меняется и конфор-

мация

самих а- и р-субъединиц. После оксигенации первых

двух

а-субъединиц облегчается присоединение следующих мо-

лекул кислорода к остальным субъединицам, сродство которых

кислороду увеличивается в несколько сот раз. В этом и со-

стоит функционально направленный смысл кооперативных кон-

формационных

перестроек в НЬ. Физическая причина их состо-

•94

ит в том, что первоначальное равновесие сил необратима

нарушается в

результате

акта присоединения кислорода к

В молекуле НЬ должна установиться новая равновесная окси-

конформация,

которой уже соответствует

другое

взаимное ра-

сположение атомных групп. Процесс достижения этой конечной

равновесной

оксиконформации происходит через ряд последо-

вательных стадий как релаксация исходной дезоксиформы,.

ставшей неравновесной из-за быстрого присоединения кислоро-

да. Непосредственное изучение быстрых внутренних движенин

молекуле белка стало возможным лишь в последние годы,,

благодаря внедрению современных физических резонансных ме-

тодов радиоспектроскопии (электронный парамагнитный, ядер-

ный

магнитный, ядерный гамма-резонансы, методы люминесцен-

ции).

Остановимся кратко на физической сущности этих мето-

дов и получаемой с их помощью информации.

Основной

экспериментальный

подход

состоит в том, чтобы,,

изучая определенные физические параметры (люминесцентные,,

парамагнитные) специально внедренных во внутрь белка низ-

комолекулярных соединений, получить характеристику подвиж-

ности

окружающей их среды, т. е. характеристику внутримоле-

кулярной

подвижности белка.

Люминесцентные

методы

позволяют измерять внутримолеку-

лярную подвижность белка, изучая, как зависит от температу-

ры положение максимума люминесценции введенной в белок

метки максимума либо собственной люминесценции триптофана

белка. При поглощении кванта света люминесцирующей моле-

кулой один из

двух

зх-электронов переходит на возбужденный

синглетный уровень S

(рис. 9.1), а вся молекула при этом пе-

реходит в синглетное возбужденное состояние. При переходе в.

возбужденное-состояние запас коле-

бательной энергии молекулы крат- з&:=з5 i

ковременно

повышается, а затем за •>

время К)"

—10~

с происходит дис-

сипация

колебательной энергии и

релаксация

на нижние колебатель-

ные

подуровни того же самого

электронного

состояния S

. В воз-

бужденном состоянии Si молекула

живет т* =

10~

—10~

с, после чего

она

может вновь вернуться на ос-

новной

уровень So либо с испуска- ^

нием

кванта флуоресценции, либо

безызлучательно, рассеивая в теп-

ло энергию электронного возбужде- ГГжду'^нглеГшГЙ^Г

ния.

За время г* существования

триплетными (Т) состоя-

состояния

S] спин электрона на ниями молекулы

уровне Si может изменить свою ориентацию на противополож-

ную. Тогда он станет параллельным спину оставшегося

ранее спаренного

с ним

я-электрона.

этом

случае

происходит переход молекулы

триплетное состояние

Si-*-T,

котором спины электронов

на So- и

Г-уровнях параллельны

(рис.

9.1).

Переход

основное состояние

T-+S

теперь также

требует

переориентации спинов вновь

на

антипараллельную.

По-

этому вероятность Г—>-S

перехода мала,

время жизни

со-

стояния

велико

по

сравнению

состоянием

}

составляет

10~

—10~

с и

больше.

триплетного уровня молекула пере-

ходит

на

основной

испусканием света фосфоресценции.

При

нахождении

возбужденном состоянии

или Т в

молекуле

изменяется

электрический дипольный момент, влияющий

на

диполи окружающей среды.

За

время жизни молекулы

в воз-

бужденном состоянии диполи среды

могут

успеть переориенти-

роваться

соответствии

полем возбужденного диполя.

Это

произойдет, если время дипольной релаксации окружающей

среды

много меньше времени

г*

возбужденного состояния

(т

<Ст*).

Тогда соответственно

будет

понижен энергетический

уровень возбужденной молекулы,

максимум

ее

спектра

флу-

оресценции

сдвинется

длинноволновую область. Если

же

3>т*,

то

переориентация диполей среды

не

успеет произойти,

т.

е. в

этом

случае

окружение флуоресцирующей молекулы

же-

сткое

и не

влияет

на

положение максимума полосы

ее

флуорес-

ценции.

Ценную информацию

внутримолекулярной подвижно-

сти белков получают, изучая таким путем собственную флуорес-

ценцию

триптофана. Положение максимума

его

флуоресценции

сильно

зависит

от

подвижности диполей среды

может варьи-

ровать

до 30 нм. В

сложной системе белка время реорганизации

окружающей триптофан среды может быть больше времени

его электронного Si-возбуждения

(т*~5 не),

особенно

при низ-

ких темрературах. Действительно, оказалось,

что

снижение

тем-

пературы

диапазоне

от 0° до —20°

приводит

сдвигу

на 5—

нм, а в

диапазоне температур

от —20° до —90° к

сдвигу

на

4—9

нм

положения максимума флуоресценции триптофана

коротковолновую сторону спектра.

Это

говорит

заморажива-

нии

движений

белковой матрице

наносекундной области.

Высушенные белки

не

дают

этих спектральных сдвигов,

что

свидетельствует

необходимости присутствия

структуре

бел-

ка

воды

для

обеспечения

его

подвижности. Система белок—•

вода замерзает

как

единая микрофаза. Если вводить

белок

экзогенные

фосфоресцирующие метки (например, производные

эозина),

то

таким способом можно оценивать более длинные

характерные времена структурных перестроек

(до 1 с).

Оказа-

лось,

что в

глубоких слоях белковых макромолекул происходят

медленные движения

~1 с, а в

более поверхностных слоях

эти

движения существенно быстрее:

~10-

с.

Надо ясно

по-

нимать,

что

найденные времена характеризуют подвижность

только ближайшего микроокружения люминесцирующего хромо-

фора

и не

могут

распространяться

на всю

макромолекулу.

Чис-

ло

места локализации таких люминесцирующих меток

в бел-

•

= 4- —

Рис.

9.2. Расщепление энергетических уровней электрона (про-

тона) в магнитном поле (Н)

ке

зависят их от химических особенностей и от характера взаи-

модействия с белковыми группами.

Методы

радиоспектроскопии

включают главным образом

метод

электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и ядер-

ного магнитного резонанса

(ЯМР).

Физические основы этих

методов достаточно сложны и подробно изложены в специаль-

ных

руководствах

и учебниках. Здесь мы кратко остановимся

лишь

на тех вопросах, которые необходимы для понимания их

применения

в биофизике. Как электроны, так и ядра атомов об-

ладают

собственным магнитным моментом, или спином. Если

систему таких спинов поместить в постоянное внешнее магнит-

ное

поле Н

, то спины

будут

ориентироваться вдоль поля.

Энергетический уровень расщепится на два уровня. Энергия

электрона

со спином 5=—

будет

теперь зависеть от того,

параллельно (верхний уровень) или антипараллельно (нижний

уровень) направлению поля Н

расположены спины (рис. 9.2).

Соответственно нижний уровень займут ядра протона (спин 1/2

с антипараллельным, а верхний уровень — с параллельным по-

лю Н

направлением спинов (рис. 9.2)).

Разность

энергетических уровней составляет величину

В формуле (9.1) g — постоянная величина, так называемый

g-фактор электрона или ядра, который для свободного электро-

на

равен

2,0023,

а для ядра протона — 5,58. Величина

р"

— маг-

нетон

Бора, равный для электрона ~ 10~

эрг/Гс, или ядер-

4—569

отношенде заселенностей зависит

от

разности энергий

Д£=

(9.2)

Наложим теперь на эту систему помимо постоянного Н

еНеНИНОе

Ле

ЧаСТ

Т0Й

перпендикулярное

по

обратных

тя

(9.3)

внешнего поля Я

=10< Гс резонансная часто-

ста от величины постоянного магнитного

поля

наблюдается

Резонансное поглоще

Как

видно

из рис. 9.3, сиг-

нал ЭПР

обладает

не узкой ли-

нией,

а полосой поглощения с

определенной шириной. Это зна-

чит, что на самом

деле

сами

энергетические уровни спинового

состояния несколько размыты,

т. е.

обладают

определенной ши-

риной

Г. Основная причина это-

го состоит в том, что взаимодей-

ствие с внешними магнитными

полями не является единствен-

ственным процессом обмена энер-

гией в системе ориентированных

спинов.

Она не изолирована, а

взаимодействует также и с окру-

энергию со средним временем^ ЭтГ" пр^^

ствует

выравниванию заселенностей

] И Т

ПОД

вием переменного поля С '

Рис

LB4

9.3. Линия поглощения

-поля

(а) и ее первая про-

изводная

(б)

ствует

выравниванию заселенностей

] И Т

ПОД

ffil

вием переменного поля.

Существуют

'и

другие

процессы

•обмена энергией в самой системе спинов, которые влияют

друг

на

друга

и изменяют энергии спиновых состояний. Спин-спино-

вые взаимодействия создают дополнительные локальные маг-

нитные поля в

местах

расположения соседних спинов и тем

самым меняют строгое условие резонанса (9.3), уширяя

общую

линию поглощения. Процессам спин-спинового взаимодействия

соответствует

время Т

, в течение которого сохраняется относи-

тельная энергия данного спинового состояния. Очевидно, время

сохранения спинового состояния тем больше, чем меньше

спин-спиновое

взаимодействие. Описанные релаксационные про-

цессы распада исходных спиновых состояний приводят к

тому,

что положение энергетического уровня спинов становится не-

сколько неопределенным и характеризуется шириной Г.

В квантовой механике связь

между

временем т существова-

ния

данного состояния и шириной Г его точного энергетического

уровня (Е

) дается соотношением неопределенностей для энер-

гии

Г-т~й,

(9.4)

тде ff — постоянная Планка h, деленная на

2я(Й=й/2я).

Та-

ким

образом, истинное положение энергетического уровня (Е

)

состояния электрона в системе с временем релаксации Т

может

быть определено по положению линии резонанса с точностью

до Й/Г] (Е

± —

)•

При т^-оо ширина Г->0 и энергия Е

на-

ходится точно. В общем

случае

ширина линии резонанса опре-

деляется как

ЛЯ~+-!-,

(9.5)

Для свободных радикалов Г]3>Г

и ширина линии ЭПР

зависит в основном от времени Т

ДЯ~4~*

(

)

' 2

Нас

интересует вопрос, каким образом связана ширина с ха-

рактером внутримолекулярной динамики в исследуемом образ-

це? Если вязкость в образце мала, то за

счет

быстрых молеку-

лярных движений взаимные влияния спинов

успевают

усред-

ниться при поглощении переменного поля. В этом

случае

резо-

нанс

наблюдается при усредненной линии с уменьшенной

шириной.

Наоборот, замораживание раствора и уменьшение

его вязкости вновь замедлят молекулярные движения.

Тогда

при

поглощении энергии переменного поля спины

успевают

по-

4* 99

чувствовать влияние разных локальных полей в своем микро-

окружении, что уменьшит время Т

сохранения спинового со-

стояния

и вызовет уширение общей линии резонанса. Таким

образом, измеряя ширину линии поглощения, можно получить

данные о характере внутримолекулярных движений в микро-

окружении спиновой частицы (радикал, протон). В методе спи-

новых меток к функциональной группе белка присоединяют

свободный радикал, дающий сигнал ЭПР. Характеристики сиг-

нала ЭПР являются показателем подвижности микроокруже-

ния

этого радикала. Наиболее удобны нитроксильные метки,

содержащие свободнорадикальную группу N—О, где неспарен-

ный

электрон фактически делокализован

между

атомами N и

О. Сигнал ЭПР этой метки имеет определенную

структуру,

ко-

торая обусловлена влиянием магнитного момента ядра азота

на

неспаренный электрон наряду с действием на него внешнего

магнитного поля. Вращение нитроксильного радикала относи-

тельно направления внешнего поля изменяет

структуру

сигнала

ЭПР.

Существуют методы расчета, которые позволяют по пара-

метрам сигнала ЭПР оценить характерное время т

вращения

метки.

Оказалось, что время вращения метки зависит от глуби-

ны

ее погружения в слоях белковой глобулы. В наружном вод-

ном

слое значения т

составляют

10~

—10~

с. Поверхно-

стные слои характеризуются значениями

~Ю~

—10~

и,

наконец,

в глубоких слоях плотного гидрофобного ядра

глобу-

лы

~10~

—10~

с.

Было обнаружено также резкое увеличе-

ние

ферментативной активности высушенных препаратов реак-

ционных

центров фотосинтеза при их увлажнении, которое кор-

релирует с одновременным падением значений т

спин-метки.

Это говорит об изменении динамического состояния и одновре-

менном

появлении внутримолекулярной подвижности и функци-

ональной

активности белка.

Метод ЯМР. Изучение динамики белковых

структур

методом

ЯМР

основано на измерении времени релаксации Т\ и Т

па

ширине

линии резонанса. На основе этих данных удается най-

ти значения т

для ядер, на которых наблюдается резонанс.

Изучая протонный резонанс, можно в принципе оценить под-

вижность белковых групп, в состав которых

входят

«резониру-

ющие» протоны. Метод ЯМР позволяет изучать определенные

виды внутримолекулярного движения в белках. Так, темпера-

турные измерения времени Т

в сывороточном альбумине обна-

руживают вращения метальных групп с временами т

1(Н

при

—100°

наблюдаются более медленные движения

~10-

(возможно,

осцилляции полипептидной

цепи).

По времени Т

для протонного резонанса удается определить три характерных

диапазона времен т

: медленное вращение глобулы как целого-

(тс~Ю-

с),

внутренние движения (т

~Ю-

—10~

с), движе-

ние

внешних наиболее подвижных групп белка (tc^ 10~

с).

Метод ЯМР

дает

важную информацию и о химической струк-

100