Оберемок В.В. Методические рекомендации к применению ПЦР-метода

Подождите немного. Документ загружается.

Лекция 4. Типичные ошибки при проведении ПЦР

Метод ПЦР состоит из большого числа последовательных и

аккуратных действий. Способность контролировать каждый

свой шаг в этом методе приходит со знаниями и опытом.

Очень важным моментом является воспроизводимость

результатов ПЦР. Для того чтобы этот показатель был высоким,

нужно стандартизовать условия проведения ПЦР. Условия

должны быть одинаковыми для всех проб.

Рассмотрим типичные источники ошибок, встречающиеся

на каждом из этапов ПЦР.

Этап выделения ДНК.

1. Неправильное хранение биологического материала.

2. Загрязнение проб.

3. Нарушение очередности действий в этапе выделения ДНК.

4. Истечение срока годности реактивов для выделения ДНК.

Этап амплификации ДНК.

1. Нарушение пропорций при смешивании реактивов для

амплификации.

2. Использование праймера, не способного отжигаться на ДНК

данного организма.

3. Загрязнение проб ДНК из соседних пробирок (при отсутствии

смены наконечников).

4. Истечение срока годности реактивов для амплификации ДНК.

Этап детекции продуктов амплификации.

1. Использование силы тока и напряжения, неподходящих для

электрофореза ДНК.

2. Неправильное подключение камеры для электрофореза

(ДНК-фрагменты всегда двигаются к аноду).

3. Испорченный трис-боратный буфер. Это возможно при

неправильном хранении либо при продолжительном

использовании буфера.

4. Неправильное приготовление и старение агарозного геля

(высокая хрупкость, сомкнутые стенки лунок и т. д.).

Лекция 5. Применение ПЦР для разных видов научно-

исследовательской работы

Использование ПЦР-метода обычно происходит в

следующих двух типах ситуаций.

1. Используется специфические праймеры, которые будут

отжигаться на определенном участке ДНК, заранее известном

исследователю (фото 4). То есть, известны места отжига

праймера и расстояния между сайтами отжига праймеров. Это

может быть определенный ген, теломеры хромосом,

палиндромы и т. д. Для того, чтобы знать последовательность

определенного участка ДНК, нужно прежде провести

секвенирование данного фрагмента. Когда последовательность

установлена и подобран праймер, можно проводить ПЦР.

M F

М – маркер молекулярных весов ДНК от 200 до 1000 п.о. с шагом в 100

п.н., F – фрагмент вирусной ДНК длиной 317 п.н.

Фото 4. Продукт амплификации вирусной ДНК со

специфическими праймерами, выделенной из полиэдров вируса

ядерного полиэдроза непарного шелкопряда

Специфические праймеры используется, например, в

диагностике инфекционных заболеваний. Для этого

подбирается (например, в GeneBank) и синтезируется праймер,

который будет отжигаться только на ДНК определенного

возбудителя заболевания.

2. Используется праймер (праймеры), который будет

отжигаться случайно на ДНК. Такая разновидность ПЦР

называется RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA,

случайно амплифицированная ДНК). Часто используется для

изучения генетического полиморфизма в популяциях. При этом

невозможно предсказать точно ни длину наработанных

фрагментов, ни их число (фото 5). Кроме этого, всегда

существует вероятность, что используемый праймер не

сработает. Поэтому перед началом исследований подбирают

подходящий праймер.

1.1, 2.1,3.1, 4.1, 5.1, 6.1, 7.1 – исследовалась поверхность яиц на наличие

вирусной ДНК; 1.2, 2.2, 3.2, 4.2, 5.2, 6.2, 7.2 – исследовалось содержимое яиц

на наличие вирусной ДНК; М – маркер молекулярных весов ДНК от 100 до

1000 п.о. с шагом в 100 п.о.; 00, 01, 02, 03 – условные зоны продуктов

амплификации вирусной ДНК

Фото 5. Продукты амплификации ДНК вируса ядерного полиэдроза с

поверхности и изнутри яиц непарного шелкопряда (праймер OPA-08)

Для примера смоделируем исследовательскую ситуацию.

Например, существует организм А, на который действует

фактор B (биотический или абиотический). Если произведено

секвенирование генома организма А, найдены гены, отвечающие

за взаимодействие с фактором B, подобраны праймеры к ним

(генам), то лучше всего проводить исследование типа 1. Если

отсутствует информация о геноме организма А (или ее очень

мало), то проводиться исследование типа 2.

Далее (после ПЦР), например, в случае проведения

исследования второго типа, в зависимости от полученных

фрагментов ДНК, ведется поиск маркеров взаимодействия

между организмом А и фактором B. Например, может оказаться,

что наличие маркера длиной Х усиливает влияние фактора В на

организм А, а наличие маркера длиной Y, наоборот, уменьшает

это влияние.

Теоретически можно рассчитать максимальное количество

ампликонов (A) разной длины, которые будут

амплифицироваться (второй тип исследования). При этом

надо знать длину исследуемой ДНК (D) и длину праймера (L).

Для большинства существующих праймеров минимальный

возможный размер ампликона будет равен 2L. Математически

это можно представить в следующем виде:

D = A(A – 1)/2 + 2LA + M,

где М – остаток ДНК, на которой отжиг праймера не способен

привести к амплификации фрагмента ДНК с длиной A+1;

M < 2L + A.

Вероятность такого события (образования максимального

количества ампликонов разной длины с учетом 4 различных

гетероциклических оснований) может быть описана

математически:

P = 4

-2LA

Из этой формулы следует, что чем больше длина праймера,

тем меньше вероятность амплификации фрагментов разной

длины.

Лекция 6. Подбор праймеров

Концентрация праймеров обычно варьирует в пределах 0,1-1

мкМ. Более высокая концентрация праймеров может приводить

к образованию неспецифических продуктов.

Праймеры подбирают с учетом следующих требований:

а) содержание оснований Г и Ц в праймере должно

находиться в пределах 40-60 %;

б) основания Г и Ц должны быть равномерно распределены

по всей длине праймера;

в) желательно чтобы на 3’-конце праймера находилось

основание Г или Ц, так как это увеличивает эффективность ПЦР;

г) следует избегать наличия 3 и более оснований Г или Ц на

3’-конце праймера, поскольку это может приводить к

ошибочному спариванию праймера с ГЦ-богатыми участками

ДНК;

д) праймеры не должны формировать стабильных дуплексов

сами на себя или друг с другом;

е) участки отжига должны быть уникальными, т.е. праймеры

не должны иметь длинных комплементарных участков вне

специфических мест отжига;

ж) температура плавления (Т

) данной пары праймеров

должна быть сходной и находиться в пределах 55-65

С.

Для ориентировочного подсчета температуры плавления

используют формулу:

= 2(А+Т) + 4(Г+Ц),

где А, Т, Г, Ц, – количество соответствующих нуклеотидов в

праймере. Более точные результаты можно получить при

использовании формулы:

= 81,5 + 16,6(lgM) + 0,41(%Г+Ц)–(600/L),

где М – ионная сила раствора (в молях/л), L – длина

олигонуклеотида. Эта формула пригодна для олигонуклеотидов

длиной 14-70 оснований (Сулимова и др., 2006).

Лекция 7. «Золотая середина» концентраций веществ в ПЦР-

смеси

Taq-полимераза

Является термофильной ДНК-полимеразой (из Thermis

aquaticus).

Точность Taq-полимеразы зависит от концентрации Mg

dNTP, сбалансированности dNTP, pH. В среднем, ошибка чуть

ниже, чем 1 замена на 100-300 п.н.

Количество ДНК-полимеразы должно быть оптимально.

Если используется слишком маленькое количество Taq-

полимеразы, выход продукта снижается, причем это снижение

тем серьезнее, чем больше размер продукта. При 2-4-кратном

избытке Taq-полимеразы в начале реакции появляются высоко-

и низкомолекулярные продукты, а при 4-16-кратном

превышении продукт становится низкомолекулярным.

Необходимо иметь в виду, что Taq-полимераза обладает 5’-3’

экзонуклеазной активностью. Эта активность может вызвать

проблемы, обусловленные деградацией 5’ концов продукта.

Дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP)

Диапазон исследуемых концентраций dNTP – 0,05-0,5 mM.

Чаще всего концентрация dNTP в реакционной смеси составляет

0,2 mM. Увеличение концентрации dNTP выше 0,2 mM

приводит к снижению специфичности и точности ПЦР.

Снижение концентрации dNTP снижает частоту ошибок

фермента, однако приводит к снижению выхода ПЦР-продукта.

Ионы магния (Mg

)

образует комплексы с dNTP (именно эти комплексы

являются субстратом для Taq-полимеразы), праймерами и

матрицей ДНК и поэтому концентрация Mg

влияет на отжиг

праймеров, температуру диссоциации матричной и

амплифицированной ДНК , специфичность продукта, активность

и точность ДНК-полимеразы. Для нормальной работы ДНК-

полимеразы необходимо наличие свободных ионов магния, а не

только тех, которые связаны с ДНК-матрицей, праймерами и

dNTP. Поэтому концентрация Mg

в реакционной смеси должна

быть на 0,5-2,5 mM выше общей концентрации dNTP. При

концентрации dNTP в 0,2 mM концентрация Mg

обычно

варьирует в пределах 1,25-1,75 mM. Слишком низкая

концентрация Mg

- низкий выход ПЦР-продукта, слишком

высокая – продукты неспецифической амплификации.

Матрица для ПЦР

Количество ДНК-полимеразы в реакционной смеси

может меняться в широком интервале: от 0,01 до 1 мкг на 100

мкл реакционной смеси – в зависимости от типа матрицы. Для

геномной ДНК млекопитающих это количество составляет 0,5-1

мкг, для геномной ДНК бактерий – 50 нг. Необходимо иметь в

виду, что при низкой концентрации матрицы необходимо

использовать силиконизированные пробирки для

предотвращения неспецифической абсорбции ДНК на стенках

пробирки.

В определенных условиях можно получить

амплификацию с единичной копии матрицы. При повышении

концентрации ДНК более 1 мкг/100 мкл происходит уменьшение

выхода специфического продукта ПЦР из-за образования

неспецифических продуктов.

Для обеспечения максимального выхода и

специфичности продукта в каждом конкретном случае

использования ПЦР необходимо оптимизировать условия

реакции (подобрать концентрацию праймеров, ионов Mg

дезозоксинуклеотидов, матричной ДНК и полимеразы,

подобрать время инкубации и температуру, состав

инкубационной смеси (Сулимова и др., 2006).

Занятие 1. Выделение ДНК

Для этапа выделения ДНК используется, как правило,

свежий биологический материал, в котором ДНК находится в

целостном состоянии. Все факторы, которые приводят к

разрыву ковалентных связей в исследуемой ДНК и загрязняют

пробы чужеродной ДНК, обусловливают ошибки при

проведении ПЦР и должны быть упразднены. К таковым,

прежде всего, нужно отнести высокую температуру (40–50

C и

выше), электромагнитное излучение (ультрафиолет,

рентгеновские лучи), радиационное излучение (α, β, γ-лучи),

присутствие жизни на исследуемом материале (бактерии,

грибы). Наиболее оптимальным местом хранения ДНК является

морозильная камера. При температуре -5 – -20

С ДНК в клетках

может сохраняться достаточно длительное время, не разрушаясь.

Для хранения материала в течение 1-2 суток используется

холодильник (2-8

C).

Для выделения ДНК лучше всего подходит ткань, где

клетки активно делятся и растут.

Мертвая ткань и ткани опорно-трофической функции, где

ДНК встречается в полуразрушенном состоянии, дают слабый

выход ампликонов (фото 6).

M О

М – маркер молекулярных весов ДНК (длина фрагментов от 100 до 1000 п. н. с

шагом в 100 п. н.)

О – отсутствие продуктов амплификации ДНК

Фото 6. Отрицательная ПЦР-реакция (праймер OPA 14) с ДНК,

выделенной из плавников пеленгаса

Объем материала, необходимый для выделения

достаточного количества ДНК, зависит от размера клеток. Чем

меньше размер клеток, тем меньше необходимо исследуемого

вещества. Если ПЦР состоит из 40 циклов, то теоретически

достаточно и одной клетки для того, чтобы обнаружить

наработанные ДНК-фрагменты. Чем меньше исследуемого

материала (количества клеток), тем аккуратней нужно проводить

исследование, чтобы не загрязнить пробу.

При выделении ДНК используются стандартные наборы

реактивов. Например, комплект «ДНК-сорб-А» фирмы

«АмплиСенс» (Москва, Россия) для выделения ДНК, который

имеет следующий состав:

1. лизирующий раствор;

2. отмывочный раствор;

3. сорбент универсальный;

4. ТЕ-буфер для элюции ДНК.

Хранится набор при температуре 2-25

С. Рассчитан на

выделение ДНК из 100 проб.

Порядок работы.

1. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок.

Промаркировать пробирки.

2. Растереть пробы в ступке с добавлением 100 мкл дистиллята

и перенести пробы по отдельным пробиркам.

3. Лизирующий раствор (если он хранился при 2-8

С) прогреть

при 65

С до полного растворения кристаллов. В пробирки

добавить по 300 мкл лизирующего раствора.

4. Пробы тщательно перемешать на вортексе и прогреть 5 мин

при 65

С. Процентрифугировать 5 с при 5 тыс. об/мин на

центрифуге. Если проба растворилась не полностью,

процентрифугировать пробирку на микроцентрифуге 5 мин при

12 тыс. об/мин и использовать для выделения ДНК

надосадочную жидкость, перенеся ее в новую пробирку.

5. Тщательно ресуспендировать сорбент на вортексе. В каждую

пробирку отдельным наконечником добавить по 20 мкл

ресуспендированного сорбента. Перемешать на вортексе,

поставить в штатив (планшет) на 2 минуты, еще раз перемешать

и оставить в штативе на 5 минут.

6. Осадить сорбент в пробирках центрифугированием при 5 тыс.

об/мин в течение 30 с. Удалить супернатант, используя дозатор с

переменным объемом и меняя наконечник для каждой пробирки.

7. Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки,

перемешать на вортексе до полного ресуспендирования

сорбента, процентрифугировать 30 с при 10 тыс. об/мин на

микроцентрифуге.

8. Удалить супернатант, используя дозатор с переменным

объемом и меняя наконечник для каждой пробирки.

9. Повторить отмывку еще раз, следуя пункту 8., удалить

супернатант полностью.

10. Поместить пробирки в термостат при 65

С на 5-10 мин для

подсушивания сорбента (осадок приобретает цвет мела). При

этом крышки пробирок должны быть открыты.

11. В пробирки добавить по 100 мкл ТЕ-буфера для элюции

ДНК. Перемешать на вортексе. Переместить в термостат при

С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.

12. Процентрифугировать пробирки при 12 тыс. об/мин в

течение 1 мин на микроцентрифуге. Супернатант содержит

очищенную ДНК, пробы готовы к постановке ПЦР.

Очищенную ДНК можно хранить в течение недели при

2-8

С и в течение 1 года при минус 20

С. Эффективность

выделения ДНК составляет 50-70 %.

Задание 1.1.

Выделить ДНК из листьев комнатных растений.

Задание 1.2.

Выделить ДНК из полиэдров вируса ядерного полиэдроза

непарного шелкопряда.