Кирица Е. Направленный синтез каротиноидов у дрожжей и перспектива их использования

АКАДЕМИЯ НАУК МОЛДОВЫ

ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

УДК 579.695+579.66’112.3+663.14

КИРИЦА ЕЛЕНА

НАПРАВЛЕННЫЙ СИНТЕЗ КАРОТИНОИДОВ У

ДРОЖЖЕЙ И ПЕРСПЕКТИВА ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

03.00.23 - БИОТЕХНОЛОГИЯ

Диссертация на соискание

ученой степени доктора биологии

Научный руководитель:

Усатый А. С.,

Доктор хабилитат биологии,

конф. исследователь

Автор:

Кирица Елена

Кишинев

2005

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ …………………………………………………………………………….….4

1. КАРОТИНОИДНЫЕ ПИГМЕНТЫ – БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ

И ПЕРСПЕКТИВА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ…………………………...…8

1.1. Микроорганизмы – потенциальные источники каротиноидных пигментов….….…..8

1.2. Химическое строение и биосинтез каротиноидных пигментов …………………..…11

1.3. Биологические функции и область применения каротиноидов…………………..….18

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ……………….……………….……….……..25

2.1. Предмет исследований ……………………………………………………………....…25

2.2. Питательные среды для культивирования каротинсинтезирующих дрожжей.…..…25

2.3. Биостимуляторы, индукторы и координационные соединения металлов ……..……26

2.4. Аппаратура и оборудование……………………………………………………….….…26

2.5. Реактивы……………………………………………………………………………..……26

2.6. Методы исследований……………………………………………………..………..….…27

ГЛАВА 3. СКРИНИНГ ДРОЖЖЕЙ, ОБЛАДАЮЩИХ ПОВЫШЕННОЙ

СПОСОБНОСТЬЮ К БИОСИНТЕЗУ КАРОТИНОИДНЫХ

ПИГМЕНТОВ .…………………………………………………………….…30

3.1. Продуктивность и содержание общего количества каротиноидов в биомассе

дрожжей рода Rhodotorula………………………………………………….…..…....….31

3.2. Качественный состав каротиноидных пигментов дрожжей

рода Rhodotorula………………………………………………………………..……..….34

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ НЕТРАДИЦИОННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ПИТАНИЯ, ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ, ИНДУКТОРОВ И

МЕТАЛЛОКОМПЛЕКСОВ НА ПРОДУКТИВНОСТЬ И

БИОСИНТЕЗ КАРОТИНОИДОВ У ДРОЖЖЕЙ ………………….….….40

4.1. Влияние нетрадиционных источников питания на продуктивность

и биосинтез каротиноидов дрожжами Rhodotorula gracilis CNMN – YS-03….……..42

4.2. Влияние предшественников на продуктивность и биосинтез каротиноидов

дрожжами Rhodotorula gracilis CNMN – YS-03………………………………………..46

4.3. Влияние индукторов на продуктивность и биосинтез каротиноидов

дрожжами Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03…………………………………...….…51

4.4. Влияние координационных соединений Fe (II) на биосинтез каротиноидов

дрожжами рода Rhodotorula……………………………………………………….…….57

4.5. Способы направленного синтеза каротиноидов у дрожжей………………….…...…..64

ГЛАВА 5. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДРОЖЖЕВОЙ БИОМАССЫ С

ПОВЫШЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ЦИНКА………………………………....77

5.1. Продуктивность и биосинтез каротиноидных пигментов дрожжами,

культивируемыми в присутствии различных соединений цинка………………….…78

5.2.Оптимизация среды и разработка способа получения цинксодержащей биомассы..85

ГЛАВА 6. БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА

ОСНОВЕ КАРОТИНСИНТЕЗИРУЮЩИХ ДРОЖЕЙ РОДА RHODOTORULA….93

6.1. Технология получения препарата из пигментных дрожжей для

стимулирования жизнеспособности икры и личинок рыб……………...………..….…93

6.2. Технология получения

цинксодержащей биомассы пигментных

дрожжей, предназначенной для стартовых кормов личинок рыб………………..…101

ЗАКЛЮЧЕНИЕ …………………………………………………………………….….…..106

ВЫВОДЫ…………………………………………………………………………….….…..110

БИБЛИОГРАФИЯ……………………………………………………………………....…112

РЕЗЮМЕ……………………………………………………………………………….……127

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Поиск биологически активных соединений, синтезируемых микроорганизмами в

настоящее время остается весьма актуальной задачей современной биотехнологии. Это

обусловлено возможностью получения путем микробного синтеза различных продуктов,

богатых витаминами, липидами, белками, микроэлементами и другими биологически

активными веществами (ФЕОФИЛОВА, 1994; CANIZARES-VILLANUEVA, 1998;

ЛЕЩИНСКАЯ, 2000).

Из продуктов микробного синтеза особый интерес представляют – каротиноиды,

являющиеся наиболее многочисленной и распространенной группой природных

пигментов (BRAMLEY et. al., 1992; YOUNG et. al., 2001). С каждым годом потребность в

каротиноидах возрастает, что требует расширения потенциальных источников их

получения. В настоящее время каротиноиды можно получить путем химического синтеза,

микробиологическим способом или выделением из растительного сырья (SANDU, GOSHI,

1997; RUDIC, BULIMAGA, 2003).

В связи с тем, что дрожжи способны синтезировать широкий спектр каротиноидов,

а также обладают способностью в процессе ферментации накапливать достаточное

количество биомассы и расти на относительно дешевых средах, эта группа эукариотных

микроорганизмов может занять прочные позиции в современной биотехнологии, в том

числе и в области микробиологического синтеза каротиноидов (BEN-AMOTZ, 1999;

SANDMAN, 2001). Это, в свою очередь, способствует более интенсивному изучению

направленного синтеза каротиноидных пигментов.

Каротиноидные пигменты, находящиеся в

микробной клетке, обладают высокой

биологической активностью. Около 10% каротиноидов (альфа-, бета-, гамма- и

дельтакаротин) являются предшественниками витамина А (ретинола). Помимо

провитаминного действия, каротиноиды нашли применение для профилактики и лечения

многих заболеваний: каротин обладает радиопротекторными свойствами, усиливает

лечебное действие некоторых противоопухолевых препаратов (ХИГГИНС, 1988;

BABIEVA, 1991; БУКИН, 1997; BLACK, 1998). Во многих странах каротиноидные

пигменты используются в качестве

пищевой добавки к хлебу, маслу, к маргарину и

многим другим пищевым продуктам (www.uralbiopharm.ru). Используются каротиноиды

и для изготовления косметических средств, а также в качестве добавки в корм для рыб.

(CADAR, 1990; YAMADA et. al., 1990; www.uniagro.ru; www.vitamarket.ru;).

Развитие современных биотехнологий по получению новых форм каротиноидных

препаратов высокого качества и их применение в качестве физиологически активных

веществ могут способствовать решению многих задач по повышению продуктивности

сельскохозяйственных животных, птиц, рыбного хозяйства в Молдове. Их адекватность

уже была доказана в различных странах, таких как Румыния, Россия, Украина, Япония

(www. Vitamarket.com.ua. www.uralbiopharm.ru; ФЕОФИЛОВА, 2001).

Очевидна целесообразность поиска высокопродуктивных штаммов, разработки

высокопродуктивной биотехнологии по культивированию пигментных дрожжей,

оптимизации питательных сред и способов получения каротиноидов, а также расширение

списка экологически чистых препаратов для нужд республики.

Цель исследований: изучить особенности каротиногенеза у дрожжей под

влиянием различных факторов, разработать способы направленного синтеза каротиноидов

и биотехнологии получения новых препаратов на базе дрожжевых каротиноидов.

Задачи:

 Изучить комплекс каротиноидных пигментов у дрожжей и отобрать штаммы,

обладающие повышенной способностью к каротинообразованию.

 Исследовать особенности процесса биосинтеза каротиноидов дрожжами под

влиянием нетрадиционных источников питания, предшественников,

индукторов и координационных соединений некоторых переходных металлов.

 Разработать способы направленного синтеза каротиноидов у дрожжей.

 Разработать способ получения биомассы дрожжей с прогнозируемым

содержанием цинка.

 Разработать биотехнологии получения новых препаратов на базе

каротинсинтезирующих дрожжей рода Rhodotorula.

Научная новизна

Получены новые данные о качественном и количественном составе каротиноидов

дрожжей рода Rhodotorula. Отобраны штаммы, представляющие интерес как

потенциальные источники каротиноидов.

Выявлены особенности синтеза каротиноидных пигментов дрожжами рода

Rhodotorula, культивируемых на питательных средах с нетрадиционными источниками

питания: экстрактом виноградного, яблочного и томатного шротов, предшественниками

(подсолнечное, оливковое, кукурузное, соевое масла и ретинол), индукторами (ацетат

натрия, ацетат цинка и лимонная кислота) и координационными соединениями некоторых

переходных металлов ([Fe

2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] и [Fe

Mn(CCl

COO)

(CH

OH)

]).

Впервые установлена эффективность использования координационных соединений

Fe (II), в качестве биорегуляторов процесса каротиногенеза (Brevet de invenţie MD 2282).

Используя методы математического планирования экспериментов, разработаны и

оптимизированы составы питательных сред для культивирования дрожжей, в

соответствии с конечной целью - увеличение общего содержания каротиноидов или

получение его отдельных компонентов. Разработан способ получения биомассы с

прогнозируемым содержанием цинка.

На базе пигментных дрожжей разработаны технологии получения новых препаратов

для стимуляции жизнестойкости икры рыб и для использования в составе стартового

корма для личинок рыб (Brevet de invenţie MD 2593, 2004.11.30; Hotărâre pozitivă nr. 4587

din 19.10.2005).

Теоретическая и практическая значимость работы

Проведенные исследования открывают новые пути применения результатов в

решении проблемы, связанной с регуляцией биосинтетических процессов при

культивировании пигментных дрожжей рода Rhodotorula и повышения количественного

содержания каротиноидных пигментов.

На основе экспериментальных результатов предлагаются варианты питательных

сред, способствующих эффективному биосинтезу каротиноидов. Предлагается

использование [Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] в качестве биостимулятора процесса

каротинообразования у дрожжей. Предлагается новый способ получения биомассы

дрожжей с прогнозируемым содержанием цинка.

Технологии получения биопрепаратов на основе дрожжей рода Rhodotorula

открывают новые перспективы их использования в аквакультуре, в особенности для

стимуляции икры и использования в составе стартового корма для личинок рыб.

Апробация результатов

Основные результаты были сообщены на различных встречах, конференциях и

симпозиумах.

The Second International Conference on ecological Chemistry (October, 11-1,2002,

Chişinău, Republic of Moldova); 5

International Symposium on “Metal Elements in

Environment, Medicine and Biology”, Timişoara, România, November 4-6, 2002;

Simpozionul al II-lea Naţional cu participare internaţională «Inginerie genetică şi botehnologii

moderne», 24-25 octombrie 2002, Chişinău; Salonul internaţional «Ecoinvent - 2003»

“Tehnologii, Instalaţii şi Aparate utilizate în protecţia mediului”, 19-22 iunie 2003, Iaşi,

România, Catalog (medalia de bronz); Expoziţia Naţională Specializată “Infoinvent 2003”,

octombrie, Chişinău 2003, (medalia de bronz); Conferinţa ştiinţifică “Bazele conceptuale ale

dezvoltării durabile a Republicii Moldova”, Sesiunea Ştiinţifică “Tehnologii moderne în

agricultură şi protecţia mediului înconjurator”, 25-27 noiembrie 2003, Chişinău, 2003; 53

World exhibition of innovation, research and new technology “BRUSSELS EUREKA 2004”,

16/11/2004-21/11/2004.

Публикации

На основе полученных результатов были опубликованы 24 (4 за личным

авторством) работы, в том числе 3 патента.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из: введения; обзора литературы; методов исследования;

результатов исследований и их описания представленных в четырех главах; выводах.

Библиографические источники включают 187 источника; резюме на румынском, русском

и английском языках. Диссертация представлена на 129 страницах. Иллюстрационный

материал включает 21 таблицу, 27 рисунков.

Ключевые слова: дрожжи, биомасса, каротиноиды, β-каротин, торулин,

торулародин, питательные среды, координационные соединения, экстракты

растительных шротов, индукторы, предшественники.

ГЛАВА 1

КАРОТИНОИДНЫЕ ПИГМЕНТЫ: БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ И

ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

1.1. Микроорганизмы – потенциальные источники каротиноидных

пигментов

Впервые выделенные еще в начале XIX века из желтой репы и моркови,

каротиноиды, как оказалось, присутствуют в клетках и тканях у представителей всех пяти

царств живой природы от низших бактерий до позвоночных животных. Распространение

и разнообразие каротиноидов в природе обуславливается как способностью организмов к

их биосинтезу, так и способностью их абсорбировать и метаболизировать. Каротиноидные

композиции у различных групп и видов живых организмов не только отличаются по

количественному содержанию, но и различны по качественному составу (BARNET et.al.,

1983; BABIEVA, 1991; ЕРШОВ, 1992).

Следует отметить, что в природе каротиноиды могут находиться в различных

состояниях: в свободном виде они чаще встречаются в пластидах растений, мышечной

ткани рыб, яйцах птиц, в хроматофорах и эпидермальных структурах растений, в форме

каротин-протеинов - в эпидермальных тканях животных и т. д. (GOODWIN,1980;

ФЕОФИЛОВА, 1994; SHANDU, 1997).

Интенсивные методы хозяйствования, получение продуктов длительного хранения, их

глубокая переработка приводят к истощению содержания в них витаминов и

провитаминов, в частности, каротиноидов. Это, вместе с воздействием неблагоприятных

экологических факторов и катастроф, вызывает

их недостаток в организме и, как

следствие, рост заболеваний (RAU, 1988; YOUNG, 2001). Учитывая неоценимую роль

каротиноидов для протекания нормальных физиологических процессов, актуальной

задачей современной биотехнологии является создание новых форм каротиноидных

препаратов высокого качества и их применение в качестве физиологически активных

веществ (RUDIC ş. a., 2001; SANDMAN, 2001).

Среди микроорганизмов, способностью синтезировать каротиноиды, жёлтые,

оранжевые или красные пигменты

(циклические или ациклические изопреноиды)

обладают бактерии, грибы, водоросли и дрожжи (YOKOYAMA, 1985; CERDO-OLDO,

1989; CANIZARES-VILLANUEVA, 1998).

Каротиноиды, найденные у представителей многих классов и семейств

нефотосинтезирующих бактерий, обычно локализованы в клеточных мембранах и в

клеточной стенке. Многие виды растений, бактерий и дрожжей накапливают простые С

– каротиноиды, такие, как β- каротин, γ-каротин и их производные (CALO-PILVAR, 1995;

ПРИЩЕП, 2000; ЛАДЫГИН, 2001)

Так, характерным каротиноидом галофильных Halobacteria является ациклический

С50 – пигмент бактериорубин. Каротиноиды синтезируют все виды фотосинтезирующих

бактерий, у которых они являются важными компонентами фотосинтетического аппарата.

Среди бактерий, образующих широкий круг каротиноидов, особый интерес представляет

штамм Agrobacterium auranticum, который является продуцентом таких пигментов как

астаксантин, β-каротин, эхиненон, бета-криптоксантин, 3-оксиэхиненон, кантаксантин, 3’-

оксиэхиненон, зеаксантин, адонирубин, адониксантин (YOKOYAMA, 1995). Выделен и

очищен также основной каротиноидный пигмент экстремально радиоустойчивой бактерии

Deinococcus radiodurans (SAITO et. al., 1998). Исследователи предполагают, что этот

каротиноид может обладать высокой антиоксидантной активностью, так как содержит 2

гидроксильные группы, одну карбонильную группу и длинную цепь сопряженных

двойных связей. Пигмент локализован на поверхности клеток и, возможно, действует в

качестве антиоксиданта липидов, белков и полисахаридов на поверхности клетки,

защищая от окислительного стресса, вызываемого ионизирующим и УФ-излучением и,

таким образом, участвуя в повышении радиоустойчивости бактерии (www. stat. bachedu.

ru). Широко известны бактерии рода Micrococcus, содержащие, в основном,

каротиноидные пигменты торулин и торулародин и светочувствительные пигменты

бактериородопсин и меланины (CHATOPODHAY, 1997; emalta1@elstation.agava.ru).

Спектр каротиноидных пигментов, синтезируемых оранжево-красными группами

актиномицетов весьма разнообразен. Способность синтезировать пигменты установлена у

таких видов, как Actinomyces galbus Frommer, Streptomyces chrestomyceticus var.

Ayrantioides. В настоящее время у актиномицетов идентифицированы такие пигменты,

как β- и γ- каротин, ликопин, тетрагидроликопин и проликопин. Количество пигментов,

синтезируемых актиномицетами составляет в среднем 235,6 мкг/г а.с.в. (GLOZEBROOK,

1992

; CANIZARES-VILLANUEVA, 1998).

Очень важным источником получения каротиноидных пигментов могут служить

сине-зеленые водоросли Spirulina platensis (Nordts) CALU – 835, Dunaliella salina Teod.

CALU -834, Spirulina platensis CNM-CB-03, Haematococcus pluvialis, которые являются

натуральными источниками каротиноидов, обладающие способностью к синтезу до 0,44 –

6,9 % β-каротина (РУДИК, 1995; RUDIC şi coaut.,2000; RUDIC şi coaut., 2001, RUDIC şi

coaut., 2003). Большая часть каротиноидов, продуцируемых водорослями приходится на

такие пигменты как β-каротин и астаксантин (FABREGAS et.al., 1988; РУДИК, 1990;

RUDIC şi coaut, 1999; 2001; 2003).

Особое место среди продуцентов каротиноидов отводится грибам (ДЕЕВ и др.,

2004). Наиболее перспективными среди них являются представители порядка Mucorales:

Blakeslea trispora, Phycomyces blakesleeanus, Choanephora cucurbitаrum, являющиеся

продуцентами β-каротина и ликопина. Среди грибов в этом отношении представляют

интерес Aspergillus giganteus, некоторые виды Penicillium, Fusarium sporotrichoides,

способный продуцировать до 0,5мг ликопина на грамм сухой биомассы (ГЕССЛЕР и др.,

2002; http://www.biotechknowledge.com). Однако, наиболее высокой каротинообразующей

способностью обладает мукоровый гриб Blakeslea trispora, синтезирующий ликопин до

360 мг/л и β-каротин около 30 мг/100мл культуральной жидкости (ФЕОФИЛОВА, 1994;

MEHTA et. al., 1995; АВЧИЕВА, 1998; ФЕОФИЛОВА, 2004). Известны данные о том, что

исследователи из американской исследовательской службы сельского хозяйства (US

Agricultural Research Service, ARS) создали новые штаммы гриба Fusarium sporotrichoides,

способные синтезировать ликопин и ряд других каротиноидов растительного

происхождения. Специалисты считают, что у массового производства этого пигмента

имеются широчайшие перспективы, особенно если использовать в качестве субстратов

для развития гриба разнообразные побочные продукты растительного происхождения.

Предварительные испытания показали, что грибы способны продуцировать до 0,5 мг

ликопина на 1,0 г сухой биомассы в течение 6 дней при лабораторном культивировании

(АВЧИЕВА, 2001). Один из наиболее доступных продуктов для выращивания грибов -

отходы этанольного производства, состоящие, в основном, из волокнистой части стеблей

зерновых культур (BRAMLEY et. al., 1992;; http://www.biotechknowledge.com).

Другой распространенной группой микроорганизмов, способных к синтезу

каротиноидов, являются красные дрожжи. Некоторые представители дрожжей

(Sporobolomyces, Phaffia, Rhodosposporidium, Cryptococcus, Sporidiobolus, Sterigmatomyces)

способны синтезировать широкий спектр каротиноидов, количество которых может быть

более 10 (ликопин,- α-, β- и γ- каротин, неуроспорен, фитоен, фитофлуен, лютеин,

ликофил, ликоксантин, рубиксантин, криптоксантин, зеаксантин, виолаксантин,

родоксантин, астаксантин, флавоксантин) (SCHRAEDER, 1995). Наиболее часто среди них

выделяются такие пигменты, как β-, γ- каротины, торулин, торулародин и ликопин

(TAMAŞ şi coaut., 1986; КВАСНИКОВ, 1980; Патент RU 2103351, 27.01.98; ЗАЙЧЕНКО

и др., 2000). Среди пигментных дрожжей, как источников каротиноидных пигментов,

следует отметить штамм Rhodotorula glutinis ВКПМ V-2210, который на питательной

среде, включающей источники углерода, азота и минеральные соли, в глубинных

условиях образует биомассу, содержащую 1450-1500 мкг/г каротиноидов (Патент RU

2103351, 27.01.98; www.SIBPATENT.ru). Дрожжи Phaffia rhodozyma обладают двумя

Кирица Е. Направленный синтез каротиноидов у дрожжей и перспектива их использования

Подождите немного. Документ загружается.