Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

понятна необходимость отдельных витаминов в питательных сре-

дах для биообъектов.

Достаточно много ферментов (порядка

25%)

относится к метал-

лоферментам, представляющим собой одну из групп металлобио-

молекул.

Такие ферментные белки без металлов не проявляют фермен-

тативной активности. В тех же случаях, когда ионы металлов не

выполняют роли коферментов (металлы-кофакторы), а лишь акти-

вируют ферментативные реакции, то такие ферменты по сути

Металлобиомол

Ферментные белки

Оксщ\оре^уктазы

Оксидазы

(Fe,Cu,Mo)

Дегидрогеназы

(Fe.Cu.Mo)

Гидроксилазы

(Fe,Cu,Mo)

Оксигеназы

(Fe)

Супероксид—

дисмутаза

(Cu,Zn,Mn)

Нитрогеназы

(Fe.Mo)

Гидрогеназы

(Fe)

Гидролазы

Карбоксипепти

—

даза

(Zn)

Аминопептидазы

(Mg.Mn)

Фосфатазы

(Mg,Zn,Cu)

Изрмер§зы^_сицтетазы

Транспортные и

аккумулирующие белки

Переносчики

электронов

Цитохромы (Fe)

Fe-S(Fe)- белки

Си —белки

^кущлнрующие,

JUaBcnQKraweii

£4>улурцые

Ферритин (Fe)

Трансферрин (Fe)

Церулоплазмин (Fe)

Связывающие 0

Миоглобин (Fe)

Гемоглобин (Fe)

Гемеритрин (Fe)

Гемоцианин (Fe)

Небелковые молекулы

Фотовосстанав -

_лив.ающие.

Хлорофилл (Мд)

и Фотосистема II

(Мп,Мд)

Транспортирующие

металлы и структур

—

Сидерофоры (Fe)

Скелетные (Ca.Si)

Коэнзимы (Со)

—

белки

своей не являются металлоферментами. Их следует называть ме-

таллоактивйрованными ферментами.

Можно утверждать, что в металлоферментах ионы металлов

выполняют и каталитическую и структурную роли, тогда как в

металлоактивированных ферментах — преимущественно катали-

тическую. Тем не менее металлы в качестве коферментов и

кофакторов в какой-то части сходны в своих функциональных

проявлениях. Для металлоактивированных ферментов возможны

4 схемы трехчленных комплексов, участниками которых являются

фермент (Ф), субстрат (С) и металл (М) в стехиометрическом

соотношении 1:1:1.

1) Ф—С—М, 2) Ф—М—С, 3) М—Ф—С, 4) Ф <^ [

В первой схеме мостиковое положение занимает субстрат, во

второй — металл, в третьей — фермент и в четвертой — металл в

циклическом комплексе. Металлоферменты, например, не форми-

руют комплекс Ф—С—М, так как при очистке они выявляются в

форме Ф—М.

Металлоферментами являются так называемые геминовые

ферменты (каталаза, пероксидаза, цитохромоксидаза), в составе

которых имеется простетическая железопорфириновая группи-

ровка, или гем; трансферазы, у которых коферментная форма

витамина Вп представлена 5'-дезоксиаденозилкобаламином.

Все ферменты с коферментом Bi2 катализируют реакции об-

мена водорода, связанного с углеродом, на какую-либо иную

Витамин Bi2

группу (алкильную, аминную, гидроксильную, карбоксильную).

Другая коферментная форма витамина Bi2 — метил-кобаламин

(группа CN в коррине замещена метилом) участвует в реакциях

переноса метильных групп. Кофермент Bi2 в определенной степени

сходен с гемом, однако вместо железа в нем содержится кобальт.

В настоящее время стали известны и новые коферменты.

Например, корфин (фактор 430) представляет собой никельтетра-

пиррол и напоминает рассмотренные выше макроциклические

структуры гема и коррина. Корфин выступает коферментом окси-

доредуктаз у метанобразующих бактерий, связанных с окислитель-

но-восстановительным превращением одноуглеродного субстрата.

3 т. 8524

С£ОЬ

снЛ-

"7~

H--J

соон

HN]

,.N=a

1н

•

сн

чУ^сс

/ *н

соон

кофермент F 430, ипи корфин

В метанообразующих бактериях найдены также фактор 420,

оказавшийся гидридным донором, и фактор, восстанавливающий

диоксид углерода.

У метилотрофных бактерий, окисляющих метан, обнаружен

кофермент метоксатин, содержащий в своей молекуле ортохино-

новую простетическую группу. Оксидоредуктаза — глюкозодегид-

рогеназа Acinetobacter calcoaceticus содержит сходную ортохино-

новую простетическую группу. Вот почему такие ферменты пол-

учили название хинобелки.

он

сн

о соо-

^-о'УуЛ

А/\

О" О СОСГ

фактор 420 - гидридный донор

СОСг

ортохиноновая группа в метокеатмне

фактор, восстанавливающий 0(¾

Механизм действия этих коферментов точно пока неизвестен.

Кофакторами в металлоактивированных ферментах часто вы-

ступают ионы магния, цинка, кальция, то есть металлы с постоян-

ной валентностью. Например цинк активирует алкогольдегидроге-

назу, щелочную фосфатазу; кальций - сс-амилазу; магний — АТФ-

азу, гексокиназу и многие другие ферменты; марганец (или магний)

— енолазу; калий — пируваткиназу, и т. д.

Из сказанного о металлоферментах и металлоактивированных

ферментах следует, что наличие определенных ионов в среде

культивирования биообъектов строго обязательно.

Кинетические характеристики биокатализаторов, определяю-

щие активность и длительность работы ферментов в различных

условиях, являются важными показателями и при промышленном

получении ферментов. Все эти данные подробно рассматриваются

в курсе биохимии. Здесь же мы останавливаемся лишь на важней-

ших параметрах, без которых биотехнология ферментов будет

недостаточно охарактеризованной.

В процессе биокатализа активность ферментов и, следователь-

но,

их каталитические функции снижаются. Кажущаяся структур-

ная громоздкость их в нативном виде (от лат. nature — природа) с

лихвой компенсируется эффективностью катализа, если сравни-

вать их с неорганическим ("простыми") катализаторами. Однако в

изолированном виде ферменты достаточно легко инактивируются,

что приобретает важное значение для практики. Отсюда возникает

проблема стабилизации активности ферментов в случаях их про-

мышленной эксплуатации. Следует заметить, что in vivo инактива-

ция и активация ферментов, равно как и синтез их de novo или

denuo (по-лат. — заново), регулируется самим организмом. К тому

же в организме (клетке, ткани) многие ферменты находятся в

связанном состоянии. Очевидно, что при этом их конформации

больше или меньше изменяются, что не безразлично для клетки с

функциональной точки зрения. Из практической работы известно

немало случаев, когда неполностью очищенные ферменты были

какое-то время активнее и стабильнее чистых образцов биоката-

лизаторов. На этом основании можно предполагать, что так назы-

ваемые примеси создавали благоприятное окружение ферменту и,

очевидно, выгодное потребителю. Стабилизация ферментов могла

быть обусловлена разными факторами, например, иммобилиза-

цией на мембранных структурах, соединением с высокополимер-

ными углеводами или гликоконъюгатами и пр. Подобная стабили-

зация сродни консервации белковой молекулы, так как здесь речь

идет о сохранении фермента какое-то (обычно более или менее

длительное) время со всеми присущими ему параметрами.

В любом случае при получении ферментов в производстве

необходимо опираться на воспроизводимые результаты, заложен-

ные в регламенте.

Активность и стабильность — как параметры важны и для вновь

внедряемых в производство ферментов, поскольку предполагаемая

их "выходная активность" приобретает существенное значение с

точки зрения выбора (или проектирования) конструкции реактора,

оснащении его необходимой контрольно-измерительной аппарату-

рой и т. д. (в частности, для исключения быстрой инактивации

фермента).

Активность биокатализаторов измеряют в международных еди-

ницах (ME) — 1 ME соответствует количеству фермента, превра-

щающему 1 микромоль (мк/моль; 10"

моль) субстрата в 1 мин. в

стандартных условиях. Единицы активности могут быть выражены

в мкЕ, нЕ и пЕ, то есть соответственно в микро-, нано- и пикоеди-

ницах с учетом превращения 10

, 10"

или 10"

моля субстрата в 1

мин. Удельную активность выражают в единицах на 1 мг белка. С

1973 г. введена единица ферментативной активности катал (кат.),

соответствующая количеству катализатора, способного превра-

щать 1 моль субстрата в продукт за 1 секунду. Тогда соотношения

катал и ME будут следующими: 1 кат=

моль субстрата •

С"

= 60

моль» мин"

=60*10

мкмоль» мин"' = 6«10

ME, 1 МЕ=1 мкмоль*

мин*'= 1/60 мкмоль*с"'= 1/60 мккат= 16,67 нкат= 16670 пкат. Все

это косвенно подтверждает факт трудности выделения ферментов

в чистом виде и на практике приходится чаще иметь дело с группой

белков в продукте — сырце или в исходном материале, или,

наконец, в других партиях материала, подлежащих разделению.

В лабораторных и производственных условиях нередко прихо-

дится иметь дело с денатурацией ферментов в зависимости от ряда

факторов, например, биологических — гидролиз целевого продукта

какой-либо пептид-гидролазой, находящейся в исходном сырье или

привнесенной случайно, например, при микробном загрязнении;

физических — неадекватное температурное, механическое, ради-

ационное воздействия; химических — рН, комплексообразовате-

лей, растворителей, ионогенных поверхностно-активных веществ,

тяжелых металлов и т. д.

Естественно, что от качества выделения и очистки фермента

зависит надежность анализа его структуры. Тем не менее, следует

помнить, что одинаковые ферменты, выделяемые из различных

источников, могут иметь разные аминокислотные последователь-

ности и, следовательно, они не тождественны — их каталитическая

активность и свойства будут различными. В качестве примера

можно назвать вид Вас. coagulans, образующий глюкозоизомеразу;

этот фермент активируется ионами Со

, а такой же фермент,

продуцируемый мутантом данного вида при рН более 8, не нуж-

дается в ионах кобальта. Вот почему точность имеющейся инфор-

мации об источнике фермента, его технологии, паспортных данных

приобретает исключительную важность при сравнении фермента,

выпущенного разными фирмами-изготовителями.

М. Левитт и К. Чотиа в 1976 г. подразделили структурно

известные белки по наличию и расположению ос-спиралей и

Р-слоев на пять классов:

I — белки, состоящие только из а-спиралей, уложенных вместе

в глобулярную структуру;

II — белки, состоящие только из (3-слоев и формирующие

глобулу в форме бочонка;

III — белки, включающие ос-спирали и Р-слои (а + Р-белки), но

разобщенные в третичной структуре;

IV — белки сс/р, в которых а- и Р-структурные участки чере-

дуются в первичной структуре, формируя третичную структуру, в

центре которой находятся обычно параллельно уложенные Р-слои,

окаймленные с обеих сторон ос-спиралями;

V — обычно малые молекулы с многими -S—S-мостиками или

ассоциированные с крупным кофактором "неупорядоченные бел-

ки",

обладающие слабой вторичной структурой.

На рис. 13 представлены схемы Дж. Ричардсон (1981) для

различных белков, отнесенных к какому-либо одному из пяти

вышеназванных классов.

Рис. 13. Пять классов белков по Дж. Ричардсон

(1981):

А — миохемеритин (класс I),

1Я

Б — Си, Zn—супероксиддисмутаза (класс II),

—

лизоцим (а+р-структура, III класс),

и Д

—

две ортогональные проекции НАД—свя-

зывающего домена лактатдегидрогеназы (IV

класс),

Е — тризофосфатизомераза

(ГУ

класс),

Ж Ж — нейраминидаза вируса гриппа (V класс).

Более или менее длинные цепи белков, как

правило,

формируют

домены, представляющие собой свернутую в пространстве струк-

туру, имитирующую маленькую белковую молекулу. Доменам

присущи функции связывания, и в ферментных белках активный

центр располагается преимущественно на границе между двумя

или большим числом

доменов.

К настоящему времени установлено,

что домены способны перемещаться друг относительно друга в

процессе функционирования содержащей их молекулы.

трипси-

ногене домен из неупорядоченного состояния переходит в упоря-

доченное в ходе активации зимогена.

Заметный прогресс в изучении структуры белков начался с

конца 70-х годов текущего столетия. Если до этого структуры их

выводили на основании метода диффракции нейтронов, карт

распределения электронных плотностей с введением в молекулы

белков тяжелых атомов, то в последующие годы были развиты

методы синхронной радиации, методы с использованием компью-

терной техники, что сослужило огромную службу кристаллогра-

фии данных биополимеров. В этой связи статичный метод рентге-

ноструктурного анализа одиночного кристалла способен дать ди-

намичную информацию. На основании указанных методов пока-

зано,

например, что фермент лизоцим имеет оболочку из 33—35

прочно связанных молекул воды и менее упорядоченную область

из 95—105 молекул воды, соединенных с белком лишь одной

водородной связью. Около 60—80% остальной воды распределено

в промежутках между кристаллами и не влияет на электронную

плотность белка.

Молекулы белков не являются жесткими структурами — они

подвижны л, следовательно, достаточная лабильность молекул

ферментов (молекулярная вибрация) играет важную роль в узна-

вании субстрата и стабилизации переходного состояния.

Чтобы увидеть ферменты в действии стали использовать метод

рентгеноструктурного анализа при низких температурах (криоэн-

зимология) — можно сделать "стоп-кадры" в кинетически значи-

мых точках катализируемой реакции.

Теперь хорошо известно, что ферменты, внедряемые в про-

мышленность выгодно отличаются от неорганических (или синте-

тических) катализаторов рядом преимуществ, существенным из

которых следует назвать низкую энергоемкость ферментативных

процессов, то есть сравнительно небольшие затраты внешней

энергии. На каталитические процессы в промышленности прихо-

дится 80—90% и доля их продолжает возрастать.

неорганическом

синтезе, например, получают контактным способом десятки мил-

лионов тонн серной кислоты в год. При контактном процессе

окисление SO2 в БОз протекает в присутствии катализатора V2O5

с добавлением К2О и других оксидов.

В органическом синтезе на никелевых катализаторах осущест-

вляют многие реакции гидрирования соединений, включающих

С = С, Са С, С =

О,

NO2 — группы. Для примера назовем алюмо-

молибденовые, алюмохромовые и алюмоплатиновые катализато-

ры,

применяемые для дегидрирования линейных и разветвленных

алканов в олефины. Так, катализаторы на основе оксида хрома,

применяемые в реакции превращения бутана в бутен, работают

при температуре около 600°С, а регенерация их протекает при

640—650°С. Оксидные катализаторы окисления С03О4, СГ2О3, NiO

эффективны также при температурах

250—600°С.

Лишь отдельные

катализаторы полимеризации (ВЁз) проявляют свое действие при

—80°—100°С, например, при получении полиизобутилена. Однако

чтобы добиться понижения температуры до —80° или —100° С,

также необходима затрата энергии.

Напротив, все биохимические реакции в живых системах

потекают при сравнительно низких температурах. Например, фер-

менты микроорганизмов

—

сапрофитов, живущих в почве средних

широт нашей страны, относятся к мезофилам, то есть их ферменты

эффективно действуют в пределах от +

до +50°С (с преимуще-

ственным интервалом от +

20 до

30°С).

Нечто аналогичное можно

сказать и о ферментах растений. Ферменты животных более

эффективны при нормальной температуре тела.

Тем не менее, следует помнить, что для каждого фермента есть

свои так называемые кардинальные точки температуры, рН и др.

(minimum, optimum, maximum).

Необходимо также отметить и тот факт, что скорости фермен-

тативных реакций при оптимальных условиях многократно превы-

шают скорости реакций, в которых используются неорганические

(синтетические) катализаторы.

Ферменты, с точки зрения энергетики, заметно снижают энер-

гию активации химических реакций. Под энергией активации

понимают количество энергии в Джоулях, необходимое для при-

ведения всех молекул 1 моля вещества при определенной темпе-

ратуре в состояние критического энергетического уровня (пере-

ходный уровень), при котором начинает происходить химическая

реакция. Если не все молекулы вещества достигают переходного

уровня, то скорость химической реакции снижается.

Основные пути повышения скоростей реакции — это либо

использование температурного фактора, либо катализаторов. В

случае применения неорганических или синтетических катализа-

торов необходимо использовать в большинстве случаев высокие

температуры. Как уже было

сказано,

биокатализаторы эффективно

работают при сравнительно низких температурах. Скорости реак-

ций зависят от концентраций субстратов. Когда фермент насыщен

субстратом, он не может функционировать быстрее — это и есть

максимальная скорость реакции (V

ax), то есть, когда доля свобод-

ного фермента оказывается предельно низкой.

Общая скорость ферментативной реакции должна быть про-

порциональной концентрации фермент-субстратного комплекса

ES (Е — энзим, S— субстрат). Зависимость скорости фермента-

тивной реакции от концентрации субстрата графически представ-

ляется гиперболической кривой (рис. 14). Км на рисунке представ-

ляет собой константу Михаэлиса—Ментен, то есть концентрацию