Дромашко С.Е., Квитко О.В., Конева И.И. и др. Компьютерная видеомикроскопия живых клеток

Подождите немного. Документ загружается.

Таблица 2 – Изменения активности бета-гал в процессе культивирова-

ния стареющей и иммортализированной клеточных популяций

Тип клеток

Срок куль-

тивирования

Численность

клеток

Количество

бета-гал

позитивных

клеток

Доля бета-

гал пози-

тивных

клеток, %

Стареющие фибро-

бласты эмбриона че-

ловека

6 суток

300

0,3±0,3

20 суток

179

14,5±2,6

34 суток

142

104

73,2±3,7

Иммортализированная

линия клеток из эм-

бриона мыши

2 суток

151

24,5±3,5

15 суток

26,1±4,6

Рисунок 13 – Гетерогенность клеток иммортализированной линии

из эмбриона мыши по активности бета-гал

Наличие и относительное постоянство бета-гал позитивных клеток в

нестареющей культуре свидетельствует о присутствии в иммортальных попу-

ляциях двух субпопуляций – стволовой линии и фракции стареющих клеток.

Данному выводу соответствуют и результаты анализа клеточной генеалогии

иммортальной культуры. Потомство одних клеток характеризовалось высо-

кой пролиферативной активностью, в то время как потомство других в ос-

новном было представлено медленно делящимися клетками. Следовательно,

в иммортализированной популяции могут существовать субклоны, в которых

ослабление пролиферативной активности наследуется и прогрессирует, что

может положительно коррелировать с экспрессией маркера клеточного ста-

рения, каким является ген бета-галактозидазы.

Важным аспектом антираковой терапии является гетерогенность попу-

ляции раковых клеток. Клеточная фракция, представленная раковыми ство-

ловыми клетками, может отвечать за неограниченную пролиферацию опухо-

ли. Нами разработаны методы анализа клоновой структуры клеточных попу-

ляций на основе компьютерной видеомикроскопии живых клеток. Установ-

лено, что часть клеток линии рака легкого А549 формирует клоны, которые

после нескольких репликаций стареют и погибают, в то время как другие

клетки (иногда небольшая часть) генерируют бесконечно растущие (потенци-

ально бессмертные) клоны. В этой связи особый интерес имеет поиск средств,

индуцирующих дифференцировку раковых стволовых клеток в направлении

клеточного старения и гибели. Натуральные и синтетические полинуклеоти-

ды (ДНК и РНК) являются перспективным источником для создания антира-

ковых препаратов. Нами обнаружен резко выраженный ингибирующий эф-

фект ДНК эритроцитов цыплят (100 мкг/мл), добавляемой в среду для куль-

тивирования клеток НеLа (рисунок 14).

а – культура НеLа (посевная плотность 5000 клеток на квадратный сантиметр); б –

культура НеLа с добавлением ДНК (100 мкг/мл); культивирование в течение 7 суток; в –

динамика плотности культуры НеLа (посев 10000 кл/см

) в контроле (1) и с добавлением

ДНК эритроцитов цыплят (2)

Рисунок 14 – Антираковый эффект ДНК эритроцитов цыплят

Представляется целесообразной разработка клеточных систем для под-

бора полинуклеотидных препаратов (варьирующих по нуклеотидной после-

довательности и размеру фрагментов), направляющих эпигенетическую из-

менчивость раковых клеток в сторону пролиферативного старения и гибели.

Контрольные вопросы

1. Что такое конфокальная микроскопия?

2. Чем инвертированный световой микроскоп отличается от обычного?

3. Какой должна быть концентрация СО

в атмосфере культурального

сосуда для обеспечения нормального роста клеток?

4. Как длительность видеосъемки зависит от задачи исследования?

5. Для чего используется тест на экспрессию гена бета-галактозидазы в

отдельных клетках?

6. Что такое «лимит Хайфлика»?

7. В чем проявляется ограниченность метода анализа фиксированных

клеточных культур?

8. Как изменения клеточного фенотипа связаны с процессами старения

и трансформации клеток?

9. Какие параметры клеток можно исследовать с помощью прижизнен-

ной компьютерной видеомикроскопии?

10. Наследуются ли морфотипы в клеточных поколениях?

11. Что такое неозис?

12. Происходит ли немитотическое образование трансформированных

клеток?

13. Что такое иммортализированные линии клеток?

14. Какие нарушения митоза наблюдаются в иммортализированных ли-

ниях?

15. Стареют ли клетки в иммортализированных линиях?

2 ПРИМЕРЫ ПРИКЛАДНОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

КОМПЬЮТЕРНОЙ ВИДЕОМИКРОСКОПИИ

ЖИВЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

2.1 Медицинская трансплантология

Перспективы развития клеточных технологий для лечения ряда заболе-

ваний во многом зависят от разработки нетравматичных и экономичных ме-

тодов получения значительных количеств аутологичных (собственных) кле-

ток, культивируемых in vitro. Применение именно аутологичных клеток осо-

бенно важно, поскольку при этом устраняются проблемы, связанные с им-

мунными реакциями, вызываемыми введением в организм генетически ино-

родного клеточного материала. В этом плане особый интерес представляет

возможность наработки in vitro клеток из фолликулов волос человека.

Фолликулы волос человека являются источником мультипотентных

стволовых клеток, способных в подобранных условиях культивирования

дифференцироваться в клетки различных типов, включая нервные. Особый

интерес с практической точки зрения вызывает возможность получения ауто-

логичных клеток не из хирургически извлекаемого участка скальпа, а из фол-

ликулов выщипываемых волос.

При получении культуры клеток из малого количества исходного мате-

риала тщательное исследование клеточных культур с помощью компьютер-

ной видеомикроскопии значительно повышает эффективность работы, по-

скольку при отсутствии условий культивирования, оптимизированных для

нового источника клеток, критически важным является обнаружение хотя бы

одного небольшого размножающегося клеточного клона, из которого можно

в дальнейшем получить клеточную линию. В процессе культивирования не-

скольких фолликулов волос затылка (извлеченных пинцетом) с помощью

компьютерной видеомикроскопии нами было обнаружено несколько неболь-

ших клеточных клонов, которые вскоре прекратили делиться, причем нача-

лась убыль клеток в результате апоптоза. На этой стадии в культуральную

среду была добавлена полученная в нашей лаборатории жидкость из фолли-

кулов яичника коров, обладающая антиапоптозным и пролиферативным эф-

фектом на клетки гранулезы из яичника коров. В результате регулярного про-

смотра клеточных культур в сочетании с видеосъемкой было обнаружено, что

клетки одного из клонов продолжали делиться. После достижения этим кло-

ном значительного размера некоторые одиночные клетки и небольшие кле-

точные агрегаты начали открепляться от ростового субстрата в культураль-

ную среду, а затем давать начало новым клонам в различных местах ростовой

поверхности, что также регистрировалось компьютерной видеозаписью (ри-

сунок 15).

Таким образом, была получена полусуспензионная культура клеток, в

которой клетки сохраняют жизнеспособность и пролиферативный потенциал

как на субстрате, так и в культуральной среде. Благодаря этому свойству дан-

ную культуру удобно размножать без использования трипсина (который ис-

пользуется для снятия клеток с ростового субстрата) путем перенесения сре-

ды с клетками в новый культуральный сосуд.

Рисунок 15 – Рост клона клеток фолликулов волос человека

Для изучения способности полученной линии клеток из фолликулов во-

лос к дифференцировке было использовано многократное компьютерное фо-

тографирование многих участков ростовой поверхности в последовательные

периоды культивирования клеток. В результате установлено, что некоторые

клетки дифференцируются по нейральному типу (морфологическое сходство

с нейронами и олигодендроцитами) (рисунок 16). Эти клетки являются по-

стмитотическими, поскольку утрачивают способность к делению.

Для поиска удобного режима культивирования, при котором частота

дифференцировки увеличивается, клетки культивировали при пониженной

температуре (30

С). Этот прием мы использовали, опираясь на данные о

дифференцировке стволовых клеток тератокарциномы мыши при температу-

ре 31

С. Кроме того, понижение температуры после начального периода кле-

точной пролиферации при 37

С часто применяется для увеличения продукции

г – 6 дней

в – 4 дня

б – 2 дня

а – 0 дней

100 мкм

рекомбинантных белков. При этом клетки продолжительное время находятся

в стационарной фазе, когда их деление прекращается.

Рисунок 16 – Дифференцировка клеток фолликулов волос человека

С помощью последовательного ежедневного компьютерного фотогра-

фирования многих участков культур клеток фолликулов волос, выдерживае-

мых при 30

С в течение нескольких дней, была обнаружена массовая ней-

ральная дифференцировка клеток. После обратного перенесения культур в

нормальные температурные условия (37

С) дифференцированные клетки ни-

когда не делились и нередко достигали очень крупных размеров, существуя в

культуре до нескольких десятков дней. При этом были установлены некото-

рые неизвестные ранее особенности процесса дифференцировки. Так, часто

обнаруживались пары близко расположенных очень сходных по морфологии

дифференцированных клеток, связанных друг с другом посредством межкле-

точных контактов. Это свидетельствует о симметричной дифференцировке,

б – 2 дня

100 мкм

а – 0 дней

в – 4 дня

г – 6 дней

при которой дифференцируются обе сестринские клетки. В этом плане следу-

ет отметить, что в последние годы появились работы, демонстрирующие слу-

чаи симметричной дифференцировки стволовых клеток, хотя ранее полагали,

что дифференцировка происходит только асимметричным путем, когда одна

из клеток остается недифференцированной. Нами был зарегистрирован также

факт слияния двух сестринских дифференцированных клеток в двуядерную

клетку (сохранивших связь в виде тонкой нитевидной цитоплазматической

перетяжки), причем оба ядра располагались рядом. Данное наблюдение де-

монстрирует один из механизмов образования постмитотических полиплоид-

ных клеток.

2.2 Клеточные технологии для животноводства

Важнейшим ресурсом повышения эффективности производства живот-

новодческой продукции являются технологии, основанные на последних дос-

тижениях биологической науки. В этом плане особые надежды связаны с раз-

витием биотехнологий, основанных на продукции in vitro эмбрионов для по-

следующей трансплантации животным-реципиентам. Этот подход направлен

на максимальное использование генетического потенциала отдельных, наи-

более высокопродуктивных, доноров яйцеклеток для улучшения продуктив-

ности популяций сельскохозяйственных животных. Однако достижения ре-

продуктивной биотехнологии на основе производства эмбрионов in vitro во

многом еще не реализованы в практике племенного дела и селекции сельско-

хозяйственных животных. Это в значительной степени связано с недостаточ-

но высоким выходом зародышей, достигших стадии бластоцисты и пригод-

ных для трансплантации. Для преодоления раннего блока дробления и разви-

тия эмбрионов до стадии бластоцисты представляется перспективным ис-

пользование совместного культивирования зародышей с культурами сомати-

ческих клеток, получаемых из репродуктивного тракта животных того же ви-

да, что и яйцеклетки – например, клеток яйцевода, кумулюса или гранулезы,

находящихся в фолликулярной жидкости, окружающей ооцит-кумулюсные

комплексы. «Поддерживающие» культуры могут создавать благоприятный

для развития зародышей сигнально-информационный фон путем продуциро-

вания ростовых факторов. Это определяет актуальность разработки методов

получения культур клеток гранулезы для использования в технологии про-

дуцирования эмбрионов животных, в частности крупного рогатого скота.

Для получения культуры клеток гранулезы коров нами был принят мо-

дифицированный метод Langhout et al. (1991). Существенной особенностью

нашего подхода является добавление в культуральную среду фолликулярной

жидкости (стерилизованной фильтрацией через бактериальный фильтр). Этот

прием был использован на основании данных швейцарского исследователя

Мишеля Хорисбергера (M. Horisberger) о том, что в фолликулярной жидкости

содержатся вещества, ингибирующие апоптоз и стимулирующие пролифера-

цию клеток, хотя швейцарец работал с фолликулами свиней, а не крупного

рогатого скота.

Культуры гранулезных клеток анализировали с помощью компьютер-

ной видеосъемки (рисунок 17). Было обнаружено, что добавление фоллику-

лярной жидкости в культуральную среду обеспечивает интенсивную проли-

ферацию клеток и возможность их продолжительного культивирования без

признаков клеточного старения. Так, в течение первых 10 дней культивиро-

вания при добавлении в среду трети фолликулярной жидкости образовался

густой клеточный монослой, а затем были получены длительно культивируе-

мые культуры, поддерживаемые не только с помощью трипсиновых пересе-

вов, но и менее трудоемким приемом – еженедельной сменой среды в одном

и том же культуральном сосуде. В то же время без применения фолликуляр-

ной жидкости клетки сначала размножаются, но затем быстро стареют, т.е.

увеличиваются в размерах и прекращают делиться.

Примечание. Одна из клеток принимает шаровидную форму (б) и делится на две дочерние

клетки (в), которые затем распластываются на ростовом субстрате (г). Соседняя

(справа) крупная клетка с высокой оптической плотностью не делится и крайне медленно

изменяет форму. Анализ компьютерных видеозаписей позволяет заключить, что такие

клетки являются исключительно постмитотическими, т.е. никогда не делятся – даже в

присутствии омолаживающих факторов фолликулярной жидкости. Стрелками указаны

материнская и сестринские клетки

Рисунок 17 – Митотическое деление крупной клетки в культуре с

добавлением третьей части фолликулярной жидкости к культуральной

среде

а – 0 ч. 0 м. б – 1 ч. 12 м. в – 2 ч. 0 м. г – 4 ч. 17 м.

Особенно интересно, что фолликулярная жидкость оказалась эффек-

тивной не только при ее исходном добавлении в культуральную среду. До-

бавление одной трети фолликулярной жидкости обеспечивало ярко выражен-

ный омолаживающий эффект на постаревшие клетки. Так, в одном из экспе-

риментов клетки гранулезы после 13 дней культивирования без добавлении

фолликулярной жидкости прекратили пролиферацию и приобрели увеличен-

ный размер и морфологию, характерную для постаревших клеток. Однако до-

бавление среды с содержанием третьей части фолликулярной жидкости после

очередных 8 дней культивирования привело к возобновлению пролиферации,

и количество клеток увеличилось. На компьютерных видеозаписях было об-

наружено много митотических делений, причем в деление вступали не только

мелкие, но и крупные постаревшие клетки. В дальнейшем (наблюдение до 40

дней) в данную культуру при еженедельной смене среды добавляли 10% фол-

ликулярной жидкости. В течение этого срока в культуре увеличивалось коли-

чество густых монослойных участков, состоящих в основном из мелких кле-

ток, хотя были также отдельные крупные постаревшие клетки, которые не де-

лились даже в присутствии омолаживающих факторов фолликулярной жид-

кости.

Таким образом, с помощью компьютерной видеомикроскопии живых

клеток разработан способ получение долговременной культуры клеток грану-

лезы из фолликулов яичника крупного рогатого скота на основе использова-

ния стерилизованной фильтрацией жидкости из фолликулов яичника коров.

2.3 Токсикологическое тестирование веществ, поступающих в ок-

ружающую среду

Культуры клеток человека находят широкое применение в практике

токсикологических испытаний по выявлению способности ряда ксенобиоти-

ков оказывать цитопатические и генотоксические эффекты. С помощью ком-

пьютерной видеомикроскопии, при соблюдении отработанных методических

приемов, можно с высокой количественной точностью изучать воздействие

изучаемых веществ на интенсивность пролиферации, апоптоз (клеточную ги-

бель), дифференцировки и характер локомоторной активности клеток. Все

эти характеристики связаны с рядом важных физиологических процессов.

Например, только одна из перечисленных характеристик – локомоторная ак-

тивность – важна в иммунном ответе, карциногенезе и метастазировании,

заживлении ран и тканевой регенерации, а также в ряде процессов, происхо-

дящих при индивидуальном развитии организма.

Прижизненный анализ клеточных популяций может быть высокоэф-

фективным подходом в токсикологическом и фармакологическом тестирова-

нии. Так, с помощью витального анализа клеток мы исследовали эффекты 24-

эпибрассинолида на пролиферацию эмбриональных фибробластов чело-

века и мыши. Проведено также исследование действия противоопухолевого

препарата диазиквона на клетки линии рака легкого человека А549 (рисунки

18 и 19).

Рисунок 18 – Линия рака легкого А549: воздействие 1 мгк/мл диа-

зиквона в течение 2 суток резко интенсифицирует процесс клазматоза –

отделения фрагментов цитоплазмы

Для выполнения экспериментов по количественному учету клеток в

процессе культивирования мы выращиваем клетки при малой плотности

(обычно 3–10 клеток на 1 мм

ростовой поверхности). При этом клетки высе-

ваются в культуральные сосуды со специально изготовленными стеклянными

вкладышами (размер 2,5 х 1 см, толщина 1 мм) с квадратными (1х1 мм) рос-

товыми площадями, разделенными бороздками шириной 0,2 мм и глубиной

0,05 мм (бороздки замедляют перемещение клеток из одного квадрата в дру-

100 мкм