Оберемок В.В. Методические рекомендации к применению ПЦР-метода
Подождите немного. Документ загружается.
Министерство образования и науки Украины
Таврический национальный университет
им. В.И. Вернадского
кафедра экологии и рационального природопользования
В.В. Оберемок
Методические рекомендации
к применению ПЦР-метода
для студентов 5 курса дневной формы обучения
специальности 8. 070402
«биология»
образовательно-квалификационного уровня «магистр»
профессионального направления подготовки
0704 «биология»
и
для студентов 3 курса дневной формы обучения
специальности 6.070300
«биохимия»
образовательно-квалификационного уровня «бакалавр»
профессионального направления подготовки
0703 «химия»
Симферополь 2008
Рекомендовано к печати научно-методическим
советом ТНУ от 02.11.2006
протокол № 2
2
СОДЕРЖАНИЕ
Теоретическая часть (лекции)
Лекция 1. Смысл полимеразной цепной реакции (ПЦР).......4
Лекция 2. Оборудование для ПЦР-метода..............................7
Лекция 3. Организация ПЦР-лаборатории и
правила поведения в ней….......................................................9
Лекция 4. Типичные ошибки при использовании
ПЦР-метода..............................................................................11
Лекция 5. Применение ПЦР-метода для разных видов
научно-исследовательской работы.........................................12
Лекция 6. Подбор праймеров………………………………..15
Лекция 7. «Золотая середина» концентраций веществ в
ПЦР-смеси…………………………………………...…...…..16
Практическая часть (лабораторные занятия)
Занятие 1. Выделение ДНК ....................................................18
Занятие 2. Амплификация ДНК..............................................21
Занятие 3. Детекция продуктов
амплификации ДНК (электрофорез)......................................24
Задачи и вопросы.....................................................................27
Краткий словарь терминов и
дополнительные сведения.......................................................29
Список рекомендуемой и цитируемой литературы………..34
Список рекомендуемых веб-сайтов…………………….…. 34
3
Лекция 1. Смысл полимеразной цепной реакции (ПЦР)
ПЦР – полимеразная цепная реакция, в ходе которой
амплифицируются определенные участки ДНК. ПЦР была
изобретена американским ученым Кэри Мюллисом в 1983 году.
Широкие возможности, сравнительная дешевизна и простота
ПЦР позволили использовать этот метод генетического анализа
в разных областях научных исследований. В основе ПЦР лежит
естественный для клеток процесс репликации (рис. 1).
Отличие ПЦР от репликации состоит в том, что ПЦР происходит
in vitro и воспроизводит репликацию частично.
1- геликаза
2- топоизомераза
3- ДНК-полимераза
4- ДНК-полимераза
5- лигаза
6- фрагмент Оказаки (затравка)
7- нуклеотидтрифосфаты
8- ДНК
Рис. 1. Репликация ДНК
4
Основные компоненты реакции:
dNTP (нуклеотидтрифосфаты), Taq-полимераза, праймеры,
Mg
2+
, ПЦР-буфер, деионизованная вода, исследуемая ДНК.
Полимеразная цепная реакция делится на циклы. Каждый цикл
состоит из нескольких стадий: денатурация, отжиг праймеров,
наращивание (комплементарное достраивание) цепи. Для
каждой стадии характерны своя температура и временной
интервал. Количество ампликонов разной длины, образующихся
в конце ПЦР, теоретически можно рассчитать, если знать места
отжига праймеров. Классическим примером является отжиг
одного праймера по одному разу на каждой из цепей ДНК.
Необходимо, чтобы при этом 3'-концы праймеров были впереди
по отношению друг к другу (рис.1). Два двухцепочечных
фрагмента (ампликона), которые появляются в конце 3 цикла в
этом примере, дадут через n циклов следующее количество
копий: F = 2∙2
n
, где F-количество двухцепочечных фрагментов
ДНК, а n
- количество циклов.
Рис. 2. Амплификация ДНК (окончание на следующей странице)
5
P – праймер, ffffffff – наращиваемая цепь
Рис. 2. Амплификация ДНК
6
Лекция 2. Оборудование для ПЦР-метода
Для проведения ПЦР используется следующее
оборудование и химические вещества.
1. Этап выделения ДНК: ультрацентрифуга, вортекс
(центрифуга), термостат, ступка и пестик, дозатор с переменным
объемом, наконечники для дозатора, пробирки, набор реактивов
для выделения ДНК, исследуемый материал (фото 1).
Фото 1. Оборудование и вещества, используемые
для проведения этапа выделения ДНК
2. Этап амплификации ДНК: программируемый
амплификатор, вортекс, дозатор с переменным объемом,
наконечники для дозатора, пробирки, набор реактивов для
амплификации ДНК, исследуемая ДНК (фото 2).
Фото 2. Оборудование и вещества, используемые
для проведения этапа амплификации ДНК
7
3. Этап детекции продуктов ПЦР: источник электрического
питания, камера для электрофореза, дозатор с переменным
объемом, наконечники для дозатора, агароза, трис-боратный
буфер, раствор бромистого этидия, маркер молекулярных весов
фрагментов ДНК, продукты амплификации ДНК (фото 3).
Фото 3. Оборудование и вещества, используемые
для проведения этапа детекции продуктов амплификации
8
Лекция 3. Организация ПЦР-лаборатории и правила
поведения в ней
Организация ПЦР-лаборатории предусматривает наличие
3-х изолированных друг от друга комнат:
1-ая комната – для выделения ДНК;
2-ая комната – для амплификации ДНК;
3-я комната – для детекции продуктов амплификации ДНК
(электрофореза).
При этом рекомендуют комнату для электрофореза удалить
как можно дальше от первых двух. Комнаты для выделения и
амплификации ДНК должны быть оснащены ПЦР-боксами.
Простейший бокс должен обязательно содержать
ультрафиолетовую лампу, быть прозрачным и удобным для
работы (рис. 3).
1 – ультрафиолетовая лампа
2 – отверстие для рук
3 – стеклянный (пластиковый) прозрачный корпус
Рис. 3. ПЦР-бокс
9
Обычно для создания ПЦР-бокса используется прозрачный
пластик или стекло. Перед тем, как начать работу, нужно
протереть внутреннюю поверхность бокса 70% этиловым
спиртом. После этого включить ультрафиолетовую лампу на 30-
60 минут. Ультрафиолетовые лучи обладают высокой энергией и
опасны для глаз, поэтому необходимо во время стерилизации
бокса ультрафиолетом покинуть помещение. Далее вымыть
руки с мылом, надеть халат и приступить к работе.
В крайних случаях первую и вторую комнаты совмещают,
используя при этом один ПЦР-бокс. Комнаты и оборудование
для ПЦР должны содержаться в чистоте.
В ПЦР-методе используется раствор бромистого этидия.
Это сильный канцероген, способный проникать через кожу. При
работе с бромистым этидием нужно использовать перчатки
(лучше всего из нитрильной резины) и как можно меньше
прикасаться к нему. В случае попадания бромистого этидия на
кожу или в глаза промыть пораженный участок водопроводной
водой в течение 15 минут. В случае попадания бромистого
этидия внутрь организма немедленно обратиться к доктору.
Бромистый этидий используется на стадии детекции продуктов
амплификации.
Все меры предосторожности и нормы поведения в
лаборатории, описанные выше, направлены на то, чтобы
сохранить здоровье исследователя и упредить загрязнение проб
различными веществами.
В ПЦР-лаборатории строго запрещается:
1. отступать от правил поведения, описанных выше;
2. ходить в грязной одежде и обуви;
3. действовать самовольно и наугад.
10