Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

сакрил — высоко гидрофильный сополимер за счет вторичных

амидных и первичных гидроксиметильных групп. Последние на-

ходятся на поверхности молекулы, тогда как полиэтиленовый кор

(от англ. core — сердцевина) полностью скрыт внутри.

сн,он сн

он

I I

HN—С—СН

ОН НМ—с—СН

ОН

со сн,он

с0

сн

он

—сн—сно—сн—сн,—си —

сн

—сн

—

2 | 2 2,2

СО СО

j сн

он J сн

он

HN—С—СНоОН HN—С—СНоОН

сн

он сн

он

трисакрип GF2000

Н-н

H-0-C-R

"\N-3-23X

гн.лн

БЭ/'^ ГА \

Aar

JT^-NH-CO-R

^-O-NH-c-CHjOH » l-c-NHCC^-NHj

CHjOH

трисакркп GF2000 амииопроизаодное

трисакрипа GF20OO

Рис.

8. Получение некоторых сорбентов для афинной хроматографии на основе

трисакрила GF 2000 (КДА — карбонилдиимидазол, НФХФ — нитрофенилхлоро-

формиат, БЭ

•—

бисэпоксироны, ГА

—

глутаральдегид, N-3-23X

—

N-этоксикарбо-

нил

-2-ЭТОКСИ-1,

2-дигидрохинолин, АЯК — ангидрид янтарной кислоты).

Трисакрил стабилен при разных температурах — до 121°С и

при рН1— 11, равно как устойчив к диссоциирующим агентам и

поверхностно-активным веществам.

целях использования его для

афинной хроматографии проводят активацию такими веществами,

как глутаральдегид, эпихлоргидрин, дивинилсульфон, р-нитрофе-

нил-хлороформиат, карбонилдиимидазол, этилендиаминидр.

(рис.

8).

Активированный трисакрил используют затем для сшивания

лигандом.

качестве примера можно привести иммобилизацию

лиганда

на

трисакриле, активированном глутаральдегидом (рис.

9).

сно

^-C-NH-CH-CH-fCH^-CH^HCH^-CHO

+•

N-

ЛИГАНД

(сн

2'3

СНО

сно сно

I I

-C-NH-CH-CH-JCHJ^-CH-CH-ICHJ^-CHO

I ,

(сн

)

сно

ЛИГАНД

Рис.

Схема иммобилизации лиганда

трисакрилом, активированным глутараль-

дегидом.

В любом случае выделение

очистка ферментов

— это

наука,

граничащая

искусством. В самом деле, если химическая реакция

протекает

выходом

0,1%

и с

сотней побочных продуктов,

то

вряд

ли химик-органик проявит интерес

процессу получения

(и, тем

более, очистки) целевого продукта. Но именно такие задачи встают

перед биотехнологами, желающими получить индивидуальный

бе-

лок.

работе

биологическим материалом необходимы

важны

знания предварительных характеристик

по

содержанию белка

различных биообъектах (даже

органах

тканях одного

того

же

вида животного).

От

этого зависит выбор материала,

его

предва-

рительная подготовка

для

включения

технологический процесс.

Молекулы ферментов чувствительны

различным воздействи-

ям,

поэтому

при их

выделении

очистке требуется соблюдать

необходимые меры предосторожности: контролировать темпера-

туру (нередко поддерживать

ее

близкой

точке замерзания

ис-

пользуемого растворителя),

рН

(как правило —

помощью буфер-

ных растворов), концентрацию белка, ионную силу раствора,

концентрацию ионов тяжелых металлов (удаляют

их с

помощью

комплексообразователей, например ЭДТА), значение окислитель-

но-восстановительного потенциала (Ео), который должен поддер-

живаться

на

низком уровне (например,

помощью меркаптоэта-

нола).

Следует иметь

виду

и тот

факт,

что

многие белки

разбавленных растворах проявляют склонность

денатурации —

устойчивость возрастает

присутствии

их

субстратов.

Из вспомогательных приемов очистки ферментов часто поль-

зуются диализом, лиофилизацией, пропусканием растворов через

соответствующие молекулярные сита (гелевые, мембранные).

качестве примера очистки гипотетического фермента приведена

таблица

5. Из

данных

таблице обращают

на

себя внимание

сокращение объемов раствора, содержащего целевой продукт

(в

200

раз),

уменьшение содержания белка

в 5 раз при

заметном

возрастании активности фермента

в 100 раз (в

расчете

на 1 мг

белка).

Таблица 5. Сравнительная характеристика методов очистки фермента "X"

Стадии очистки

Экстракт белков

сырец

Высаливание

аммония

сульфатом

Хроматография

на

Д ЭАЭ-целлюло зе

Препаративный

электрофорез

Изо электрическое

осаждение

Кристаллизация

Объем

раствора,

200

Содер-

жание

белка,

мг/мл

2,5

1,25

1,0

0,3

0,5

Активность

Ед/мл

100

200

500

1500

2000

5000

удель-

ная,

Ед/мг

белка

100

160

500

1500

6700

10000

Сум-

марный

выход,

100

37,5

Сте-

пень

(крат-

ность)

очист-

ки

12,5

37,5

167

250

Суммарный выход достаточно высокий, а степень очистки

превосходная - в 250 раз. Но такие показатели далеко не типичны

для разных ферментов.

В качестве критериев чистоты ферментов используют данные

электрофореза, ультрацентрифугирования (седиментограмма), оп-

ределения молекулярной массы различными методами, по раство-

римости (кривые растворения), оценки полидисперсности с опре-

делением специфической активности каждой фракции, хроматог-

рафирования на различных носителях и в нескольких системах,

аминокислотного состава (особенно

—

при обнаружении белковых

примесей), включая секвенирование (от англ. sequence — после-

довательность) на автоматизированных приборах - секвенаторах,

и т. д.

В последние годы продолжает расти интерес к внеклеточным

ферментам микроорганизмов, поскольку микробы — продуценты

относительно легко культивируются

в.

контролируемых условиях

и подвергаются направленному изменению в сторону получения

высокопродуктивных вариантов.

У грамположитёльных бактерий экзоферменты топологически

могут быть строго внеклеточными (многие протеазы, гликозидазы

и др.) и локализованными с наружной стороны клеточной мемб-

раны, например, ос-глюкозидаза у Вас. licheniformis (это можно

доказать при протопластировании клеток, когда ферменты пере-

ходят в окружающую среду после удаления клеточной стенки).

Грибы в отношении секреции экзоферментов уподобляют грам-

положительным бактериям. У грамотрицательных бактерий экзо-

ферменты дополнительно могут находиться в периплазматическом

пространстве. Казалось бы, что такие ферменты должны рассмат-

риваться внутриклеточными, однако они достаточно легко осво-

бождаются при осмотическом шоке или в результате протоп-

ластирования клеток.

Строго внеклеточных ферментов у грамположитёльных бакте-

рий больше, чем у грамотрицательных, однако среди последних

имеются выраженные продуценты их (аэромонасы, псевдомонасы,

некоторые энтеробактерии и др.).

Каким же образом секретируемые белки транспортируются

через структуры клеточной оболочки?

В конце 70-х годов XX в. была предложена так называемая

сигнальная гипотеза

(Г.

Блобели

др.,

1979). Согласно этой гипотезе

секретируемый белок через ЫН2-конец удлиняется на 15—30

аминокислот, вкупе составляющих лидерный, или сигна-

льный пептид, направляющий рибосому, из которой он

появляется, к мембране. В мембране лидерный пептид вместе с

другими мембранными белками формирует канал, стабилизирую-

щийся при присоединении рибосомы. Рибосома синтезирует бе-

лок, и он тут же экспортируется через пору. Этот механизм

называется котрансляционной секрецией. После частичного или

полного экспорта белка сигнальный пептид удаляется с помощью

специфической сигнальной эндопептидазы. Решающую роль в

секреции играет гидрофобная центральная часть сигнальной по-

следовательности размером около 5,5 нм (от

до 19 аминокислот)

и находящаяся в высокоупорядоченной конформации. 1ЧН2-Конец

в составе гидрофильного домена (от англ. domain — регион,

область) присоединяется к отрицательно заряженной внутренней

поверхности цитоплазматической мембраны. В ходе трансляции

белка гидрофобный участок сигнальной последовательности по-

степенно внедряется в мембрану до появления участка расщепле-

ния в форме петли на ее внешней стороне. После этого сигнальная

эндопептидаза отщепляет сигнальную последовательность от рас-

тущей цепи полипептида, способствуя тем самым котрансляцион-

ной секреции белка (рис. 10).

К настоящему времени доказано, что котрансляционная секре-

ция присуща прокариотам и эукариотам. Таким путем секретиру-

ются, например, а-амилаза у Bac.subtilis, Р-лактамаза у

Bac.licheniformis, экзотоксин у Corynebacterium diphtheriae.

После завершения котрансляционного транспорта рецептор-

ные белки мембраны освобождаются и могут функционировать в

плоскости мембраны.

У прокариот и эукариот имеется также другой тип секреции

—посттрансляционный, когда через мембрану транспортируется

завершенный белок. Механизм транспорта объясняется либо с

привлечением триггерной гипотезы У. Уикнера (1979), либо ранее

рассмотренной сигнальной гипотезы (рис. 11). Согласно обеим

гипотезам роль белка

предшественника, обладающего сигнальной

последовательностью, весьма велика. В первом случае эта после-

довательность обеспечивает скручивание полипептида так, что

гидрофобные области его связываются с мембраной. Затем белок

может освобождаться из мембраны благодаря отделению сигналь-

11 23 45641247878 779 8110 711717

сд

(7Ъ

WWTOW

Рис.

10. А - экспорт белка через мембрану путем котрансляционной секреции

(1 —рибосомы, 2 — мембрана, 3 — пора в мембране, 4 — сигнальная последо-

вательность, 5 — сигнальный пептид, 6 — рецептор сигнального пептида, 7 —

сайт действия сигнальной эндопептидазы, 8 — рецептор рибосомы); Б —

строение сигнального пептида белка lam В Escherichia coli (A — гидрофильный

сегмент, Б — гидрофобный сегмент, р-сайт расщепления; последовательность

а лнокислот: 1—метионин, 2 — изолейцин, 3 — треонин, 4 — лейцин, 5 —

аргинин, 6 — лизин, 7 — аланин, 8 — валин, 9 — глицин, 10 — серии, 11 —

глутамин, 12 — пролин); С — секреция белка через мембрану (М) по типу петли

(1 — NH2 - конец, 2 — гидрофобный участок, СП — сигнальная пептидаза).

-Q---3-

Рис.

11. Схема посттрансляционного

транспорта белков через мембрану со-

гласно "триггерной гипотезе" по Уикне-

ру (1979) — I и "сигнальной гипотезе" по

Блобелу и др. (1979) — И.

нои последовательности за счет 5'^

эндопротеолиза. Во втором слу- j

чае сигнальная последователь-

ность полной полипептидной це-

пи вместе с рецепторными бел-

ками мембраны формирует по-

ры.

Белок развертывается и про-

исходит перемещение (трансло-

кация), сопровождаемая удале-

нием сигнальной последователь-

ности.

Для эукариот доказано, что

их эндоплазматический ретику-

лум содержит для работающей

рибосомы своеобразные "при-

чальные белки", к которым при-

соединяется комплекс рибосомы

с частицей, узнающей сигналь-

ную последовательность. Частица включает шесть полипептидных

цепей и небольшую молекулу РНК с константой седиментации 7S.

Причаливание рибосомы с частицей индуцирует трансляцию при

последующей секреции растущего белка (рис. 12) до момента

появления сигнального пептида из рибосомы, когда происходит

блокада трансляции.

На основе рассмотренной

"сигнальной гипотезы" мож-

но сформулировать следую-

щие основные положения:

1) процесс экспорта бел-

ков эволюционно консерва-

тивен (прокариотические

клетки узнают сигнальную

последовательность эукариот

и наоборот);

2) в мембране существует

некий механизм экспорта,

или аппарат секреции;

3) свободные рибосомы в

цитоплазме клетки и рибосомы, связанные с мембраной, не раз-

личаются между собой;

I П

Рис.

12. Начальные этапы векторного пере-

носа белков в эукариотических клетках: I

—

блокирование трансляции,

II —

снятие блока

трансляции после "причаливания" рибосомы

— 1, сигнальная последовательность — 2;

частица, узнающая сигнал — 3, "причаль-

ный" белок — 4, мембрана — 5, сигнальный

пептид — 6.

4) у эукариот на эндоплазматическом ретикулуме имеются так

называемые причальные белки для функционирующих рибосом,

соединенных с частицами, узнающими сигнальную последователь-

ность;

5) секретируемые белки синтезируются обычно в форме более

длинного предшественника;

6) белки, как правило, секретируются котрансляционно (реже

— посттрансляционно), то есть растущий полипептид переносится

через мембрану по мере трансляции;

7) в структуре подлежащего секреции белка может существо-

вать "стоп"-последовательность, останавливающая секрецию и да-

ющая начало интегральному мембранному белку.

Следует вспомнить, что молекулярные массы (ММ) ферментов

достаточно большие и находятся в пределах примерно от 12 до

нескольких тысяч килодальтон (кДа). Ферменты с ММ более 100

кДа обычно представлены субъединицами (двумя и более).

Нелегко себе вообразить, например, что кишечная палочка,

размножающаяся в течение 20—30 минут, реализует множество

направленных и строго избирательных биокаталитических процес-

сов.

Прямыми и косвенными доказательствами в опытах с фер-

ментом трансаминазой аспарагиновой кислоты установлено, что

отдельные стадии каталитической реакции протекают в простран-

стве около нескольких сотен кубических миллимикрометров (нм)

за время от десятитысячных до миллионных долей секунды.

Для того, чтобы управлять действием ферментов, необходимы

фундаментальные исследования по расшифровке молекулярных

основ ферментативного катализа. Многое уже сделано в данном

направлении, но это лишь начало, а желательно знать как можно

больше о всех группах ферментов.

Согласно классификации (КФ) ферменты подразделяются на

шесть главных классов, каждый из которых включает подклассы

и подподклассы:

I. Оксидоредуктазы (КФ1.) — катализируют окислительно

вос-

становительные реакции;

II.

Трансферазы (КФ2.) — катализируют реакции переноса

функциональных групп (фосфатных, ацильных, гликозильных, аль-

дегидных и др.);

III.

Гидролазы (КФЗ.) — катализируют реакции гидролиза

(перенос функциональных групп на молекулу воды);

IV. Лиазы (КФ4.) — катализируют реакции присоединения по

двойным связям и обратные реакции;

V. Изомеразы (КФ5.) — катализируют реакции изомеризации,

то есть перенос групп внутри молекулы с образованием изомерных

форм;

VI.

Лигазы (КФ6.)

—

катализируют реакции образования связей

С — С, С — S, С — ОиС — N, сопряженных с расходованием

энергии АТФ или других нуклеозидтрифосфатов.

Подкласс и подподкласс ферментов соответственно обозначают

вторым и третьим числами; порядковый номер фермента - четвер-

тым числом в его подподклассе. Например, бетаин-гомоцистеин-

метилтрансфераза имеет кодовый номер (шифр) — КФ 2.1.1.5, то

есть согласно классификации (КФ) этот фермент относится к

трансферазам (И-й главный класс), переносящим одноуглеродные

остатки (первый подкласс) в форме метила — метилтрансферазы

(первый подподкласс), номер конкретного фермента 5 (бетаин:

L-гомоцистеин S-метилтрансфераза), катализируемая реакция

здесь следующая:

соог

сн,—SH

соон

сн,—s—сн,

I . I *-. I Г

CH2-N

==(CH3)

+ CHj """"""Ч CH2-N = (CH3) + 0¾

. НС—NH, CH-NKj

6етаин

I диметипгпицин I

соон соон

L-гомоцистеин L- метионим

Классификация и номенклатура ферментов имеют универсаль-

ное значение, то есть они распространены на все ферменты,

независимо от источника их получения.

Со времени выделения Дж. Б. Самнером в 1926 г. уреазы в

кристаллическом виде несомненно признавалось, что все фермен-

ты—

это простые или сложные белки. В 1981—1982 гг. Т. Р. Чех

с сотрудниками открыл каталитическую активность у рибонукле-

иновой кислоты. Этим опровергается универсальность принципа

"фермент

—

это белок", а кроме того привносятся новые концепции

в ранние этапы эволюции живой материи. Некоторые исследова-

тели (Дж. Дарнелл-младший) считают, что первым веществом

наследственности была РНК, а не ДНК, поскольку ей присуща

большая функциональная универсальность — она способна хра-

нить информацию, воспроизводиться, направлять синтез белка и

вести себя как фермент. Вместе с тем следует оговориться, что

диапазон реакций, катализируемых РНК, еще недостаточно велик,

чтобы указанное выше опровержение принималось сегодня в

"конкурентный расчет".

В отличие от небиологических катализаторов ферменты —

высоко специфичны, они имеют активные центры, многие из них

проявляют свою активность в присутствии коферментов (коэнзи-

мов) небелковой природы, то есть в таких случаях ферменты

являются сложными белками. К сожалению, до сих пор нет

достаточной четкости в определениях коферментов и кофакторов.

Одни авторы отождествляют эти понятия, другие используют лишь

один термин — коферменты, третьи выделяют ионы некоторых

металлов в разряд активаторов, прямо не связывая их с кофермен-

тами, и т. д. Накопленный фактический материал служит веским

основанием подразделять белки-ферменты на две группы — про-

стые ферментные белки и сложные ферментные белки, из которых

сложные содержат в своем составе неорганические и/или органи-

ческие небелковые структуры — коферменты. Коферменты могут

обратимо или необратимо (простетические группы) связываться с

белковой частью — апоферментом. Полный ферментный комплекс

называют холоферментом. Если же действие некоторых фермен-

тов лишь активируется неорганическими ионами или атомами

металлов и не снимается полностью в их отсутствии, то такие

активаторы следует называть кофакторами.

Функции контакта с субстратом и катализа у простых фермен-

тных белков выполняют боковые радикалы аминокислот в пол-

ипептидной молекуле; в сложных ферментных белках эти функции

выполняют преимущественно коферменты.

Коферменты классифицируют по каталитическим и структур-

но-функциональным признакам. Например, коферментами окси-

до-редуктаз являются: НАД, НАДФ, ФАД, ФМН, липоевая кислота

и др.; коферментами трансфераз-пантотенат, УДФ-глюкоза, ЦДФ-

холин, тетрагидрофолиевая кислота и др. Ряд коферментов явля-

ются производными витаминов: тиамина (декарбоксилазы ос-кето-

кислот, транскетолазы), рибофлавина (ФМН, ФАД), пантотеновой

кислоты (кофермент

А),

никотинамида (НАД, НАДФ) и т. д. Отсюда