Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

Часть II.

Роль фундаментальных исследований

в развитии биотехнологии

Подразделение научных исследований (равно как и наук) на

фундаментальные и прикладные в какой-то мере условно, хотя

фактически эти термины в достаточно широком ходу. Более того,

фундаментальные и прикладные исследования включают в перс-

пективные планы научных разработок в соответствующих акаде-

мических и отраслевых учреждениях.

Принято считать, что фундаментальные (от лат. fundamentum-

основа, опора, основание) исследования изначально нацелены на

решение основополагающих проблем, а конкретные результаты,

вытекающие из них, составляют суть прикладных исследований.

Это можно показать на следующих примерах (таблица 4).

Таблица 4. Соотношение фундаментальных и прикладных исследований

Научные исследования

| фундаментальные

| Открытие Г. Менделем единиц

I наследственности у садового гороха;

I исследования Т. Моргана и

I сотрудников с мушкой дрозофилой,

1 приведшие к всеобщему признанию

| законов Менделя.

| Вскрытие Л. Пастером причины

1 болезни шелковичных червей во

I Франции.

I Обезвреживание болезнетворных

I микробов при сохранении их

| антигенности.

I Выведение М. Фарадеем законов

I электролиза на основании изучения

1 действия электрического тока на

I водные растворы различных веществ.

| Открытие радиоактивных элементов

I Марией и Пьером Кюри.

I Формулирование проблемы

| антагонизма между микробами и ее

I экспериментальное подтверждение.

прикладные

На основании принципов Менделя -

Моргана были созданы

рациональные методы селекции в

растениеводстве и животноводстве, в

микробиологии. С помощью этих

методов были выведены новые сорта

сельскохозяйственных растений,

новые породы домашних животных,

высокопродуктивные штаммы

микроорганизмов; выявлены

наследственные болезни у человека,

определены пути и созданы методы

рациональной их профилактики и

терапии.

Разработаны и осуществлены меры

по спасению производства шелка.

Создание профилактических и

лечебных иммунопрепаратов

(вакцин, сывороток,

иммуноглобулинов).

Создание методов и приборов для

выделения веществ при электролизе,

для определения

электропроводности, для

профилактической и

терапевтической электростимуляции

при некоторых патологических

состояниях у людей и т. д.

Создание и применение

рентгеновских методов

исследования, радиотерапия раковых

заболеваний, эксплуатация атомных

электростанций и др.

Создание промышленности

антибиотиков и применение

антибиотических препаратов в

здравоохранении.

Подобного рода примеры весьма многочисленны и множество

их убедительно доказывает скорость и глубину социального про-

гресса человечества на долгом пути его эволюции. И наука здесь

выступает решающим фактором, так' как наука - это отрасль

человеческой деятельности, направленная на познание мира (ми-

роздания).

Фундаментальные исследования завершаются, как правило,

установлением или доказательством новых фактов, закономерно-

стей в соответствующей отрасли знаний. Рано или поздно эти

факты (закономерности) находят практическое воплощение. Тем

не менее, нельзя противопоставлять фундаментальные и приклад-

ные исследования, так как на определенном этапе нередко можно

видеть трансформацию их в противоположном направлении. На-

пример, на основании обобщения полученных сведений о нукле-

иновых кислотах Дж. Уотсон и Ф. Крик смогли предложить

природную модель двойной спирали ДНК и, тем самым, подвели

материальный фундамент под ранее известный якобы "мифиче-

ский" ген. На этой основе возникли многочисленные практические

разработки по молекулярной биологии гена и, в том числе, напри-

мер,

по мутагенезу. С другой стороны, практические разработки

по выделению и манипулированию с ДНК различного происхож-

дения стали основой для постулирования общегенетических зако-

нов,

присущих всему живому. Вот почему и сегодня справедливы

слова великого Л. Пастера, сказанные по этому поводу: "Нет,

тысячу раз нет, не существует ни одной категории наук, которой

можно было бы дать название прикладых наук. Существуют науки

и приложение наук, связанные между собой как плод и породившее

его дерево".

Биологическая технология - как наука является воплощением

симбиоза теоретических исследований и практической реализации

предварительно полученных фактов в работах с организованными

частицами (вирусами), клетками и тканями, с первичными и вто-

ричными метаболитами, с генетическим материалом.

Глава 3

Фундаментальные исследования

в области энзимологии

Любая клетка - целостная система, составные части которой

структурно и функционально взаимозависимы. Эта зависимость

выражается прежде всего в генетически обусловленном синтезе

белковых молекул - преимущественно ферментов.

хронологиче-

ском порядке только белки

продукты матричного синтеза должны

относиться к разряду первичных; все другие молекулы, возника-

ющие под каталитическим .действием ферментов, оказываются

вторичными. Выдающийся шведский химик И. Я. Берцелиус,

предложивший в 1836 г. термин "катализ" (за 35 лет до выявления

М. Манасеиной каталитических функций дрожжевого сока в 1871

г.),

пророчески писал: "У нас есть все основания предполагать, что

в тканях и жидкостях растений и животных происходят тысячи

каталитических процессов". И это в то время, когда ферменты еще

не были известны науке. Теперь, например, утверждается, что в

мельчайшей клетке (0,1 мкм в диаметре), относящейся к Mollicutes,

содержится более, чем 100 ферментов, то есть столько, чтобы

клетка могла самостоятельно функционировать как организм. Ес-

тественно, что в клетке других прокариот и эукариот насчитывают

более 1000 биокатализаторов. Большинство микробов лишено спе-

циализированных структур, хотя бы отдаленно напоминающих

органы дыхания, пищеварения и другие, присущих высшим эука-

риотам. Поэтому основная метаболическая нагрузка (метаболизм

- это биологический обмен веществ и энергии) в процессах их

роста, развития и размножения падает на ферменты. В любой

живой клетке находятся малые и большие (полимерные) молекулы

различных веществ. Они должны синтезироваться в клетке, а

некоторые секретироваться из нее (нередко, распадаясь перед этим

на более мелкие составные части или их производные). Во всех

таких процессах участвуют ферменты. Уже сегодня известно около

2000 индивидуальных ферментов и это не предел. В клетках

прокариот и эукариот ферменты распределены и локализованы

целесообразно, например, в цитоплазме находятся почти все фер-

менты гликолиза, в матриксе митохондрий - ферменты цикла

трикарбоновых кислот и |3-окисления жирных кислот, ферменты

окислительного фосфорилирования - во внутренней мембране

митохондрий.

В клетке E.coli нить ДНК имеет размеры

1,4»10

хЗ,0

нм, а массу

1»10"

г. В разомкнутом состоянии длина ее составит примерно 1,4

мм,

то есть подобная ДНК приблизительно в 500 раз длиннее

бактериальной клетки, вмещающей эту ДНК. Такая хромосома

кишечной палочки заключает в себя- информацию, достаточную

для кодирования 4500 белков, значительная часть которых будет

представлена ферментами.

Ферменты составляют основную массу клеточных белков. На

долю одного фермента приходится от сотых долей процента (у

некоторых вирусов) до 10-12%

(у

ряда микроорганизмов клеточной

организации, например у E.coli). В то же время хромосомная ДНК

не есть простая последовательность множества генов. Поэтому

нельзя считать, что количество хромосомной ДНК, например у

представителей эукариотических организмов пропорционально

уровню их эволюционного развития. В таком случае некоторые

лягушки и рыбы были бы развиты более, чем животные и человек,

поскольку у них размер генома достигает 10

-10" пар нуклеотидов

(пн),

а у млекопитающих и человека он на 1 - 2 порядка ниже (10

- 10

пн). Суть здесь в том, что у высокоразвитых существ

значительная часть ДНК оказываетсяя молчащей, так как она

образована не генными последовательностями (у человека к этому

типу относится 80 - 90% всей ДНК) или повторяющимися огромное

число раз идентичными последовательностями. Все это не может

не сказываться на ферментном наборе в клетках, органах и тканях,

равно как и на их функциональной активности.

Ферменты давно являются объектами биотехнологии - их ин-

дустрия зародилась в начале XX в., и объемы ферментного произ-

водства продолжают нарастать, а что касается публикаций о био-

катализаторах, то в мире появляется более 10 000 статей ежегодно.

Ферменты присущи любой живой клетке и, в небольшом ассорти-

менте - организованным частицам (вирусами). Наука, изучающая

ферменты, называется энзимологией, а инженерная энзимология

- это ветвь или субдисциплина биологической технологии, изуча-

ющая биотехнологические процессы, в которых используется ка-

талитическое действие ферментов. Главная задача инженерной

энзимологии заключается в практической реализации фермента-

тивных процессов в целях экономичного получения различных

веществ и энергии для нужд народного хозяйства.

Чтобы выйти на уровень инженерной энзимологии, необходи-

мо решать многие основополагающие проблемы и задачи, к кото-

рым можно отнести:

1) способы выделения и очистки ферментов в зависимости от

их топологии в биообъекте или при выделении в среду обитания;

2) определение состава и строения фермента;

3) особенности кинетики ферментативного действия в зависи-

мости от внешних условий;

4) оценку активности ферментов в зависимости от их чистоты

или, напротив, от наличия естественных примесей или искусствен-

ных добавок;

5) механизмы и пути регуляции синтеза и активности фермен-

тов;

6) моделирование действия ферментов в иммобилизованном

состоянии, учитывая при этом иммобилизацию индивидуальных

ферментов и полиферментных систем, каковыми являются живые

клетки;

7) аппаратурное оформление ферментативных процессов;

8) экономичность ферментативных процессов, рекомендуемых

к внедрению в производство.

Некоторые из этих проблем и задач будут рассмотрены в

данном разделе, другие (6-8) - во второй части учебника.

Распределение ферментов в клеточных структурах неравноз-

начное, и независимо от того, что биосинтез их осуществляется в

элементах ядерного аппарата, часть ферментов секретируется

внеклеточно - преимущественно гидролазы. Это обусловлено не-

обходимостью расщепления полимерных веществ до такого уров-

ня,

чтобы продукты гидролиза могли поступить в клетку для

конструктивного и/или энергетического обменов.

К ферментам внеклеточного типа можно отнести микробные

амилазы, липазы и пешид-гидролазы, катализирующие реакции

гидролиза соответственно крахмала, жиров и белков. Животная

протеаза (пепсин) условно также может быть причислена в разряд

внеклеточных, так как она поступает из соответствующих клеток

(главных клеток слизистой оболочки желудка) в полость желудка;

то же можно сказать и о ферментах поджелудочной железы,

поступающих в просвет двенадцатиперстной кишки.

Следует иметь в виду, что многие ферменты синтезируемые в

клетках, являются зимогенами, или неактивными

ферментами, и для трансформации их в активные формы необхо-

дим ограниченный (специфический) посттрансляционный проте-

олиз.

В любом случае получение экзо- и эндоферментов на опреде-

ленных этапах как бы унифицируется, когда все стадии выделения

и очистки будут определяться лишь их физико-химическими ха-

рактеристиками. Так, при выделении экзофермента клетки проду-

цента становятся отходом, а культуральная жидкость или, в другом

случае, желудочный сок - целевым продуктом-сырцом. Если речь

идет о необходимости получения эндоферментов, то содержащие

их клетки и ткани измельчают (дезинтегрируют) и экстрагируют

подходящим растворителем. Полученный раствор также представ-

ляет собой полупродукт — сырец. И если речь здесь идет об одном

и том же ферменте,- но разного происхождения и топологии (экзо-

и эндо-), то, начиная с сырца, технологические схемы их выделения

будут во многом тождественными. В этом случае можно использо-

вать такие подходы, как высаливание, сепарирование в градиентах

плотности каких-либо веществ, мембранную фильтрацию,- гель-

хроматографию, афинную хроматографию, ионный обмен и дру-

гие.

При необходимости выделют ферменты, локализованные в

каких-либо структурах

клетки.

Тогда, с учетом физико-химических

характеристик таких структур (размер, плотность, форма), приме-

няют дифференциальное центрифугирование после дезинтегра-

ции клеток (тканей). При этом сферические частицы различной

плотности и/или размера будут перемещаться в центрифужной

пробирке на одно и то же расстояние за разное время. Время

прохождения частицы из одного положения (п) в другое (гг) можно

определить, исходя из следующего уравнения:

. 9 л

£2

2 0)

(рр-р,)

П •

где t — время, т| — вязкость центрифугируемой жидкости, ш

—

угловая скорость,

R —

радиус частицы, рр — плотность частицы,

р/

— плотность центрифугируемой жидкости,

— коэффициент

силы тяжести.

Форма выделяемых частиц не всегда сферическая, и тогда в

используемые методы вносят необходимые поправки, или выбира-

ют какие-либо другие способы изоляции и расчета. Ферменты —

глобулярные белки, поэтому при их разделении играют роль, в

основном, молекулярные массы (ММ) молекул, а не число субъ-

единиц (С) в них.

качестве примера можно назвать химотрипсин

(ММ

= 24500 Да, С =

3),

щелочную фосфатазу (ММ = 80000 Да,

С =

2),

лактатдегидрогеназу (ММ = 140000 Да, С =

А),

триптофаназу

(ММ

= 220000 Да,С =

8),

и др. Более того, известны ферменты,

катализирующие одну и ту же реакцию в организме одного вида,

но представляющие собой различные молекулярные формы. Их

называют изоферментами, выделение которых по высказанным

причинам заметно осложняется.

Большие по размеру компоненты (интактные клетки, неразру-^

шенные частицы ткани, ядра) осаждаются при дифференциальном

центрифугировании быстрее — их собирают в осадок при срав-

нительно невысоких скоростях; супернатант (от. лат. supernatans

— всплывающий), или надосадок подвергают последующему цен-

трифугированию при более высоких скоростях. При этом в осадке

могут быть митохондрии. В случае дальнейшего центрифугирова-

ния при еще более высоких скоростях вращения ротора центри-

фуги можно собрать рибосомы.

Во время вращения ротора с большой угловой скоростью со

развивается центробежное ускорение (G), во много раз превосхо-

дящее силу тяжести и способное достигать величин 600—600000 g

(g = ускорение силы тяжести). G = со

г (г — расстояние, пройден-

ное частицей). Так, для выделения ядер из дезинтеграта эукарио-

тических клеток требуется 10 минут центрифугирования при 600

д,

для изоляции лизосом и митохондрий — 5 мин. при 15000 д, для

выделения рибосом — 1 час при 100000 д. Скорость продвижения

частицы в направлении г (Vr) описывается уравнением

Vr = -т- (t — время)

Центрифугирование дезинтеграта клеток или тканей при боль-

ших скоростях в водной суспензии представляет собой турбулен-

тный поток и сила сопротивления движению различных частиц

("твердых тел") определяется не вязкостью жидкости (т|), а ее

плотностью (р), тогда сила сопротивления называется гидравличе-

ской и описывается формулой F = C/Spv

, где F — гидравлическая

сила сопротивления, Cf — коэффициент, зависимый от формы

твердого тела, S — площадь поперечного сечения тела. Для сфери-

ческого тела значения Cf находятся в интервале 0,05 — 0,2 в

зависимости от характера поверхности (гладкая, шероховатая); для

тонкого диска, перпендикулярного потоку, Cf равна примерно 0,55.

Относительная роль динамического сопротивления и вязкого

трения сказывается на поведении движущейся жидкости и харак-

теризуется безразмерным числом Рейнольдса:

T|iv Т|

где

— характерный линейный размер. При обтекании тел

—

это длина или поперечный размер, при течении в длинных трубках

1 — это диаметр трубки. В условиях центрифугирования скорости

частиц и, следовательно, их числа Рейнольдса очень малы. Поэтому

для определения силы сопротивления среды, действующей на

частицу, пользуются законом Стокса. Согласно этому закону сила

сопротивления, испытываемая твердым шаром при его медленном

поступательном движении в неограниченно вязкой жидкости,

описывается выражением F = 67rnRv, где R — радиус шара, т|

—коэффициент вязкости жидкости, v — скорость движения шара.

Параметры движения частицы можно вычислить по следующе-

му уравнению, исключив из него коэффициент силы тяжести,

поскольку направление г перпендикулярно направлению силы

тяжести:

6m\RV

=^j- G(pp-p/),

где V

скорость частицы в направлении г, G — центробежное

ускорение, рр — плотность частицы, р/

-—

плотность жидкости, Т|

— вязкость жидкости, R — радиус частицы.

При подходе к выбору биообъекта—продуцента того или иного

энзима важно иметь хорошую (по скорости роста, продуктивности

и активности фермента) культуру — штамм (не клон), так как

поддерживать его в лабораторных и производственных условиях

легче, чем клон. К тому же клоновые культуры используют, как

правило, для генетических целей.

Необходимо иметь в виду и такие факты, как полифермент-

ность культуральных жидкостей или тканевых экстрактов, из

которых предстоит выделить те или иные ферменты в индивиду-

альном виде. Это особенно относится к гликансинтетазам и глика-

назам, что является своеобразным отражением разветвленности

углеводных полимеров (участие в синтезе более, чем одной синте-

тазы) и их полидисперсности (опосредованность действия генети-

ческого кода на процесс синтеза полисахарида во время роста и

развития культуры клеток или ткани, то есть здесь имеет место

нематричный синтез углеводного полимера). В таких случаях це-

лесообразно применить афинную хроматографию (от англ. affinity

— сродство).

Афинная хроматография основана на специфичности биомо-

лекул. Принципиально этим методом возможно получение абсо-

лютно чистых веществ. В нативном состоянии ферменты за счет

своего активного центра и регуляторного участка (одного или

более) взаимодействуют с небольшим числом лигандов, которые

представляют собой субстраты, либо эффекторы. Благодаря высо-

кому сродству активного участка фермента к лиганду, их обрати-

мому связыванию и отсутствию какой-либо другой реакции между

лигандом и матрицей возможно эффективное проведение афинной

хроматографии.

В качестве лиганда обычно используют конкурентный обрати-

мый ингибитор (см.), его ковалентно сшивают с соответствующей

нерастворимой матрицей так, чтобы он не терял своей способности

связываться с ферментом. Матрицей с лигандом в соответствую-

щем буферном растворе заполняют колонку, а затем через нее

пропускают раствор фермента, подлежащий очистке. В колонке

задерживается лишь специфический фермент, а все другие при-

меси уходят. После этого проводят элюцию специфического фер-

мента, используя раствор субстрата в среде с другим рН и (или)

ионной силой. При разделении ферментов методом афинной хро-

матографии необходимо знать все кинетические параметры целе-

вого фермента, располагать хорошей матрицей и удачно подобран-

ным лигандом. В качестве примера приводим схему путей сшива-

ния лиганда с одной из возможных гидроксильных групп полиса-

харида агарозы

(или

сефарозы) через удлиняющие мостики,

на-

пример диаминов типа H2N(CH2)

NH2 (х =

— 6)

е-аминокапро-

новой кислоты:

н,с—сн—сн,—сн,

| 2 2

£•

-аминокапроновая кислота

агарозная матрица

ОН

"I—

он

-|—

он

-|—

он

,CNBryR(CH

).NH

^*" бромциан

C=NH

(сн

)

производные

изомочееины

Br/NHj(CH

)

янтарный ангидрид/СО (NH2^2

ЛИГАНД

Хорошей матрицей для афинной хроматографии является три-

сакрил марки GF 2000 (Франция), получаемый сополимеризациеи

Ы-акрилоил-2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиола

гидро-

ксилированного акрилового бифункционального мономера.

Три-