Кирица Е. Направленный синтез каротиноидов у дрожжей и перспектива их использования
Подождите немного. Документ загружается.
101
6.2. Технология получения цинксодержащей биомассы пигментных
дрожжей, предназначенной для стартовых кормов личинок рыб
Известно, что стартовые корма личинок рыб, помимо муки животного
происхождения, витаминов, аминокислот, содержат паприн (дрожжевая биомасса,
полученная на н-парафинах нефти), либо этаноловые дрожжи, либо обработанные
пивные дрожжи (Патент SU 1398119, 1986; Патент SU 1575333, 1988). Однако, такие
стартовые корма не обеспечивают высокий темп роста личинок.
Исходя из необходимости введения в питание рыб физиологически активных
биодобавок – пищевых стимуляторов, проводились исследования по получению
дрожжевой биомассы с прогнозируемым содержанием каротиноидных пигментов и
цинка. Цинк был выбран как один из химических элементов, который активизирует
трипсиновую активность в желудке рыб (BRAFIELD, KOODIE, 1994).
6.2.1. Характеристика биопродукта
Биопродукт получают путем непрерывного культивирования дрожжей рода
Rhodotorula на оптимизированной жидкой питательной среде MZ-30.
Консистенция биопродукта - сухой порошок. Биопродукт представляет собой
комплекс метаболитов, синтезируемых дрожжами. Биохимические исследования
продукта показали, что он содержит комплекс биологически активных веществ: 40-45%
протеина, 140-165 мг/г аминокислот, в т.ч. незаменимые – 55-59%, иммуноактивные –
58-64% (таблица 6.4); каротиноиды – 483,3-576,6 мкг/г с.в., липиды - 31,5-38,8 %
(незаменимые жирные кислоты – 18-20 %), цинк – 0,5-1,0 мг%, гликоген – 8,54 % .
Таблица 6.4
Содержание иммуноактивных аминокислот в цинксодержащей биомассе дрожжей
рода Rhodotorula
Иммунноактивные аминокислоты % от суммы
Глутаминовая кислота
14,13
Аспарагиновая кислота
8,43
Аланин
6,26
Цистин
10,51
Глицин
4,82
Серин
5,90
Треонин
5,70
Триптофан
0,56
Валин
7,95
102
Препарат представляет собой порошок красно-коричневого цвета, расфасованный в
пакеты по 100 г. Биопрепарат хранится при температуре +4-10ºС, в течение 6 месяцев.
6.2.2. Характеристика используемого продуцента.
Характеристика штамма Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 (см. главу 6.1.2).
6.2.3.Описание технологического процесса (рис. 6.6).
Процесс состоит из 3-х этапов:
1. Получение инокулята.
2. Процесс ферментации и биосинтеза БАВ.
3. Получение препарата.
Для экстракции и анализа биологически активных веществ необходимы
следующие материалы, реактивы и аппаратура:
y Материалы: пипетки, чашки Петри, пробирки, колбы на 50; 100; 200; 500; 1000
мл, воронки.
y Реактивы: этанол, метанол, хлороформ, гексан, соляная кислота, петролейный
эфир, ацетон, спирт, натрий безводный сернокислый.
y Аппаратура: термостат, качалка, роторный испаритель, центрифуга,
денситометр, спектрофотометр, аминоанализатор, хроматограф, весы.
1. Получение инокулята (посевного материала)
а) Выращивание посевного материала культуры Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03
проводится в пробирках на агаризованном пивном сусле и в колбах с жидким пивным
суслом.
Агаризованная питательная среда готовится следующим образом ( см. табл. 6.2):
пивное сусло концентрацией 15 ºВlg доводится до концентрации 7 ºВlg и к нему
добавляется 2 % агар-агара, рН среды доводят до 4,8-5,5 и разливают в пробирки (табл.
6.2). Пробирки с питательной средой стерилизуют в автоклаве (3/4 атм) в течение
1часа. Перед посевом пробирки с агар - агаром выдерживают в термостате при
температуре 27 ºС в течение 2 дней. Пробирки с посевным материалом инкубируют в
течение 5 дней в термостате при температуре 27 ºС, для роста и развития культуры.
Культура может храниться на агаризованных средах в течение 2 месяцев с момента
посева. Жидкая питательная среда – пивное сусло готовится аналогично без добавления
агар-агара.
б) Культивирование происходит в колбах Эрленмейера объемом 1 л. В качестве
материала для посева используют 5-суточную культуру, выращенную на
103
агаризованном пивном сусле в пробирке. Посевной материал из пробирки смывается
путем добавления 8 - 10 мл физ. раствора и встряхивают, затем переводится в колбу с
подготовленной жидкой питательной средой – пивное сусло. Дрожжи культивируют на
качалке (180-200 об/мин) при температуре 25-27 ºС в течение 3 суток. Полученный
материал используется для глубинного культивирования и вносится в количестве 5 %
от объема питательной среды. Качество посевного материала контролируется
микроскопированием или путем посева в питательный бульон. Стерильный инокулят
может быть использован в течение 10 дней и хранится при температуре +4 - 6ºС.
2. Процесс ферментации и биосинтеза БАВ.
Способ состоит из нескольких этапов:
приготовление стерильной питательной среды;
посев культуры Rhodotorula gracilis-CNMN-03 в питательную среду;
ферментация.
В лабораторных условиях ферментация происходит в колбах Эрленмейера
объемом 1 л, предварительно стерилизованных. Для культивирования дрожжей
Rhodotorula gracilis-CNMN-03 готовится питательная среда с установленным составом
(см. табл. 6.3).
Питательная среда в количестве 200 мл разливается в колбы. Колбы со средой
стерилизуются в автоклаве при давлении ¾ атм. В остывшую питательную среду
вносится посевной материал в количестве 5 % от объема питательной среды. Колбы с
засеянной ферментационной средой устанавливают на качалку (180-200 об/мин) и
культивируют при температуре 25-27 ºС в течение 5 суток.
3. Отделение клеточной массы дрожжей и биохимический анализ
Отделение клеточной массы от культуральной жидкости.
Анализ биохимического состава клеточной массы.
Приготовление препарата.
На пятый день культивирования продуцента микробная суспензия
центрифугируется в течение 20 минут, при 3000 об/мин для отделения биомассы
дрожжей от культуральной жидкости. Сырая биомасса подвергается термической
обработке при температуре +75-85°C, в течение 10-40 минут. Из 1 литра питательной
среды получают 16,31 г сухой биомассы. Проводят биохимический анализ биомассы
(глава 2) и упаковывают в пакеты.
104
Рисунок 6.6. Схема получения биопродукта из пигментных дрожжей для
приготовления стартового корма для личинок рыб
Получение посевного материала
(инокулята)
Rhodotorula gracilis
CNMN-YS-03
Культивирование на жидкой
питательной среде с пивным
суслом (72 часа), t+25-27ºC
Культивирование продуцента на оптимизированной
питательной среде MZ-30
+1,0 г/л кукурузного масла,
+ экстракт томатных выжимок
+0,01 г/л [Zn(Gly)(DL-Ser)]
Температура: +25-27ºC
Освещение: 12-15тыс. erg/cм²
pH 5,0-5,5
Отделение культуральной жидкости от клеточной массы
(центрифугирование)
Деминерализация
биомассы
Подготовка
культуральной
жидкости
Получение препарата
на основе
культуральной
Получение
цинксодержащего
биопродукта
Анализ качества,
расфасовка и
упаковка
Анализ качества,
расфасовка и
упаковка
105
Эффективность цинксодержащего биопродукта из пигментных дрожжей была
оценена сотрудниками лаборатории Экофизиологии и Консервирования
Ихтиогенофонда Института Зоологии Академии Наук Молдовы.
Использование нового корма способствует увеличению выживаемости личинок на
17-21 %, средней массы личинок на 38-53 %, производства ихтиомассы на 64-88% по
сравнению с контролем. На базе полученных результатов получен патент (Hotărârea
pozitivă MD № 4587 от 19.10.2005).
106
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Каротиноидные пигменты широко используются как пищевые красители,
антиоксиданты, антимутагены, антистрессовые средства, иммуномодуляторы и
иммуностимуляторы. Применение каротиноидов в кормлении сельскохозяйственных
животных и птицы позволяет придавать кормам высокую биологическую активность.
В настоящее время, природные красители все больше вытесняют синтетические,
в том числе желтой и красной группы оттенков, благодаря современной тенденции
развития индустрии здорового питания, в том числе детского, диетического и
лечебного назначения. Но на сегодняшний день, из стран СНГ производство
микробиологического β-каротина освоено лишь на Украине и в России
(www.vitamarket.com.ua
; www.polisintey@el.ru; www.uralbiopharm.ru) .
В Молдове научные исследования в данном направлении ведутся в Институте
Микробиологии Академии Наук Молдовы, в частности, в лаборатории
Микробиологические продукты. Сотрудники лаборатории изучают проблемы
физиологической регуляции метаболизма пигментных дрожжей с целью получения
микробных продуктов для агропромышленного комплекса.
Данная работа посвящена научно-прикладным исследованиям по изучению
комплекса каротиноидов у дрожжей рода
Rhodotorula с целью получения новых
препаратов для аквакультуры.
Исследования, проведенные по скринингу штаммов дрожжей с
каротинообразующей способностью, позволили отобрать два наиболее
высокопродуктивных штамма, обладающие способностью к повышенному биосинтезу
каротиноидных пигментов – Rhodotorula gracilis CNMN-YS-02 и Rhodotorula gracilis
CNMN-YS-03. Культивирование штамма Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 на
питательной среде MZ-30 в оптимальных условиях (температура – 25..27°С, рН-5.5,
освещение 12-15 тыс.эрг/см
2
, длительность культивирования 5 суток) обеспечивает
максимальный выход клеточной массы до 12,57 г/л и выход каротиноидных пигментов
на пивном сусле до 703,4 мкг/г с.в. Штамм дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-02
также отличается высокой способностью к синтезу каротиноидов, количество которых
может достигать 659,26 мкг/г. Изучение качественного состава каротиноидного
комплекса дрожжей показало, что изучаемым штаммам красных дрожжей, в
зависимости от их видовой принадлежности, свойственна способность к биосинтезу
цветных каротиноидов (β-каротина, γ-каротина, торулина, торулародина и пигмента Х).
107
Характерным для всех штаммов является наличие в каротиноидном комплексе
пигментов β-каротина, торулина и торулародина. Отобранные штаммы не уступают по
биосинтетической активности другим известным штаммам каротинсинтезирующих
дрожжей (КИРИЛЛОВА, 1998; ПОДОПРИГОРА, 1996). Высокая биосинтетическая
способность позволяет предложить штамм дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03
в качестве биотехнологического объекта – продуцента каротиноидов.
Для разработки способов направленного синтеза каротиноидов, повышения
продуктивности биосинтетической активности дрожжей были использованы
нетрадиционные источники питания, предшественники, индукторы и некоторые
координационные соединения переходных металлов.
Использование экстракта из томатных выжимок при культивировании
Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 позволяет повысить продуктивность до 15,633 г/л
с.в., а содержание каротиноидов в биомассе - до 9755,39 мкг/л. Увеличение выхода
микробной массы и каротиноидных пигментов в 2 раза доказывает целесообразность
применения экстракта томатных выжимок, как перспективного источника для
биотехнологии получения микробных каротиноидов.
Применение предшественников процесса каротинообразования (ацетат натрия,
ацетат цинка и лимонной кислоты) показало, что прирост клеточной массы дрожжей
Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 составляет 14,38 г/л при внесении в питательную
среду ацетата натрия концентрацией 3,0 г/л. Содержание каротиноидов (β-каротина,
торулина и торулародина) увеличивается в максимальных пределах по отношению к
контролю в 2,5 раза при культивировании дрожжей на питательной среде с
добавлением лимонной кислоты (1,0 г/л).
Включение в состав среды культивирования дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-
YS-03 индукторов процесса каротинообразования (подсолнечное, кукурузное, соевое,
оливковое масла и ретинол) оказывает положительное влияние на биосинтетическую
активность. Установлено, что исследуемые индукторы оказывают положительный
эффект как на продуктивность, так и на содержание каротиноидов в биомассе дрожжей.
Наиболее эффективным стимулирующим действием на продуктивность дрожжей (на
65% выше, чем в контроле) обладает подсолнечное масло в концентрации 1,0 г/л,
увеличение количества каротиноидов до 3180,406мкг/л у Rhodotorula gracilis CNMN–
YS–03 происходит в присутствии кукурузного масла концентрацией 1,0 г/л.
Использование координационных соединений некоторых переходных
металлов Fe (II) позволило констатировать, что они обладают специфическим
108
характером действия и являются биорегулятором синтеза каротиноидных пигментов
штаммов дрожжей рода Rhodotorula. Применение [Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] в
составе питательной среды Лундина способствует активному биосинтезу
каротиноидов, содержание которых в биомассе дрожжей увеличивается на 52 % для
Rhodotorula gracilis CNMN–YS–III/5 и на 74 % для Rhodotorula gracilis CNMN – YS – 03.
На основе методов математического планирования были разработаны
оптимальные питательные среды и предложены четыре способа, позволяющие
увеличить эффективность биосинтеза общего количества каротиноидных пигментов,
β-каротина, торулина и торулародина.
Питательная органическая среда MZ-30, содержащая экстракт томатных
выжимок, лимонную кислоту и [Fe
2
NiO(CCl
3
COO)
6
(CH
3
OH)
3
] позволяет увеличить
суммарное содержание каротиноидов до 15213,66 мкг/л. Среда для культивирования
дрожжей, в состав которой включены экстракт томатных выжимок и лимонная кислота,
способствует увеличению содержания β-каротина в биомассе до 4056,20 мкг/л.
Наличие в среде кукурузного масла способствует наибольшему выходу торулина,
количество которого в биомассе дрожжей достигает 7208,29 мкг/л. При
культивировании пигментных дрожжей на органической среде с дополнительным
введением кукурузного масла и лимонной кислоты синтез торулародина достигает
2730,49 мкг/л.
Для получения биомассы дрожжей с повышенным содержанием цинка был
оптимизирован состав питательной среды, содержащий экстракт томатных выжимок,
кукурузное масло и [Zn(Gly)(DL-Ser)], что позволяет получить 16,31 г/л сухой
биомассы, содержащей до 1,87 мг% цинка.
Проведенные исследования послужили основой для разработки технологии
получения препаратов на основе экзометаболитов и цинксодержащей биомассы
каротинсинтезирующих дрожжей рода Rhodotorula. Препарат на основе
экзаметаболитов дрожжей, полученный согласно разработанной технологии, состоит из
160-180мг% аминокислот, в т.ч. иммунноактивных – 70-78 % (аспарагиновая кислота,
глутаминовая кислота, глицин, аланин, валин, цистеин, триптофан) и незаменимых
аминокислот -67-71%; липидов – 80-90 мг%; ликопина – 0,4-0,5 мг%; аскорбиновой
кислоты-1,2-1,4 мг%. Биопрепарат на основе цинксодержащей биомассы дрожжей
состоит из 40-45% протеина, 140-165 мг/г аминокислот, в т.ч. незаменимые-55-59%,
иммуноактивные– 58-64%; каротиноиды - 483,3-576,6 мкг/г с.в.; липиды-31,5-38,8 %
(незаменимые жирные кислоты -18-20 %), цинк - 0,5-1,0 мг%, гликоген – 8,54 %.
109
Экспериментально доказана эффективность использования биопрепаратов,
способствующих увеличению жизнеспособности, стимуляции развития личинок и
икры, а также в качестве стартового корма для рыб. Полученные результаты
позволяют включить красные дрожжи Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 в число
перспективных объектов биотехнологии и использовать их в качестве основы для
получения каротиноидных пигментов и биопрепаратов с широким спектром
применения.
110
ВЫВОДЫ
1. В результате скрининга дрожжей рода Rhodotorula и рода Sporobolomyces
установлено, что из 14 изученных штаммов – у 4 (Rhodotorula gracilis CNMN-YS-02,
Rhodotorula gracilis CNMN-YS-I/4-04, Sporobolomyces pararoseus CNMN-YS-01,
Rhodotorula gracilis CNMN-YS -03) были идентифицированы пять каротиноидных
пигментов: β-каротин, γ-каротин, торулин, торулародин и один
неидентифицированный - пигмент Х. У штаммов дрожжей Rhodotorula gracilis
CNMN-YS-II/5-05, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-IV/14, Rhodotorula mucilaginosa
CNMN-YS-10, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-IV/15, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-
V/12 и Rhodotorula gracilis CNMN-YS-I/3 были идентифицированы 4
каротиноидных пигмента - β-каротин, γ-каротин, торулин и торулародин. Штаммы
пигментных дрожжей -Rhodotorula gracilis CNMN-YS-II/6, Rhodotorula gracilis
CNMN-YS-II/9, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-III/20-06 и Rhodotorula rubra CNMN-
YS-09), синтезировали 3 основных каротиноида - β- каротин, торулин и
торулародин.
2. Штамм Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 характеризующийся высокой
способностью продуцировать на пивном сусле биомассу дрожжей - до 12,57 г/л с.в.
и синтезировать каротиноиды красной (торулин и торулародин) и желтой (β-
каротин, γ-каротин) группы пигментов - до 703,42 мкг/г с.в., предлагается в
качестве источника для получения каротинсодержащих препаратов.
3. Использование методов математического планирования экспериментов позволило
оптимизировать состав питательной среды. В зависимости от конечной цели были
разработаны 4 способа направленного синтеза каротиноидов:
• Способ с использованием экстракта томатных выжимок (0,8 л), лимонной
кислоты (1,0 г/л) и [Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] (0,5 мг/л), включенных в
состав питательной среды MZ-30, обеспечивает увеличение суммарного
содержания каротиноидов в 1,6 раза (15213,66 мкг/л) по отношению к
контролю.
• Способ с использованием экстракта томатных выжимок (0,8 л) и лимонной
кислоты (1,0 г/л), включенных в состав питательной среды MZ-30,
обеспечивает увеличение синтеза β-каротина в 1,7 раза (4056,200 мкг/л)
больше по отношению к контролю.