Кирица Е. Направленный синтез каротиноидов у дрожжей и перспектива их использования

Подождите немного. Документ загружается.

На рисунке 5.1 (а) видно, что содержание β-каротина в 1 грамме сухой биомассы

увеличивается при повышении концентрации координационных соединений цинка в

питательной среде. Так, при выращивании пигментных дрожжей в присутствии [Zn(Gly)(DL-

Ser)] максимальной концентрации (10,0 мг/л) наблюдается повышение содержания данного

пигмента на 31,79 % по сравнению с контролем.

Исследования показали, что на синтетической среде MS-1 с соединениями

[Zn(Gly)(DL-Ser)] и [Zn(DL-Ala)(D-Ser)] биосинтез торулина увеличивается от 109 до 117%

по отношению к контролю (рис.5.1 (б)). Наибольшее содержание торулина в 1 г сухой

биомассы на 17,03% больше по сравнению с контрольным образцом, отмечалось при

наличии в питательной среде координационного соединения [Zn(DL-Ala)(D-Ser)]

концентрацией 5,0 мг/л.

Изучение динамики накопления торулародина дрожжами Rhodotorula gracilis CNMN-

YS-03 в присутствии координационных соединений цинка (рис. 5.1 (в)) позволило

констатировать, что синтез ксантофилла находится в тесной связи с концентрацией

используемых веществ. Культивирование пигментных дрожжей на питательной среде в

присутствии [Zn(Gly)(DL-Ser)] в концентрации 10,0 мг/л способствовало максимальному

увеличению содержания торулародина - на 56,95 % больше по отношению к контролю.

Таким образом, в результате проведенных исследований следует отметить, что

увеличение содержания отдельных компонентов каротиноидного комплекса - β-каротина,

торулина и торулародина - в биомассе дрожжей наблюдается при увеличении концентрации

вносимых в питательную среду координационных соединений цинка, в частности

[Zn(Gly)(DL-Ser)].

В дальнейшем была изучена динамика аккумуляции цинка в биомассе дрожжей

Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03. В экспериментах были использованы соединения

[Zn(Gly)(DL-Ser)], ZnSO

47H2O и Zn(CH3COO)24H2O. Результаты проведенных

исследований представлены на рисунке 5.2.

Анализ полученных результатов показал, что динамика аккумуляции цинка зависит от

концентрации веществ, присутствующих в питательной среде. Отметим, что в наибольшей

степени штамм дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 аккумулирует соединения

Zn(CH3COO)24H2O (15,0 мг/л) и [Zn(Gly)(DL-Ser)] (15,0 мг/л). Содержание цинка в

биомассе, при этом составляет соответственно 2,21 и 1,85 мг%.

1- [ Zn(Gly)(DL-Ser)] (5 мг/л) 2- [ Zn(Gly)(DL-Ser)] (10 мг/л) 3-[ Zn(Gly)(DL-Ser)] (15 мг/л)

4- Zn(CH

COO)



O (5мг/л) 5- Zn(CH

COO)



O (10 мг/л) 6 - Zn(CH

COO)



O (15 мг/л)

7 - ZnSO



O (5 мг/л) 8 - ZnSO



O (10 мг/л) 9 - ZnSO



O (15 мг/л)

Рисунок 5.2. Динамика аккумуляции цинка в биомассе дрожжей

Использование данных соединений в составе сред для культивирования дрожжей

представляет большой практический интерес. Таким образом, использование

Zn(CH3COO)24H2O позволит дополнить питательную среду органическим углеродом и

индуцировать синтез каротиноидных пигментов дрожжами, а применение [Zn(Gly)(DL-Ser)]

- аминокислотами глицин и серин, используемых дрожжевыми микроорганизмами в качестве

дополнительных источников азота и способствующих улучшению качества аминокислотного

состава дрожжей (КВАСНИКОВ, 1980; ЕЛИНОВ, 1989).

Исходя из перспективы дальнейшего использования цинксодержащей биомассы в

аквакультуре, было изучено изменение аминокислотного состава дрожжевой биомассы в

зависимости от соединений цинка, присутствующих в питательной среде.

Аминокислотный состав биомассы дрожжей, выращенных на питательной среде с

соединениями [Zn(Gly)(DL-Ser)], ZnSO

47H2O и Zn(CH3COO)24H2O представлен в

таблице 5.2.

Согласно представленным данным, можно констатировать наибольшие количества

таких аминокислот, как треонин (5,7%), лизин (5,9%), аспарагиновая кислота (8,43%), аланин

(6,26%), лейцин (7,58%) и валин (7,95%), а также наибольший процент иммуноактивных

аминокислот (64,25%) характерных для биомассы дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-

03, полученной после культивирования на питательной среде MZ-30 в присутствии

[Zn(Gly)(DL-Ser)] концентрацией 10,0 мг/л.

0,85

1,403

1,85

1,52

1,876

2,21

0,26

0,473

0,75

Соединения

мг%

Таблица 5.2

Аминокислотный состав биомассы дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03, при

культивировании в присутствии соединений цинка (% от суммы)

Аминокислоты Контроль

Zn(CH

COO)

4H

ZnSO

7H

[Zn(Gly)(DL-

Ser)]

Цистеиновая кислота

0,15 0,00 0,8 1,04

Таурин

0,20 0,00 0,0 0,00

Фосфоэтаноламин

0,00 0,00 0,0 0,00

Аспарагиновая кислота**

0,00 1,65 8,1

8,43

Гидроксипролин

0,00 0,00 0,0 0,00

Треонин*/**

3,45 0,75 5,6 5,70

Серин**

3,79 1,33 6,7 5,90

Аспарагин**

0,00 0,00 0,0 0,00

Глутаминовая кислота**

20,40 0,24 14,1 14,13

Глутамин**

0,00 0,00 0,0 0,00

α-аминоадипиновая кислота

0,00 0,00 0,0 0,00

Пролин

3,27 1,33 5,9 5,50

Глицин**

3,88 0,12 5,1 4,82

Аланин**

5,57 0,12 5,7

6,26

Цитруллин

0,00 0,00 0,0 0,00

α-аминомасляная кислота

0,00 0,00 0,0 0,00

Валин*/**

7,56 0,91 7,1

7,95

Цистин**

6,54 1,71 10,2 10,51

Цистатианин

0,00 0,00 0,0 0,00

Метионин*

2,68 0,00 0,0 0,04

Изолейцин*

2,30 0,21 3,1 2,89

Лейцин*

5,35 0,96 7,0 7,58

Тирозин

1,41 0,43 3,4 2,89

Фенилаланин*

2,23 0,43 4,8 3,97

β-аланин

0,00 0,00 0,0 0,00

β-аминомасляная кислота

0,00 0,00 0,0 0,00

γ-аимномасляная кислота

0,33 0,10 0,4 3,97

Орнитин

0,22 0,16 0,2 0,24

Этаноламин

0,20 0,00 0,0 0,00

Лизин*

8,05 0,85 5,5 5,90

1-метилгистидин

0,00 0,00 0,0 0,00

Гистидин*

3,57 3,73 2,4 2,25

3 – метилгистидин

0,00 0,00 0,0 0,00

Триптофан*/**

6,46 3,73 0,6 0,56

Аргинин

5,47 3,73 3,2 0,03

Σ аминокислот

100,00 100,00 100,0 100,00

Σ Заменимых аминокислот

52,87 68,69 41,62 36,6

Σ Незаменимых аминокислот*

47,13 31,31 58,38 63,40

Σ иммуноактивных

аминокислот**

61,01 62,62 63,06

64,25

Культуральная жидкость, которая является вторичным продуктом получения

каротиноидных пигментов, представляет собой широкий комплекс экзометаболитов

дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03, представленных липидами, аминокислотами и

витаминами.

Экзолипиды, включающие в себя фосфолипиды, глицериды, свободные жирные

кислоты, стерины и триглицериды, составляют 1,36 г на 1 л культуральной жидкости.

Содержание аминокислот представлено в таблице 5.3.

Таблица 5.3

Аминокислотный состав культуральной жидкости дрожжей Rhodotorula gracilis

CNMN-YS-03 при культивировании в присутствии соединений цинка

Аминокислоты % от суммы Аминокислоты % от суммы

Цистеиновая кислота 0,68 Изолейцин* 0,51

Таурин 0,12 Лейцин* 1,32

Фосфоэтаноламин 0,00 Тирозин 2,23

Аспарагиновая кислота** 7,38 Фенилаланин* 0,94

Гидроксипролин 0,00 β-аланин 0,00

Треонин*/** 3,89 β-аминомасляная кислота 0,00

Серин** 4,42 γ-аимномасляная кислота 0,02

Аспарагин** 0,00 Орнитин 0,00

Глутаминовая кислота** 37,96 Этаноламин 0,01

Глутамин** 0,00 Лизин* 2,85

α-аминоадипиновая кислота 0,00 1-метилгистидин 0,00

Пролин 10,33 Гистидин* 0,88

Глицин** 7,51 3 – метилгистидин 0,00

Аланин** 4,33 Триптофан*/** 2,41

Цитруллин 0,00 Аргинин* 0,97

α-аминомасляная кислота 0,00 Σ аминокислот 100,00

Валин*/** 2,38 Σ Заменимых аминокислот 18,43

Цистин** 7,40 Σ Незаменимых аминокислот * 70,19

Цистатианин 0,00

Метионин* 1,41

Σ иммуноактивных аминокислот** 73,26

Согласно данным, культуральная жидкость дрожжей характеризуется наличием в

своем составе большого количества иммуноактивных аминокислот - 73,26% от общего

количества, которые представлены, в основном, валином (2,38%), треонином (3,89 %),

лизином (2,85 %), цистином (7,40%), аланином (4,33 %), глицином (7,51 %), триптофаном

(2,41 %) и глутаминовой кислотой (37,96%).

Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать заключение,

что культивирование дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 на питательной среде,

содержащей в своем составе координационное соединение [Zn(Gly)(DL-Ser)], позволяет не

только увеличить продуктивность биомассы (на 57,3%), но и дополнительно обогатить ее

цинком (1,85 мг%) и другими биологически активными веществами.

5.2.Оптимизация среды для культивирования дрожжей Rhodotorula

gracilis CNMN-YS-03 и разработка способа получения цинксодержащей

биомассы

Успехи, достигнутые в последние годы при изучении оптимизации биологических

процессов, зависящих от большого числа факторов, стали возможными благодаря широкому

применению математических методов планирования эксперимента. Оптимизация

биологического процесса сводится к экспериментальному отысканию условий, при которых

выход процесса по интересующей нас характеристике достигает максимального значения

(МАКСИМОВ, 1980). Условия протекания процесса определяются комплексом факторов, от

которого зависит его выход. В случае подбора оптимальных сред, этот комплекс включает в

себя химический состав питательной среды и условия культивирования организмов, таких

как температура, аэрация, свет и др.

В практике часто проводится подбор оптимального химического состава сред при

заданных условиях культивирования или проводится оптимизация по группе факторов

(например, химические компоненты среды). Оптимальной считается среда, на которой при

заданных условиях культивирования достигается максимальный выход процесса, в

частности, биомассы, т.е. оптимальной можно считать среду, химический состав которой

наиболее полно удовлетворяет физиологические потребности культуры (QIU HONG-DUON,

2001).

В результате исследований, представленных в главе 4, была установлена

эффективность использования нетрадиционных источников питания, предшественников,

индукторов и координационных соединений в составе среды MZ -30 для культивирования

дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03, на основании чего перед нами была поставлена

задача оптимизировать состав питательной среды для получения максимального количества

цинксодержащей биомассы пигментных дрожжей.

Для решения поставленной задачи, в соответствии с планом математического

планирования эксперимента в биологии, была составлена матрица полного факторного

эксперимента (табл. 5.4). В качестве факторов, влияющих на продуктивность штамма

Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03, исследовали экстракт томатных выжимок, кукурузное

масло, лимонную кислоту, координационное соединение [Zn(Gly)(DL-Ser)]. В качестве

контроля использовалась питательная среда MZ -30.

Таблица 5.4

Матрица полного факторного эксперимента ПФЭ 2²

Экстракт

томатных

выжимок

Кукурузное масло

Лимонная

кислота

Zn(Gly)(DL-

Ser)

Фактор

Х1 Х2 Х3 Х4

Нижний уровень (-)

0,1 0,5 0,5 5,0

Верхний уровень

(+)

1,0 2,0 3,0 15,0

Единица измерения

л г/л г/л мг/л

Эксперименты 1

- - - -

+ - - -

- + - -

+ + - -

- - + -

+ - + -

- + + -

+ + + +

- - - +

+ - - +

- + - +

+ + - +

- - + +

+ - + +

- + + +

+ + + +

Где:

1–MZ-30 (контроль);

2-MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л);

3-MZ-30+кукурузное масло (1,0 г/л);

4-MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+кукурузное масло (1,0 г/л);

5-MZ-30+лимонная кислота (1,0 г/л);

6-MZ-30+лимонная кислота (1,0 г/л)+экстракт томатных выжимок (0,8 л);

7-MZ-30+кукурузное масло (1,0 г/л)+лимонная кислота (1,0 г/л);

8-MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+кукурузное масло (1,0 г/л)+

лимонная кислота (1,0 г/л);

9-MZ -30 + [Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л г/л);

10 -MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+ [Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л);

11 -MZ-30+кукурузное масло (1,0 г/л)+ [Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л);

12-MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+кукурузное масло (1,0 г/л)+

[Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л);

13 - MZ -30 + лимонная кислота (1,0 г/л)+ [Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л);

14 -MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+лимонная кислота (1,0 г/л)+

[Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л);

15-MZ-30+кукурузное масло (1,0 г/л)+лимонная кислота (1,0 г/л)+

[Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л);

16 -MZ-30 + экстракт томатных выжимок (0,8

л)+ кукурузное масло (1,0 г/л)+

лимонная кислота (1,0 г/л)+ [Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л).

В соответствии с составленной матрицей были проведены эксперименты для

получения оптимального соотношения компонентов питательной среды, которое

обеспечивало бы максимальный выход дрожжевой биомассы. Результаты проведенных

исследований представлены в таблице 5.5.

Согласно представленным результатам, можно констатировать, что использование

компонентов среды в

различных комбинациях оказывает различный стимулирующий эффект

на продуктивность биомассы дрожжей. Так, культивирование штамма на питательной среде

с экстрактом томатных выжимок, кукурузным маслом и координационным соединением

[Zn(Gly)(DL-Ser)] способствует максимальному выходу дрожжевой биомассы - 16,31 г/л с.в.,

что на 136,89 % выше контрольного значения. Количество каротиноидов в биомассе

составляет 483,30 мкг/г с.в.

Стимулирующий эффект объясняется, вероятно, тем, что использование данной

комбинации в составе питательной среды наиболее полно удовлетворяет физиологические

потребности культуры. Экстракт томатных выжимок обеспечивает дрожжевую клетку

дополнительным источником энергии за счет наличия в своем составе не только сахаров, но

и других питательных элементов, кукурузное масло придает текучесть клеточным

мембранном, а жирные кислоты, входящие в его состав, являются активаторами ряда

ферментов, катализирующих жизненно важные процессы, а цинк, в свою очередь,

стабилизирует внутриклеточную структуру.

Таблица 5.5

Влияние состава питательной среды на продуктивность и биосинтез каротиноидов

дрожжами Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03

Биомасса Каротиноиды

№

п/п

Варианты

г/л с.в.

Х1±Х2

% К

мкг/г с.в.

Х1±Х2

% к

MZ -30 (контроль)

6,89±0,23 100,00 439,688±36,79 100,00

MZ -30+экстракт томатных выжимок

(0,8 л)

14,86±1,64 215,83 591,732±37,65 131,58

MZ -30+кукурузное масло (1,0 г/л)

10,85±1,85 157,59 881,442±40,06 200,47

MZ -30+экстракт томатных выжимок

(0,8 л)+кукурузное масло (1,0 г/л)

9,81±0,87 142,54 662,697±35,23 150,72

MZ -30+лимонная кислота (1,0 г/л)

11,8±0,63 171,30 740,347±37,12 168,38

MZ -30+лимонная кислота (1,0

г/л)+экстракт томатных выжимок (0,8 л)

9,69±1,02 140,72 682,659±28,96 155,26

MZ -30+кукурузное масло (1,0 г/л)+

лимонная кислота (1,0 г/л)

7,71±0,26 111,96 788,712±3,24 179,38

MZ -30+экстракт томатных выжимок

(0,8 л)+кукурузное масло (1,0

г/л)+лимонная кислота (1,0 г/л)

10,16±0,43 147,53 376,593±32,74 85,65

MZ -30+[Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л)

7,37±0,35 107,06 516,964±48,61 117,58

MZ -30+экстракт томатных выжимок

(0,8 л)+ [Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л)

10,38±1,07 150,81 564,171±32,55 128,31

MZ -30+кукурузное масло (1,0 г/л)+

[Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л)

6,96±0,12 101,05 535,309±43,24 121,75

MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8

л)+кукурузное масло (1,0 г/л)+

[Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л)

16,31±0,86 236,89 483,300±30,94 109,91

MZ -30+лимонная кислота (1,0 г/л)+

[Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л)

6,56±0,42 95,32 328,556±31,27 74,72

MZ -30+лимонная кислота (1,0

г/л)+экстракт томатных выжимок (0,8

л)+ [Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л)

10,56±0,91 153,38 389,968±25,64 88,69

MZ -30+кукурузное масло (1,0

г/л)+лимонная кислота

(1,0 г/л)+[Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л)

9,51±0,89 123,53 307,658±30,05 69,97

MZ -30+экстракт томатных выжимок

(0,8 л)+кукурузное масло (1,0

г/л)+лимонная кислота (1,0 г/л)+

[Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л)

12,56±1,21 182,37 576,543±21,13 131,13

Изменения качественного состава каротиноидного комплекса при культивировании

дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 на питательных средах, содержащих сочетание

различных факторов, согласно составленной матрицы полного факторного эксперимента,

представлены на рисунке 5.3 (а, б, в). Установлено, что биосинтез β-каротина не изменяется

по сравнению с контролем при выращивании дрожжей в присутствии лимонной кислоты,

кукурузного масла и координационного соединения цинка (вариант среды №15) (рис. 5.2 (а)).

Ингибирующий эффект (33%) на синтез главного пигмента дрожжей, обладающего

провитаминным действием, как показали результаты экспериментов, проявляется при

сочетании в составе питательной среды MZ-30 лимонной кислоты и соединением

[Zn(Gly)(DL-Ser)] (вариант среды № 13) и составил 41,654 мкг/г с.в. Максимальное

содержание β-каротина в клеточной массе дрожжей (323,577 мкг/г с.в., что на 159,51 %

больше контроля) наблюдалось при культивировании дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-

YS-03 на среде, в состав которой включены экстракт томатных выжимок и лимонная кислота

(вариант среды № 6).

Следует отметить, что содержание торулина в дрожжевой биомассе варьирует в

зависимости от состава питательной среды (рис.5.3 (б)). Таким образом, положительное

действие на процесс биосинтеза пигмента оказывает присутствие в среде культивирования

кукурузного масла, и составило 289,097 мкг/г с.в., что на 88,67% больше контроля (вариант

среды № 3). Сильный ингибирующий эффект, согласно представленным результатам,

оказывает сочетание экстракт томатных выжимок + лимонная кислота + координационное

соединение [Zn(Gly)(DL-Ser)] (вариант среды №14).

Содержание торулародина в клеточной массе дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-

YS-03, как показали результаты проведенных экспериментов, в большинстве случаев

ингибируется (рис. 5.3 (в)). Однако, стимулирующее действие на биосинтез пигмента

отмечается при включение в состав среды культивирования дрожжей кукурузного масла

(289,26 мкг/г с.в., что на 78,81 % больше контроля), лимонной кислоты (267,98 мкг/г с.в., что

на 65,65 % больше контроля) и сочетания факторов кукурузное масло и лимонная кислота -

313,25 мкг/г с.в., что на 93,64 % больше контроля (вариант среды №7).

а)

б)

в)

1–MZ-30 (контроль)

2-MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)

3-MZ-30+кукурузное масло (1,0 г/л)

4-MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+кукурузное масло (1,0 г/л)

5-MZ-30+лимонная кислота (1,0 г/л)

6-MZ-30+лимонная кислота (1,0 г/л)+экстракт томатных выжимок (0,8 л)

7-MZ-30+кукурузное масло (1,0 г/л)+лимонная кислота (1,0 г/л)

8-MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+кукурузное масло (1,0 г/л)+лимонная кислота

(1,0 г/л)

9-MZ -30 + [Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л)

10 -MZ-30+экстракт томатных выжимок (80г/л)+ [Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л)

11 -MZ-30+кукурузное масло (1,0 г/л)+ [Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л)

12-MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+кукурузное масло (1,0 г/л)+ [Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л)

13 - MZ -30 + лимонная кислота (1,0 г/л)+ [Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л)

14-MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+лимонная кислота (1,0 г/л)+ [Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л)

15-MZ-30+кукурузное масло (1,0 г/л

)+лимонная кислота (1,0 г/л)+[Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л)

16 -MZ -30 + экстракт томатных выжимок (0,8 л)+ кукурузное масло (1,0 г/л)+лимонная кислота (1,0 г/л)+ [Zn(Gly)(DL-Ser)] (10,0 мг/л)

Рисунок 5.3. Влияние состава питательной среды на биосинтез β-каротина (а), торулина

(б) и торулародина (в) дрожжами Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03

β-каротин

100

143,57

215,34

223,44

231,25

259,51

196,18

170,96

105,67

164,85

114,93

138,35

33,41

115,00

98,70

148,44

торулин

100

134,72

188,67

130,06

159,08

129,25

167,25

56,24

161,90

154,19

163,30

89,80

135,63

18,76

61,76

167,30

торуларод ин

100

112,75

178,81

94,67

165,66

64,42

193,64

50,01

84,76

75,63

87,64

107,06

48,88

134,65

55,61

83,52