Дромашко С.Е., Квитко О.В., Конева И.И. и др. Компьютерная видеомикроскопия живых клеток

Подождите немного. Документ загружается.

ГУО «Институт подготовки научных кадров

Национальной академии наук Беларуси»

Кафедра естественно-научных дисциплин

КОМПЬЮТЕРНАЯ ВИДЕОМИКРОСКОПИЯ

ЖИВЫХ КЛЕТОК

Учебно-методическое пособие

Минск

ИПНК

2010

УДК [576.535+004.9]:[61+636.2+615]

ББК 28.705я73

К63

Рекомендовано к опубликованию Ученым советом

Института подготовки научных кадров НАН Беларуси

протокол № 10 от 30.10.2009 г.

Рецензенты:

доктор биологических наук, доцент,

заведующий лабораторией ГНУ «Институт генетики

и цитологии НАН Беларуси» А. П. Ермишин,

кандидат биологических наук, доцент кафедры генетики

УО «Белорусский государственный университет» С. В. Глушен

Авторы:

С. Е. Дромашко, О. В. Квитко, И. И. Конева, Я. И. Шейко,

М. В. Анисович, Г. Н. Белова

К63 Компьютерная видеомикроскопия живых клеток : учеб.-метод. посо-

бие / С. Е. Дромашко [и др.]. – Минск : ИПНК, 2010. – 37 с. : ил.

ISBN 978-985-6820-28-4.

В пособии дано подробное описание метода и возможностей долговремен-

ной компьютерной видеомикроскопии живых клеточных культур. Приводятся

примеры исследования таких фундаментальных биологических процессов, как

дифференцировка клеток, клеточное старение и раковая трансформация. Дается

представление об использовании метода для разработки клеточных технологий в

медицине, сельском хозяйстве и охране окружающей среды. Закреплению зна-

ний способствуют контрольные вопросы по проверке уровня усвоения материа-

ла и задания для самоподготовки.

Пособие ориентировано на магистрантов, аспирантов, соискателей и сту-

дентов, изучающих проблемы современной биологии.

УДК [576.535+004.9]:[61+636.2+615]

ББК 28.705я73

ISBN 978-985-6820-28-4 © Коллектив авторов, 2010

НАН Беларуси», 2010

Оглавление

Введение…………………………………………………………..……

Фундаментальные аспекты долговременного наблюдения живых

клеточных культур………………………………………………..…….

1.1

Компьютерная видеомикроскопия живых клеточных культур – со-

временный метод биологических исследований ...…..………………

1.2

Клеточное старение и раковая трансформация ……..………………..

1.3

Немитотическое образование трансформированных клеток………..

1.4

Компьютерная видеомикроскопия иммортализированных линий

клеток……………………………………………………………………

1.5

Молекулярные маркеры клеточного старения………………………..

Контрольные вопросы……………………….…………………………

Примеры прикладного использования компьютерной видеомикро-

скопии живых клеточных культур……………………...……………..

2.1

Медицинская трансплантология …...…………………...……………..

2.2

Клеточные технологии для животноводства………………………….

2.3

Токсикологическое тестирование веществ, поступающих в окру-

жающую среду.……………………..……………..................................

Контрольные вопросы……………………….…………………………

Задания для самоподготовки…………………………….…………….

Словарь основных терминов и понятий………………………………

Литература………………………………………………………………

ВВЕДЕНИЕ

Курс «Современные проблемы биологии» призван обеспечить специ-

альную подготовку в области биологии студентов магистратуры как второй

ступени высшего профессионального образования.

Основные его задачи: расширить профессиональный кругозор будущих

специалистов высшей квалификации в предметной области биологических

наук; ознакомить студентов магистратуры с наиболее актуальными направле-

ниями современных биологических исследований и их прикладными аспек-

тами; углубить специальные знания магистрантов по наиболее актуальным

вопросам современной биологии.

В настоящем учебно-методическом пособии представлены материалы

по компьютерной видеомикроскопии живых клеточных культур. Пособие да-

ет обширную информацию по использованию данного метода, позволяющую

углубить специальные знания магистрантов при изучении разделов «Генети-

ка, физиология и медицинская биология» и «Прикладные аспекты биологии и

биотехнология».

В пособии использованы результаты исследований сотрудников лабо-

ратории моделирования генетических процессов ГНУ «Институт генетики и

цитологии НАН Беларуси», в частности материалы кандидатской диссерта-

ции Я.И.Шейко «Генетически детерминированные изменения фенотипа кле-

ток млекопитающих в стареющих и иммортализированных клеточных попу-

ляциях» (научный руководитель – ведущий научный сотрудник, кандидат

биологических наук О.В.Квитко), а также результаты экспериментов, постав-

ленных ведущим научным сотрудником, кандидатом биологических наук

И.И.Коневой с участием других сотрудников лаборатории.

1 ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ ДОЛГОВРЕМЕННОГО

НАБЛЮДЕНИЯ ЖИВЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

1.1 Компьютерная видеомикроскопия живых клеточных культур –

современный метод биологических исследований

Компьютерная видеомикроскопия живых клеточных культур является

перспективным современным методом исследования таких фундаментальных

биологических процессов, как клеточное старение, дифференцировка и рако-

вая трансформация. Кроме того, выполняемый с помощью этого метода де-

тальный анализ процессов пролиферации, дифференцировки и гибели от-

дельных клеток и их клонового потомства важен для разработки клеточных

технологий в медицинской трансплантологии, сельском хозяйстве и охране

окружающей среды.

В сети Интернет, на поисковике GOOGLE, можно найти около 14900

ссылок на работы с использованием видеомикроскопии живых клеток. По-

давляющее большинство таких работ связано с конфокальной микроскопией.

Впервые концепция этого метода была разработана в середине 1950-х гг. ас-

пирантом Гарвардского университета Марвином Мински (Marvin Minsky). Но

широкий интерес к этой области проявился лишь в 80-х гг. благодаря бурно-

му развитию компьютерной и лазерной технологий. В отличие от классиче-

ского оптического микроскопа, создающего плоское изображение чаще всего

трехмерного образца, конфокальный микроскоп в каждый определенный мо-

мент времени регистрирует изображение только одного горизонтального се-

чения объекта. Выстраивание полноценного изображения достигается путем

последовательного сканирования (движения образца или оптической систе-

мы) всей поверхности образца. Результаты сканирования поверхности пере-

даются в компьютер, который формирует изображение и выводит его на эк-

ран монитора. Мощное программное обеспечение позволяет не только оциф-

ровать объект в системе X-Y-Z координат, но сразу визуализировать его как

3D-объект. При этом цифровая модель объекта может быть сохранена и задо-

кументирована на компьютере и в дальнейшем вызвана для обработки или

сравнения. Скорость получения информации об объекте составляет несколько

секунд. Подробнее об этом методе можно прочитать в статье Г.И.Штейна

(Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург) «Конфокальная микроскопия:

мифы и реальность» на специализированном сайте, посвященном данной те-

матике (http://www.confocal.ru/SteinText.htm).

Однако используемые в конфокальной микроскопии люминесцентные

красители не позволяют проводить длительное (многодневное) исследование

клеточных культур. Нами разработан высокоэффективный метод витального

анализа эффектов внешних факторов на культивируемые клетки человека и

животных, основанный на учете событий в клеточной популяции клеток на

одних и тех же участках клеточной культуры, причем для получения деталь-

ной информации о процессах в популяциях клеток используется непрерывная

круглосуточная компьютерная видеозапись в течение ряда дней (рисунки 1 и

2).

Непрерывная продолжительная (ежесуточная и многодневная) видеоза-

пись живых клеточных культур выполняется с помощью инвертированного

микроскопа и видеокамеры, соединенной с компьютером. В инвертированном

микроскопе в отличие от обычного (который используется для изучения

«мертвых» фиксированных цитологических препаратов) объектив располо-

жен не с верху, а с низу объекта. Это позволяет визуализировать клетки, ко-

торые растут на дне культурального сосуда. Для продолжительной видео-

съемки живых клеточных культур в камере инвертированного микроскопа

поддерживается постоянная температура, оптимальная для жизнедеятельно-

сти клеток (для клеток человека 37

С). В термостатируемую камеру микро-

скопа помещается культуральный сосуд, на дне которого растут клетки в пи-

тательной среде. Для нормального роста клеток в атмосфере культурального

сосуда должна быть 5%-ная концентрация углекислого газа (СО

Рисунок 1 – Компьютерный видеокомплекс

Для выполнения видеозаписи и анализа полученных видеозаписей ис-

пользуются подобранные и специально разработанные компьютерные про-

граммы, зарегистрированные в Республике Беларусь в качестве информаци-

онных ресурсов.

Для детального учета событий, происходящих в клеточной культуре,

необходима определенная частота кадров. В наших исследованиях съемка

осуществляется с частотой один кадр в минуту. Эта частота обеспечивает на-

инвертированный

микроскоп

видеокамера

терморегулятор

термокамера

компьютер

культуральный

сосуд

блюдение за изменениями клеточной культуры в целом, а также за событиями

на уровне единичных клеток, например клеточными митозами и гибелью, ди-

намикой формы, движением клеток и др. Иногда для регистрации более бы-

стро протекающих процессов требуется более высокая частоту кадров.

Продольные и поперечные бороздки, шириной 200 мкм и глубиной 50 мкм, обра-

зуют квадратные участки ростовой поверхности размером 1х1 мм. Бороздки

значительно уменьшают перемещение клеток

Рисунок 2 – Культуральный флакон (а) и субстратная стеклянная

пластинка (б)

Длительность видеосъемки зависит от задачи исследования и может

варьировать от десятков минут до многих дней. Продолжительная круглосу-

точная видеозапись живых клеток необходима, например, для регистрации

процесса формирования клеточного клона, т.е. многих клеток, возникающих

путем митотических делений из одной клетки-родоначальницы. Так, в демон-

страционном видеофильме, полученном в результате трехнедельной записи,

показан процесс формирования густой клеточной культуры из одной клетки.

Многодневная съемка требуется также для анализа процессов клеточ-

ного старения единичных клеток, потерявших способность делиться. Можно

наблюдать постепенное увеличение размера клеток, появление двуядерных

клеток, замедление движения, вакуолизацию цитоплазмы и гибель клетки

(апоптоз). Процесс клеточной гибели сопровождается либо быстрым и резким

уменьшением объема клетки (конденсацией), либо распадом клетки на не-

сколько конденсированных фрагментов.

Наряду с прижизненным изучением фенотипических изменений мы

также анализировали экспрессию гена бета-галактозидазы в отдельных клет-

ках на фиксированных препаратах. Повышенная экспрессия этого гена явля-

ется общепризнанным маркером клеточного старения.

В качестве объектов исследования использовали эмбриональные фиб-

робласты человека и мыши, а также постоянную иммортализированную ли-

нию, выделенную нами при культивировании эмбриональных фибробластов

мыши (рисунок 3).

а б в

Рисунок 3 – Объекты исследования: культуры эмбриональных

фибробластов человека (а) и мыши (б); иммортализированная культу-

ра эмбриональных фибробластов мыши (в)

Человек и мышь – виды млекопитающих, резко контрастные по про-

должительности жизни, а также частоте возникновения онкологических забо-

леваний, которая у грызунов на несколько порядков выше, чем у человека

(таблица 1). Выполненное в наших работах сравнение изменений фенотипа на

уровне отдельных клеток и их клонов у человека и мыши позволило получить

новые данные о генетических процессах, ведущих к старению и раковой

трансформации.

Таблица 1 – Частота раковой трансформации у видов с контрастной

продолжительностью жизни

Биологический вид

Максимальная (рекорд-

ная) продолжительность

жизни

Частота раковой

трансформации (в пе-

ресчете на клеточную

генерацию в отн. ед.)

122 года

4 года

– 10

2.2 Клеточное старение и раковая трансформация

Основываясь на опытах с культурами раковых (иммортализированных)

клеток, биологи долгое время были уверены, что в оптимальных условиях

бесконечно долго могут делиться и нормальные клетки животных и человека

– как в культуре, так и в организме. Однако в начале 1960-х гг. Леонард

Хайфлик установил, что в клеточных культурах нормальные диплоидные

(соматические клетки) человека способны делиться лишь ограниченное коли-

чество раз. Предельное количество делений («лимит Хайфлика») сильно за-

висит от возраста индивидуума, которому эти клетки изначально принадле-

жали. Так клетки новорожденных делились в культуре 80–90 раз, а 70-

летнего человека – только 20–30 раз. Достигнув «лимита Хайфлика», клетки

переходят в состояние старения, или одряхления – сенесенса (от англ. – se-

nescence), которое характеризуется резким нарушением метаболизма, прежде

всего, прекращением репликации ДНК. Вслед за этим состоянием обычно

следует гибель клеток.

Заметный вклад в повышение современного уровня познания процессов

клеточного старения, а также тесно связанной со старением раковой транс-

формации внесли исследования по генетике соматических клеток. Дальней-

ший прогресс в этой области может быть достигнут благодаря совершенство-

ванию экспериментальных моделей и методов. Исследования соматических

клеток, в частности молекулярно-генетические, в основном выполняются на

большой совокупности клеток в один из моментов роста клеточной популя-

ции. Однако данный подход не позволяет изучать всю последовательность

связанных со старением и трансформацией генетических и эпигенетических

изменений, начиная с возникновения их в отдельных клетках и заканчивая

экспансией этих изменений в клеточной популяции. Для устранения этого

пробела необходим непрерывный мониторинг генетических процессов в кле-

точных популяциях на уровне отдельных клеток, а также их потомств на про-

тяжении многих поколений.

Так же, как при клеточной дифференцировке, при старении и транс-

формации происходит модификация эпигенетического состояния клеток.

Спектр экспрессии генома в свою очередь обусловливает клеточный фенотип,

представляющий собой совокупность морфологических и функциональных

характеристик клеток.

Взаимосвязь изменений клеточного фенотипа с процессами старения и

трансформации изучалась группой немецких исследователей под руково-

дством Клауса Байройтера. Согласно их выводам, в культурах фибробластов

человека и животных, которые ранее считались гомогенными клеточными

популяциями, происходят процессы семистадийной дифференцировки, при-

водящие к накоплению постмитотических клеток (рисунок 4). Каждая стадия

характеризовалась определенным морфотипом и набором белковых марке-

ров. Постмитотические стадии характеризовались повышенной плоидностью

ДНК, причем терминально дифференцированные фибробласты либо погиба-

ют, либо распадаются на мелкие трансформированные клетки. Если бы про-

цессы, отражаемые схемой Байройтера, в действительности существовали, то

данная схема стала бы удобной моделью для изучения эпигенетических ме-

ханизмов дифференцировки, старения и трансформации клеток.