Попкова К.В. Общая фитопатология

Подождите немного. Документ загружается.

Если поражены проводящие сосуды, то для выделения бак-

терий отбирают участки с начальными признаками поражения,

измельчают их и высевают на питательную среду.

Из корней, клубней и луковиц бактерии выделяют так же,

как из листьев и стеблей: сначала исследуемый материал тща-

тельно моют под сильной струей воды, затем стерилизуют, из-

мельчают и высевают в чашки с питательной средой.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПАТОГЕНА.

ИНОКУЛЯЦИЯ РАСТЕНИЙ

Фитопатогенные бактерии определяют по следующим критериям:

патогенности;

морфологии клетки и колонии;

физиологическим и биохимическим свойствам бактерий.

УСТАНОВЛЕНИЕ ПАТОГЕННОСТИ

Для достоверного установления бактериальной этиологии болез-

ни необходимо в соответствии с правилом Коха выполнять сле-

дующие требования:

выделить возбудителя болезни в чистую культуру;

путем инокуляции растений чистой культурой возбудителя

получить на растениях те же симптомы, которые наблюдаются

на исходных больных растениях;

повторно изолировать возбудителя из искусственно заражен-

ных растений;

сравнить реизолированного возбудителя с исходным;

оба возбудителя должны быть идентичными.

Для проверки на патогенность используют, как правило, те

виды растений, из которых был изолирован возбудитель. Иссле-

дуемые чистые культуры используют в возрасте 24—48 ч. Бак-

терий смывают стерильной водой и полученную суспензию дово-

дят до требуемой концентрации (число бактериальных клеток

на 1 мл); т. е. разбавляют суспензию стерильной водой. Плот-

ность суспензии (концентрацию) определяют по стандартной

шкале мутности. Приготовленную суспензию используют для

заражения растений.

ИНОКУЛЯЦИЯ ОПРЫСКИВАНИЕМ

ИЛИ ИНЪЕКЦИЕЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ

СУСПЕНЗИИ

Для выявления фитопатогенных бактерий, вызывающих пятни-

стости листьев, растения заражают путем опрыскивания бакте-

риальной суспензией. Перед заражением растения на один-два

25*

355

.дня помещают во влажную камеру, например под стеклянный

колпак. В такой камере устьица растений максимально откры-

ваются, что способствует лучшему проникновению бактерий в

листья. После инокуляции растения выдерживают при повышен-

ной влажности воздуха (80—95%) в течение двух-трех дней.

Бактериальную суспензию можно вводить в межклетники при

помощи медицинского шприца, прокалывая иглой с затуплен-

ным концом эпидермис с нижней стороны листа.

ИНОКУЛЯЦИЯ ЧЕРЕЗ РАНКИ

Иглой или скальпелем повреждают стебли или другие органы

растений (плоды, корнеплоды и т. д.) и на место поранения на-

носят бактериальную суспензию. Для повреждения стеблей уда-

ляют листья, почки. При заражении листьев можно предвари-

тельно повредить эпидермис, натирая его карборундом.

Для заражения бактериями, вызывающими увядания, сре-

зают корни у основания растения и помещают его в бактериаль-

ную суспензию на 2—3 ч.

Бактериальная природа заболевания считается доказанной

в тех случаях, когда при искусственном заражении (инокуля-

ции) на растении появляются типичные симптомы. Продолжи-

тельность инкубационного периода составляет от нескольких дней

до месяца и больше в зависимости от вида фитопатогенной бак-

терии и поражаемого растения.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОТЕСТОВ

В литературе описано много методов искусственного зараже-

ния растений, позволяющих сравнительно легко и быстро обна-

руживать возбудителей бактериозов. Некоторые из этих биоте-

стов приведены ниже.

Тест на мокрую гниль по Штаппу основан на

способности возбудителей мокрой гнили быстро разрушать ткань

клубня картофеля, ломтики лука или моркови. Клубни картофе-

ля тщательно моют, поверхностно стерилизуют и разрезают на

половинки или ломтики. Пораженную ткань исследуемого мате-

риала растирают и смешивают с водой. Полученную суспензию

пипеткой наносят на кусочки клубней таким образом, чтобы они

были полностью покрыты ею. После этого материал помещают

в термостат и выдерживают в течение двух суток при 20°С. Если

в анализируемом растительном материале присутствовали воз-

будители мокрой гнили, например Егтта сагоШога зиЬзр. са-

го^ога, то ткань размягчается и загнивает. Для выявления воз-

будителей мокрой гнили вместо клубней картофеля можно ис-

пользовать ломтики луковиц лука или моркови.

356.

Тест на растениях баклажана для обнаруже-

ния С1ао1ЬаЫег тШ§апепз1з зиЬзр. зерейотсиз — возбудителя

кольцевой гнили картофеля. Растения баклажана выращивают

из протравленных семян при 22-25°С. Ииокулируют их в фазе

двух-трех настоящих листьев, когда стебли растении достигают

в диаметре 1,5 мм. Бактериальную суспензию готовят^ путем

смыва чистой культуры бактерий или из измельченной пора-

женной ткани и вводят шприцем с очень тонкой иглои в верхуш-

ки стеблей. При температуре инкубации 20—25 С бактерии

активно размножаются в растениях баклажана. Симптомы по-

ражения—одностороннее увядание, пожелтение, деформация

листьев — появляются через 15—35 дней после инокуляции в за-

висимости от концентрации суспензии. Появление типичных

симптомов указывает на присутствие возбудителя. .

Тест на плодах груши для обнаружения Ьгт-

таатиШога основан на специфической реакции незрелых пло-

дов груши на заражение возбудителем бактериального ожога

груши Бактериальную суспензию готовят из чистои культуры

ичи измельченной пораженной ткани и вводят в плоды груши.

Вместо бактериальной суспензии для инокуляции можно исполь-

зовать кусочки пораженной ткани. В незрелом плоде прокалы-

вают дырочки стерильным пинцетом или препаровальной иглои

и вдавливают в них измельченную пораженную ткань. По исте-

чении двух —семи дней в местах инокуляции выступают харак-

терные беловатые пятна слизи. Этот симптом свидетельствует-

о присутствии возбудителя бактериального ожога груши.

МОРФОЛОГИЯ КЛЕТОК и КОЛОНИЙ

Фитопатогенные бактерии по форме клеток делят на три типа::

короткие палочки (например, виды родов РзеиЛотопаз, Хап1ко-

топаз, Егтта)- длинные палочки (некоторые виды рода ШсИ-

1из) и клетки различной формы (например, виды родов ыагл-

Ьакег и НЫгоЬшт). Этот признак пригоден для идентификации

только в сочетании с другими показателями, в частности, с опре-

делением точного размера бактерии.

При определении бактерий важно установить и их подвиж-

ность Ее определяют различными путями, например в «висячей

капле», и используют для быстрого выявления неподвижных ви-

дов (например, из рода СШЬаЫег). Для более точного отнесе

ния подвижных форм к определенным родам используют такой

показатель, как жгутикование, так как в первую очередь бакте-

рии дб тят на безжгутиковые (неподвижные) и жгутиковые (по-

движные) Тип жгутикования установить очень трудно, для этого

требуются различные красители или электронно-микроскопиче-

ские исследования.

При идентификации бактерий используют окрашивание по

Граму. Как уже подчеркивалось ранее, результат этого анализа

зависит от состава и структуры клеточных оболочек. Грампо-

ложительные фитопатогенные бактерии найдены пока лишь в

родах ВасШиз, С1оз(гШ1ит и С1ш1Ъас1ег. В то время как другие

роды, включающие фитопатогенные виды, относятся к грамот-

рицательным.

Перечисленные признаки характерны для больших групп

бактерий и могут быть использованы при установлении их ро-

довой принадлежности. То же относится и к морфологии бакте-

риальных колоний.

Морфологию бактериальных колоний устанавливают при вы-

ращивании бактерий на твердой питательной среде. Структура

колоний меняется в зависимости от субстрата и не всегда посто-

янна для представителей одного вида. Поэтому при диагностике

видов этот признак используют как дополнительный. Колонии

микроорганизмов могут быть плоскими, выпуклыми или с возвы-

шением в центре, иметь гладкие, волнистые или расплывчатые

края. Важно учитывать и окраску колоний — прозрачная или

белая, кремовая, бурая, красная или синяя. Некоторые ввды бак-

терий выделяют в среду пигменты.

БИОХИМИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ

ПРИЗНАКИ

Поскольку между видами бактерий существуют незначительные

морфологические различия, для идентификации их широко ис-

пользуются физиологические показатели, в первую очередь по-

требность бактерий в питательных веществах и активность об-

менных реакций. Так, для диагностики используют особые фор-

мы расщепления углеводов.

Самые важные обменные вещества бактериальных клеток —

белковые соединения. Использование бактериями для питания

определенных труднодоступных белков учитывают при диагно-

стике видов. Различают пять основных признаков, определяю-

щих способность использовать белки:

разжижение желатина;

выщепление аммиака из белковых соединений;

расщепление серосодержащих белковых веществ с образо-

ванием сероводорода;

способность образовывать индол;

реакция на лакмусовое молоко, содержащее большое коли-

чество лактоз, глюкоз, два молочных белка и лакмус (в зависи-

мости от источника питания бактерии вызывают неодинаковую

окраску лакмусового молока — розовую, синюю, светлую).

358.

СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

Диагностика возбудителей бактериальных болезней очень слож-

на Часто исследования требуют нескольких месяцев. В условиях

производства эти методы неприемлемы. В связи с этим разра-

ботаны методы серологического анализа фитопатогенных бакте-

пий Серологический анализ позволяет быстро определять пато-

ген ' Для осуществления его нужна антисыворотка к используе-

мому виду бактерии, которую получают в лаборатории и

выписывают в готовом виде. „„„„,,

Наиболее распространена методика, основанная на реакции

агглютинации. На обезжиренное предметное стекло наносят

каплю слаборазбавленной суспензии определяемой бактерии и

смешивают с каплей диагностической антисыворотки. Контролем

служит смесь той же суспензии с нормальной сывороткой. Сме-

ненные капли выдерживают 1-2 ч при 24°С или (в зависимо-

сти от вида диагносцируемой бактерии) при 30-37 С. При по

ложительной реакции в капле смеси образуются хлопья, при

отрицательно/ видно равномерное помутнение^ Положительная

реакция свидетельствует о принадлежности бактерии к тому

виду, который был использован в качестве антигена при при-

готовлении сыворотки. „

Смесь бактериальной суспензии с нормальной сывороткой

не должна давать хлопьев; если они появились, анализ необхо-

димо повторить.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ

ГРИБНЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Грибные болезни (микозы) - самая многочисленная группа ин-

фекционных болезней растений. Растения каждого вида могут-

поражаться разнообразными по паразитическои специализации

фитопатогенными грибами, а одни и те же патогены - вызывать

заболевания у растений разных систематических групп, т. е. на

одном растении может быть несколько видов возбудителени

один вид возбудителя может поражать разные виды растении.

' Все патологические изменения, происходящие в растении под

воздействием фитопатогенных грибов, проявляются внешне хо-

рошо различимыми симптомами. Для микозов наиболее типич-

ны следующие признаки:

образование на пораженных органах пустул, спороложа, скле-

ооций пикнид, мицелиального налета;

изменение окраски пораженных органов (пятна, полосы);

увядание или отмирание растений в сочетании с изменением

окраски корней или побурением сосудов стебля;

сухие гнили;

образование наростов на корнях растений семейства кресто-

цветные (капустные) и на клубнях картофеля.

Многие перечисленные симптомы встречаются при заболе-

ваниях, вызванных возбудителями других групп или абиотиче-

скими причинами. Так, изменения окраски сопровождают многие

неинфекционные, а также вирусные и бактериальные заболева-

ния; побурение сосудов (но с выделением слизи) проявляется

при заражении растений бактериями и пр.

В некоторых случаях один и тот же гриб на разных частях

одного и того же растения или на разных стадиях онтогенеза

растения или патогена вызывает неодинаковые симптомы. Так,

возбудитель гельминтоспориоза пшеницы [Огескз1ега зогокшапа

(5асс.) ЗЬоет.] способен вызывать корневую гниль, белоколо-

сость, бурую пятнистость листьев и черный зародыш семян, воз-

будитель фитофтороза картофеля и томата (Рку(орк(рога 1п[ез-

(апз) — пятнистость листьев, гниль клубней и плодов. Ржавчин-

ные грибы в урединиостадии имеют бурые (ржавые) пустулы,

а в телиостадии — черные и т. п.

Заражение некоторыми грибами вызывает настолько харак-

терные симптомы, что их можно использовать для диагностики

заболевания (головня; склероции при спорыньи злаковых куль-

тур; наросты на клубнях картофеля, вызываемые возбудителем

рака; «кармашки слив»).

Если причину болезни не удается установить по симптомам,

отбирают одно или несколько больных растений с корнями и при-

ставшей к ним почвой для последующего исследования в лабо-

ратории. Если установлено присутствие возбудителя на пора-

женных органах растения (например, пикниды на листьях, скле-

роции на стебле и т. д.), то достаточно отделить такие органы

для последующего исследования. Идентификация возбудителя

болезни включает три этапа:

выявление и определение возбудителя непосредственно на

больном растении;

выделение возбудителя в чистую культуру (если его не уда-

лось определить на предыдущем этапе) и идентификация по

морфологическим признакам (морфология спор, спороносцев

и т. д.);

проверку патогенности изолированного гриба (в сомнитель-

ных случаях) по его способности вызывать болезнь у растений.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ

НА РАСТЕНИЯХ

Определение фитопатогенных грибов основано на их морфоло-

гических признаках. Особое значение имеют споры (зооспоры,

конидии, ооспоры, аскоспоры, головневые споры, телиоспоры),

360.

спороносцы, плодовые тела (спорангии, клейстотеции, перитеции,

апотеции, пикниды), видоизменения мицелия (склероции, при-

датки клейстотециев настоящих мучнисторосяных грибов, ана-

стамозы, щетинки, пряжки).

По наличию мицелия устанавливают только грибную приро-

ду болезни, по строению мицелия (несептированный и септиро-

ванный) относят возбудителя к низшим или высшим грибам.

Только в отдельных случаях при диагностике грибов используют

гифы мицелия и мицелиальные тяжи.

ДИАГНОСТИКА ПО ВНЕШНИМ ПРИЗНАКАМ

Исследование возбудителя на растении осуществляют в сле-

дующем порядке. Прежде всего растение или его части внима-

тельно осматривают для выявления спороношений или плодовых

тел гриба. При обнаружении таких структур готовят препарат

и просматривают его под микроскопом. Если при осмотре не

были выявлены структуры гриба, растение тщательно моют в

проточной воде, а затем исследуют пораженные места при по-

мощи лупы. При обнаружении пикнид и других плодовых тел

также готовят водный препарат для просмотра под микроско-

пом. Если спороношение не выявлено и в этом случае, поражен-

ные части растений выдерживают во влажной камере в течение

нескольких дней. Высокая влажность стимулирует у многих гри-

бов не только рост мицелия, но и спороношение, что облегчает

определение возбудителя.

В тех случаях, когда спороношение не найдено, структуры

гриба можно выявить в тканях растения. Для этого из них

удаляют хлорофилл (осветление частей растений). Готовят сре-

зы пораженных тканей растения, а затем изучают их под мик-

роскопом.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ И АНАЛИЗ

МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

На чистое предметное стекло, обезжиренное 40%-м раство-

ром этилового спирта, наносят пипеткой одну-две капли воды.

Препаровальной иглой отделяют небольшое количество налета

мицелия или споровой массы, переносят в каплю воды и измель-

чают второй иглой. Если налет мицелия не удается отделить

от ткани растения, острым скальпелем или препаровальной

иглой отделяют маленький кусочек пораженной ткани, перено-

сят в каплю воды, измельчают двумя иглами и накрывают по-

кровным стеклом. В большинстве случаев размеры исследуемых

361.

объектов настолько велики, что сначала их рассматривают при

малом увеличении микроскопа и только для более детального

исследования используют большое увеличение.

ВЫДЕРЖИВАНИЕ РАСТИТЕЛЬНОГО

МАТЕРИАЛА ПРИ ВЫСОКОЙ ВЛАЖНОСТИ

Камерой может служить любой закрытый сосуд, в котором мож-

но создать относительную влажность воздуха 100%- Для этого

пригодны чашки Коха и чашки Петри. Дно и крышку чашки вы-

стилают влажной фильтровальной бумагой. При этом нельзя

допускать скопления воды на дне чашки, чтобы не вызвать за-

гнивания материала.

Перед помещением во влажную камеру исследуемыи мате-

риал тщательно моют проточной водой. Клубни, плоды и корне-

плоды, стебли и аналогичные части растений поверхностно де-

зинфицируют спиртом или перманганатом калия. Затем мате-

риал разрезают на части для более быстрого прорастания мице-

лия на поверхность, при этом нож или скальпель периодически

обжигают (стерилизуют). Листья раскладывают в чашке целыми

или разделяют на части, если они не помещаются в ней

Влажные камеры выдерживают при температуре 15—20 С.

Если исследуемый возбудитель хорошо растет и при более низ-

ких температурах, то устанавливают температуру 8—10 С, кото-

рая задерживает развитие сапротрофных грибов, затрудняющих

выявление возбудителя. Продолжительность инкубации во влаж-

ной камере зависит от времени, которое необходимо для образо-

вания спор. Обычно этот период ограничен одним —тремя дня-

ми, но иногда продолжается до двух недель. В это время перио-

дически контролируют влажность и при необходимости филь-

тровальную бумагу в чашках увлажняют.

ВЫДЕЛЕНИЕ ГРИБОВ В ЧИСТУЮ КУЛЬТУРУ

Пораженные растения моют в проточной воде, отделяют пора-

женные части. В тех случаях, когда растения увядают, для ис-

следования берут нижнюю часть стебля и корни. Части расте-

ний, предназначенные для выделения патогена, поверхностно

дезинфицируют, промывают стерильной водой и разрезают на

кусочки длиной 1—2 см. Материал размещают в чашках Петри

с агар-агаром и ставят в термостат при 20°С. Ежедневно чашки

просматривают. Как только мицелий возбудителя начинает про-

растать из срезов и переходит на питательный субстрат, его пе-

реносят на чистую питательную среду в другую чашку. Затем

гриб определяют по типу спороношения.

Определение фитопатогенных грибов проводят преимущест-

362.

ВаШЖшШшНнЖет

юмкм

Рис. 104. Формы спор некоторых грибов:

а — зооспоры (слева — грибов рода плазмодиофора. справа— рода синхитриум); б —

ооспоры грибов рода фитофтора; г — конидии (слева — грибов рода фома, в центре —

рода септория, справа — рода фузариум); в — аскоспоры (слева—грибов рода плеоспора,

справа — рода клавиденпс); д — головневые споры (слева — грибов рода устилаго, в цент

ре — рода уроцистис. справа — рода тиллеция); е — телиоспоры (слева — грибов рода уро-

мицес, справа — рода пукциния)

венно по морфологическим признакам плодовых тел и спор

(рис. 104). Споры диагностируют по окраске, форме, размеру,

наличию перегородок и типу прорастания. Идентификацию фи-

топатогенных грибов в культуре (Т УНГО) осуществляют по бес-

полому спороношению — спорангиям с зооспорами, конидиям,

пикнидам с пикноспорами, хламидоспорами и т. д. Дополнитель-

но можно использовать для диагностики конидиеносцы, а также

особые образования мицелия (пряжки, анастомозы, склероции

и др.).

Если гриб, изолированный из пораженных частей растения,

не образует спороношения, применяют методы стимуляции спо-

рообразования, например специальные питательные субстраты,

определенный режим света и температуры, высокую влажность

воздуха.

У некоторых фитопатогенов диагностическим признаком мо-

жет быть характер прорастания спор. Например, у грибов рода

363.

дрехслера (йгесНзкга, син. НеЫШкозропит) ростковые трубки

появляются из всех клеток споры, в то время как у видов рода

биполарис (В1ро1апз, син. НеЫШозропит) прорастают только

концевые клетки споры.

Размеры спор учитывают в первую очередь при разделении

отдельных видов грибов в пределах рода.

ПРОВЕРКА ПАТОГЕННОСТИ

ИЗОЛИРОВАННЫХ ГРИБОВ

Для оценки патогенности грибов, изолированных из больных

растений, проводят искусственное заражение. При этом учиты-

вают пути естественной передачи патогена: через корни —для

возбудителей, поражающих корни или проводящие сосуды; через

листья —для возбудителей болезней листьев; через колосья —

для возбудителей болезней колоса; через цветки —для возбуди-

теля пыльной головни пшеницы (1)зШа

о ШИО)- через пророст-

ки—для возбудителя твердой головни пшеницы {1 ШеПа сомго-

Vе^8а КиеЬп.) и т. д.

В качестве инфекционного материала используют споры воз-

будителя их наносят на растение путем опыления, опрыскива-

ния или мазком (суспензия). Концентрация суспензии должна

быть оптимальной для каждого возбудителя. При отсутствии

спор применяют для заражения мицелий в виде суспензии или

проросших агаровых блоков.

Для оценки патогенности берут только восприимчивые сорта

в условиях, благоприятных для заражения (свет, температура,

относительная влажность воздуха). Поддержание высокой от-

носительной влажности приобретает особое значение в период

прорастания спор, в начале роста кусочков мицелия и во время

проникновения возбудителя в растение. Этот период составляет,

как правило, 24—48 ч.

Легко регулировать условия влажности в теплицах путем оп-

рыскивания растений водой, можно использовать специальные

влажные камеры и т д.

Патогенность грибов в зависимости от их паразитическои спе-

циализации устанавливают, заражая почву, растения или их

части.

ЗАРАЖЕНИЕ ПОЧВЫ

Оценку патогенности возбудителя, изолированного из корней или

проводящих сосудов, можно осуществлять при заражении^поч-

вы с последующим выращиванием на ней растении восприимчи-

вого сорта соответствующей культуры. Почву перед заражением

дезинфицируют, чтобы исключить возмсжность заражения расте-

364.