Кирица Е. Направленный синтез каротиноидов у дрожжей и перспектива их использования

Подождите немного. Документ загружается.

На основании результатов, полученных при проведении экспериментов, согласно

матрице полного факторного эксперимента производился расчет коэффициентов регрессии

по схеме Иейтс для получения более полной информации обо всех существующих в системе

взаимодействиях исследуемых факторов, действующих на продуктивность биомассы

дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 (табл. 5.6).

Таблица 5.6

Определение коэффициентов регрессии по схеме Иейтса

№ п/п

Результаты

эксперимента

1 шаг 2 шаг 3 шаг 4 шаг К регрессии Ряд

1 6,89 21,75 42,41 81,77 164,98 10,31 1

2 14,86 20,66 39,36 83,21 29,68 1,86 Х1

3 10,85 21,49 41,02 7,27 8,76 0,55 Х2

4 9,81 17,87 42,19 22,41 3,94 0,25 Х1Х2

5 11,80 17,75 6,93 -4,71 -1,88 -0,12 Х3

6 9,69 23,27 0,34 13,47 -8,90 -0,56 Х1Х3

7 7,71 17,12 12,36 -4,45 -0,10 -0,01 Х2Х3

8 10,16 25,07 10,05 8,39 9,28 0,58 Х1Х2Х3

9 7,37 7,97 -1,09 -3,05 1,44 0,09 Х4

10 10,38 -1,04 -3,62 1,17 15,14 0,95 Х1Х4

11 6,96 -2,11 5,52 -6,59 18,18 1,14 Х2Х4

12 16,31 2,45 7,95 -2,31 12,84 0,80 Х1Х2Х4

13 6,56 3,01 -9,01 -2,53 4,22 0,26 Х3Х4

14 10,56 9,35 4,56 2,43 4,28 0,27 Х1Х3Х4

15 9,51 4,00 6,34 13,57 4,96 0,31 Х2Х3Х4

16 15,56 6,05 2,05 -4,29 -17,86 -1,12 Х1Х2Х3Х4

Математический анализ результатов полного факторного эксперимента показывает

зависимость продуктивности биомассы дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 от

факторов питательной среды в виде уравнения регрессии:

У=10,31+1,86X1+0,55X2+0,25X1X2-0,12X3-0,56X1X3-

0,01X2X3+0,58X1X2X3+0,09X4+0,95X1X4+1,14X2X4+0,80X1X2X4+0,26X3X4+0,27X1X3X4

+0,X2X3X4-1,12Х1X2X3X4

Составленное уравнение регрессии является прямой зависимостью продуктивности

клеточной массы дрожжей от комбинации компонентов, используемых в питательной среде.

Исходя из полученного уравнения регрессии, можем предположить, что использование в

питательной среде MZ-30 только экстракта томатных выжимок различных концентраций

(вариант № 2) позволит наилучшим образом увеличить продуктивность дрожжевой

биомассы. Примерно одинаковой степенью эффективности на данный показатель, согласно

составленному уравнению регрессии, будут проявлять сочетания таких факторов, как

экстракт томатных выжимок + координационное соединение цинка (Х1Х4) и экстракт

томатных выжимок + кукурузное масло + координационное соединение цинка (Х1Х2Х4).

Ингибирующий или слабо стимулирующий эффект на продуктивность биомассы будет

проявляться при культивировании каротинсинтезирующих дрожжей на питательной среде

MZ-30, в состав которой будут включены экстракт томатных выжимок и лимонная кислота

(Х1Х3).

Таким образом, результаты проведенных исследований позволили сделать

заключение, что использование методов математического планирования эксперимента в

биотехнологии культивирования пигментных дрожжей дают возможность не только

оптимизировать состав питательной среды для получения максимального количества

цинксодержащей биомассы, но и предположить эффективность взаимодействия различных

факторов на продуктивность клеточной массы дрожжей.

На основании проведенных экспериментов по изучению влияния нетрадиционных

источников питания, специфических индукторов, предшественников и координационных

соединений цинка на продуктивность дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 разработан

способ получения цинксодержащей биомассы, который включает в себя следующие этапы:

а) В питательную среду MZ-30 вносится 0,8 л экстракта томатных выжимок, 1,0 г/л

кукурузного

масла и 10,0 мг/л [Zn(Gly)(DL-Ser)]. Добавляется инокулят дрожжей в

количестве 5% от объема питательной среды.

б) Культивирование проводится при следующих параметрах: температура + 25-27° С,

на качалке (180-200 об/мин), рН среды 5,6 -6,0, освещение 12-12 тысяч ерг/см².

с) На пятый день культивирования биомасса отделяется от культуральной жидкости

путем центрифугирования при 3000 об/мин, на холоде добавляется антиоксидант (α-

токоферол в количестве 0,5%). В биомассе определяется содержание цинка. Полученная

сухая биомасса может быть использована для приготовления стартового корма для личинок

рыб. Культуральная жидкость может быть использована для получения биопрепарата для

стимулирования жизнеспособности икры рыб.

ГЛАВА 6

БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА

ОСНОВЕ КАРОТИНСИНТЕЗИРУЮЩИХ ДРОЖЖЕЙ РОДА

RHODOTORULA

6.1. Технология получения препарата из пигментных дрожжей для

стимулирования жизнеспособности икры и личинок рыб

Известен способ повышения жизнестойкости рыб как на ранних этапах развития,

так и на более поздних, путем использования продукта «БИОЭКС», полученного из

ботвы томатов, огурцов и других растительных остатков (Патент RU 2028046, 1995).

Предлагается также способ повышения жизнестойкости икры, включающий обработку

икры водной смесью микроэлементов: меди, цинка и марганца в дозах 50..75 мкг/л

(Brevet de invenţie MD 1116, 1998). Однако данные способы не позволяют получать

достаточно высокий процент жизнестойкости личинок и мальков рыб.

Цель наших исследований состоит в разработке технологии получения

эффективного препарата для стимуляции развития икры и личинок рыб путем

использования каротинсинтезирующих дрожжей рода Rhodotorula.

6.1.1. Характеристика биопрепарата

Биопрепарат представляет собой жидкую смесь, содержащую незаменимые

иммуноактивные аминокислоты, липиды, витамины, ликопин, аскорбиновую кислоту.

Состав препарата:

Препарат содержит культуральную жидкость дрожжей рода Rhodotorula,

состоящую из 160-180мг% аминокислот, в т.ч. иммунноактивные – 70-78 %

(аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, глицин, аланин, валин, цистеин,

триптофан) и незаменимые аминокислоты -67-71% (табл. 6.1); липиды – 80-90 мг%;

ликопин – 0,4-0,5 мг%; аскорбиновая кислота – 1,2-1,3 мг%.

Препарат жидкий, цвет – желто-коричневый. Расфасовывается по 50 или 100 мл и

стерилизуется текучим паром 3 дня при ¾ атмосферы 20 минут.

Биопрепарат хранится при температурах +4..+10°С., в течение 6 месяцев.

Таблица 6.1

Содержание иммуноактивных аминокислот культуральной жидкости дрожжей

рода Rhodotorula при культивировании в присутствии соединений цинка

Иммунноактивные аминокислоты

% от суммы

Глутаминовая кислота

37,96

Аспарагиновая кислота

7,38

Аланин

4,33

Цистин

7,40

Глицин

7,51

Серин

4,42

Треонин

3,89

Триптофан

2,41

Валин

2,38

6.1.2. Характеристика используемого продуцента.

➣ Положение изучаемого штамма в генеалогическом древе:

Род Rhodotorula относится к семейству Cryptococcaceae. Данное семейство

является гетерогенным и включает в себя 15 родов. Дрожжи, принадлежащие

Cryptococcaceae, размножаются почкованием, могут формировать псевдомицелий либо

истинный мицелий, а также ауксоспоры. Клетки окрашены в розовый, оранжевый или

желтый цвет, благодаря синтезу каротиноидных пигментов (рис.6.1 и 6.2).

Утилизируют источники углерода только окислением или путем окисления и

ферментацией. Положение изучаемой культуры Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 в

генеалогическом древе (KREGER-VAN RIJ,1987):

Вид - Rhodotorula gracilis,

Род - Rhodotorula,

Семейство - Cryptococcaceae,

Класс - Blastomycetes,

Подъотдел - Deuteromycota

Отдел - Eymycota

¾ Морфофизиологические характеристики:

Клетки круглые, овальные или удлиненные, редко капсулированные, форма

репродукции – через почкование. В жидких средах растут, образуя осадок, розово –

оранжевого цвета, что обусловлено наличием каротиноидных пигментов (рис. 6.1). На

твердых средах: тип колоний – R-форма или S- форма, края ровные или зубчатые, цвет

розово-оранжевый, консистенция плотная (рис. 6.2).

Рисунок 6.1. Штамм дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03,

культивированный на жидкой питательной среде

Рисунок 6.2. Штамм дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03,

культивированный на твердой питательной среде

➣ Физиолого-биохимические характеристики:

Ферментация отсутствует, инозитол - ; нитрит +/-; уреаза +; аммиак -; тест с

диазонием синим B(DBB)+; ассимилирует глюкозу, сахарозу, ксилозу, мальтозу,

маннит, галактозу, арабинозу.

Штамм хорошо растет на жидких средах: пивном сусле, МZ-30, Лундина.

Культура дрожжей растет на жидких средах с рН -3,5-8,0 при температуре +22-33°С,

оптимальная температура культивирования +25-27°С, рН опт. 5,5-6,5.

➣ Продукты, синтезируемые штаммом

Культура дрожжей аккумулирует биомассу дрожжей до 16,31 г/л с.в.

Содержание внутриклеточных липидов составляет 31,5-38,8 % (качественный состав

представлен на рис.6.3); каротиноидов 483,3-576,6 мкг/г с.в., в том числе, β – каротин

172,5-213,2 мкг/г с.в., торулин 137,6-256,4 мкг/г с.в., торулародин 173,2-217,8 мкг/г с.в.

(рис.6.4).

Рисунок 6.3. Качественный состав липидов дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-

YS-03 (% от общего количества липидов)

Рисунок 6.4. Качественный состав каротиноидов дрожжей Rhodotorula gracilis

CNMN-YS-03 (% от общего количества)

24,8

35,5

14,9

7,8

10,6

6,4

фосфолипиды сте рины жирные кислоты моноглицериды триглецириды эфиры и воска

35%

29%

36%

β-каротин торулин торулародин

6.1.3.Описание технологического процесса (рис. 6.5).

Процесс состоит из 3-х этапов:

1. Получение инокулята.

2. Процесс ферментации и биосинтеза БАВ.

3. Получение препарата.

Для экстракции и анализа биологически активных веществ необходимы следующие

материалы, реактивы и аппаратура:

y Материалы: пипетки, чашки Петри, пробирки, колбы на 50; 100; 200; 500; 1000

мл, воронки.

y Реактивы: этанол, метанол, хлороформ, гексан, соляная кислота, петролейный

эфир, ацетон, спирт, натрий безводный сернокислый.

y Аппаратура: термостат, качалка, роторный испаритель, центрифуга, .

денситометр, спектрофотометр, аминоанализатор, хроматограф, весы.

1. Получение инокулята (посевного материала).

а) Выращивание посевного материала культуры Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03

проводится в пробирках на агаризованном пивном сусле и в колбах с жидким пивным

суслом.

Агаризованная питательная среда готовится следующим образом (табл. 6.2):

пивное сусло концентрацией 15 ºВlg доводится до концентрации 7 ºВlg и к нему

добавляется 2 % агар-агара, рН среды доводят до 4,8-5,0 и разливают в пробирки (табл.

6.2). Пробирки с питательной средой стерилизуют в автоклаве (3/4 атм.) в течение 1

часа. Перед посевом пробирки с агар - агаром выдерживают в термостате при

температуре 27 ºС в течение 2 дней. Пробирки с посевным материалом инкубируют в

течение 5 дней в термостате при температуре 27 ºС, для роста и развития культуры.

Культура может храниться на агаризованных средах в течение 2 месяцев с момента

посева. Жидкая питательная среда – пивное сусло готовится аналогично без добавления

агар-агара.

Таблица 6.2

Состав агаризованнной среды

Компоненты Количество, % Количество/л Примечания

Агар – агар

2,0 20 г

Первичное сусло

15ºВ

Пивное сусло

50,0 500 мл Используется 7 ºВ

Вода

дистиллированная

до 100 % до 1 л рН среды 5,5

б) Культивирование происходит в колбах Эрленмейера объемом 1 л. В качестве

материала для посева используют 5-суточную культуру, выращенную на

агаризованном пивном сусле в пробирке. Посевной материал из пробирки смывается

путем добавления 8 - 10 мл физ. раствора и встряхивают, затем переводится в колбу с

подготовленной жидкой питательной средой - пивное сусло. Дрожжи культивируют на

качалке (180-200 об/мин) при температуре 25-27 ºС в течение 3 суток. Полученный

материал используется для глубинного культивирования и вносится в количестве 5 %

от объема питательной среды. Качество посевного материала контролируется

микроскопированием или путем посева в питательный бульон. Стерильный инокулят

может быть использован в течение 10 дней и хранится при температуре +4..+6ºС.

2. Процесс ферментации и биосинтеза БАВ.

Способ состоит из нескольких этапов:

приготовление стерильной питательной среды;

посев культуры Rhodotorula gracilis-CNMN-03 в питательную среду;

ферментация.

В лабораторных условиях ферментация происходит в колбах Эрленмейера

объемом 1 л, предварительно стерилизованных. Для культивирования дрожжей

Rhodotorula gracilis-CNMN-03 готовится питательная среда с установленным составом

(табл. 6.3).

Таблица 6.3

Состав питательной среды для ферментации

№

п/п

Наименование

Количество,

г/л

Примечания

Глицерин

2,0 20,0

Меласса

2,0 20,0

K2HPO4

0,1 1,0

NaCl

0,05 0,5

CaCl2

0,1 1,0

Fe2SО4•7H2O

следы следы

Кукурузное масло

0,01 0,1

[Zn(Gly)(DL-Ser)]

0,001 0,01

Экстракт томатных

выжимок

80,0 800,0 рН 5,5

Питательная среда в количестве 200 мл разливается в колбы. Колбы со средой

стерилизуются в автоклаве при давлении ¾ атм. В остывшую питательную среду

вносится посевной материал в количестве 5 % от объема питательной среды. Колбы с

засеянной ферментационной средой устанавливают на качалку (180-200 об/мин) и

культивируют при температуре 25-27 ºС в течение 5 суток.

3. Получение препарата.

Состоит из следующих этапов:

 Отделение культуральной жидкости от клеточной массы.

 Анализ биохимического состава культуральной жидкости.

 Приготовление препарата.

На пятый день культивирования продуцента, микробная суспензия

центрифугируется в течение 20 минут, при 3000 об/мин., для разделения культуральной

жидкости от биомассы дрожжей.

Комплекс экзометаболитов подвергается биохимическому анализу. Определяется

содержание аминокислот, липидов, витаминов и др. веществ. Методики определения

указаны в главе 2.

Процесс приготовления биопрепарата:

К100 мл культуральной жидкости, содержащей 160-180 мг аминокислот и 80-90

мг липидов, полученных в результате культивирования дрожжей, добавляется 0,4-0,5

мг и ликопина и 1,2-1,3 мг аскорбиновой кислоты.

Препарат упаковывается в количестве 50 или 100 мл и стерилизуется

ступенчатым способом в течение трех дней при ¾ атм.

Эффективность биопрепарата была изучена сотрудниками лаборатории

Экофизиологии и Консервирования Ихтиогенофонда Института Зоологии Академии

Наук Молдовы. Результаты показали, что использование биопрепарата из дрожжей

способствует увеличению процента жизнеспособной оплодотворенной икры в 1,1-1,2

раза, росту выживаемости эмбрионов в 1,2-1,4 раза, а также способствует переходу

личинок на внешнее питание. Использование биопрепарат увеличивает выживаемость

и индивидуальный вес личинок в 1,5 раза, стимулируя ритм развития личинок.

Данные позволяют рассматривать биопрепарат как перспективный для

использования в аквакультуре. Развитие исследований в данном направлении и

практическое применение препарата позволит решить ряд проблем, связанных с

получением продуктов высокого качества. На препарат получен патент (MD 2593,

30.11.2004).

100

Error!

Рисунок 6.5. Схема получения биопрепарата из пигментных дрожжей для

стимулирования жизнеспособности икры рыб и личинок рыб

Глубинное культивирование дрожжей

на питательной среде MZ-30

(120 часов), t + 25-27ºС

Отделение культуральной жидкости

от клеточной массы (центрифугирование)

Получение препарата

из пигментных дрожжей

Анализ качества продукта

Упаковка

+1,0 г/л

кукурузного

масла

+экстракта

томатных

выжимок

+0,01 г/л

[Zn(Gly)(DL-

Ser)]

Ликопин-

4..5 мг/л

Аскорбиновая

кислота -

12..13 мг/л

Культура дрожжей на скошенном агаризованном пивном сусле

Получение инокулята (культивирование на жидкой

питательной среде с пивным суслом(72 часа), t + 25-27ºС