Дромашко С.Е., Квитко О.В., Конева И.И. и др. Компьютерная видеомикроскопия живых клеток

Подождите немного. Документ загружается.

гой, что обеспечивает удобство микроскопического анализа в динамике роста

субкультур). СО

добавляется в сосуды Карреля с помощью шприца (до 5%

объема сосуда), сосуды герметически закупориваются, и клетки культивиру-

ются в камере инвертированного микроскопа при 37

С. В течение культиви-

рования одни и те же участки ростовой поверхности фотографируются с по-

мощью компьютерной видеосъемки с требуемыми интервалами времени (от

одного до нескольких дней). Полученные компьютерные фотографии явля-

ются материалом для подсчета изменений количества клеток, а также соот-

ношения стареющих (с ограниченной пролиферацией) и бессмертных клонов

(в случае формирования компактных клонов у некоторых линий раковых кле-

ток, например у линии рака легкого А549). Следовательно, предоставляется

возможность изучения действия того или иного вещества на различные кле-

точные фракции, включая раковые стволовые клетки.

Рисунок 19 – Линия рака легкого А549: появление трехядерной

клетки под воздействием 10 мгк/мл диазиквона

Перспективы широкого использования компьютерной видеомикроско-

пии живых клеток в фундаментальных и прикладных исследованиях во мно-

гом определяются все более полной автоматизацией как процесса компью-

терной видеозаписи, так и обработки накопленных компьютерных имиджей.

Говоря о перспективах развития этого метода в нашей стране, следует отме-

тить, что сборка и поставка компьютерных видеокомплексов для исследова-

ний живых клеток выполняется ведущими фирмами нескольких стран (на-

пример, японской компанией Nikon Corporation) по специальным заказам.

Цена полного комплекта составляет примерно 160 тысяч долларов. Самостоя-

тельная сборка видеокомплекса потребителем из комплектующих и подбор

подходящих компьютерных программ с целью уменьшения затрат не приво-

дит к удовлетворительным результатам из-за многообразия имеющихся на

рынке компонентов и необходимости их квалифицированного подбора. На-

пример, данная видеокамера обеспечивает качественную видеозапись только

в сочетании с определенными картами видеозахвата, но эта информация яв-

ляется «ноу хау» специализированных фирм. В результате эксплуатация за-

купленного за рубежом дорогого оборудования может оказаться неэффектив-

ной.

Комплектация и «подгонка» компонентов компьютерной видеосистемы

для мониторинга живых клеточных культур – задача, которая может быть ка-

чественно выполнена только специализированными техническими организа-

циями, способными при необходимости изготавливать дополнительные тех-

нические элементы и разрабатывать программное обеспечение для конкрет-

ных научных и прикладных задач. Нами совместно с НТЦ «Микроскопия»

«КБТЭМ-ИТЦ», входящим в состав ГНПО «Планар» (головная организация),

и лабораторией нанопроцессов и технологий Института тепло- и массообмена

НАН Беларуси реализуется научно-технический проект по разработке, изго-

товлению и освоению в производстве автоматизированного видеокомплекса

для мониторинга живых клеток «Цитомир», способного обеспечить много-

кратное компьютерное фотографирование многих (до нескольких сотен) раз-

личных участков ростовой поверхности долговременных клеточных культур.

Его ориентировочная цена составит 64 тысячи долларов.

В состав автоматизированного видеокомплекса будут входить:

 инвертированный микроскоп проходящего света с выходом изображения

непосредственно на монитор персонального компьютера:

o диапазон увеличения объекта на мониторе – от 50х до 400х;

o диапазон перемещения автоматизированного предметного стола по

координатам X, Y: 140x100 мм;

o цветная видеокамера с разрешением не менее 2 МГПкс;

o возможность многократного повторного фотографирования до 1000

участков объекта в течение месяца;

 терморегулируемая камера с поддержанием температуры 37±0,2

С;

 компьютер с источником бесперебойного питания;

 пакет ПО для видеозаписи обработки микроскопических имиджей живых

клеточных культур.

Контрольные вопросы

1. Что такое аутологичные клетки? Для чего они могут использоваться?

2. Как получают фолликулярные стволовые клетки?

3. Как используется компьютерная видеомикроскопия для изучения

способности к дифференцировке линий клеток из фолликулов волос?

4. Что такое симметричная дифференцировка?

5. Для чего используется продукция in vitro эмбрионов?

6. В чем заключается модификация метода Хорисбергера для получения

клеток гранулезы из фолликулов яичника крупного рогатого скота?

7. Как компьютерная видеомикроскопия используется для выявления

способности ксенобиотиков оказывать цитопатические и генотоксические

эффекты?

8. Каковы перспективы широкого использования компьютерной видео-

микроскопии живых клеток в фундаментальных и прикладных исследовани-

ях?

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ

1. Проанализировать существующие методы компьютерной видеомик-

роскопии.

2. Подготовить реферат на тему «Клеточное старение и лимит Хайфли-

ка».

3. Проанализировать взаимосвязь изменений клеточного фенотипа с

процессами старения и трансформации.

4. Проанализировать литературу в PubMed по клеточному старению.

5. Подготовить реферат на тему «Получение и использование имморта-

лизированных линий клеток».

6. Подготовить электронную презентацию на тему «Немитотическое

образование трансформированных клеток».

7. Подготовить реферат на тему «Физиологические и молекулярные

маркеры старения».

8. Подготовить электронную презентацию на тему «Клеточные культу-

ры в медицинской трансплантологии».

9. Проанализировать литературу по использованию клеточных техноло-

гий в животноводстве.

10. Охарактеризовать особенности использования клеточных культур

для токсикологического тестирования ксенобиотиков.

СЛОВАРЬ ОСНОВНЫХ ТЕРМИНОВ И ПОНЯТИЙ

Апоптоз – программируемая клеточная гибель

Аутологичные клетки – собственные клетки организма

Ген бета-галактозидазы – ген, активно экспрессирующийся в стареющих

клетках некоторых тканей, маркер клеточного старения

Генотоксические эффекты – повреждения ДНК

Клетки гранулезы – клетки внутренних стенок и полости фолликула яичника

Диазиквон (AZQ) – противоопухолевый препарат, относящийся к классу хи-

нонов

Иммортализированная клеточная линия – потенциально бессмертная линия

клеток, способная к неограниченному во времени культивированию

Инвертированный микроскоп – микроскоп с обращенной оптической систе-

мой, позволяющей наблюдать объекты значительной толщины, включая по-

суду для культивирования клеток

Карциногенез – совокупность процессов, приводящих к возникновению и

пролиферации раковых клеток

Клазматоз – отделение участков цитоплазмы от клетки

Лимит Хайфлика – максимальное количество удвоений популяции старею-

щих клеток

Неозис – гипотетический процесс возникновения иммортализированных

(включая раковые) клеток при немитотическом делении постаревших поли-

плоидных клеток

Рекомбинантные белки – белки, произведенные с помощью генно-

инженерных технологий

Сенесенс – старение, (транслитерация англ. Senescence)

Цитопатические эффекты – разрушение и функциональная патология клеток

ЛИТЕРАТУРА

* Квитко, О.В., Шейко, Я.И., Конева, И.И., Мезен, Н.И., Тюриков, А.П.

Исследование причин различной предрасположенности к раковой трансфор-

мации клеток человека и мыши / О.В.Квитко [и др.] // Известия НАН Белару-

си, сер. биол. наук.– 2002, № 2. – С. 61–64.

* Квитко, О.В., Шейко, Я.И., Конева, И.И. Анализ неограниченной

пролиферации иммортализированной линии клеток с помощью прижизнен-

ной микроскопии / О.В.Квитко [и др.] // Доклады НАН Беларуси. – 2005. –

Т.49, № 5. – С. 89–93.

* Шейко, Я.И., Квитко, О.В., Конева, И.И., Тюриков, А.П. Анализ про-

лиферации и дифференцировки нормальных (стареющих) фибробластов че-

ловека и мыши с помощью прижизненной видеомикроскопии / Я.И.Шейко [и

др.] // Доклады НАН Беларуси.– 2002. – Т. 46, № 1. – С. 90–94.

* Bayreuther, K., Francz, P.I., Gogol, J., Hapke, C., Maier, M., Meinrath,

H.G. Differentiation of primary and secondary fibroblasts in cell culture systems /

K. Bayreuther [e. a.] // Mutation Research. – 1991. – Vol. 256, № 2–6. – P. 233–

242.

* Dimri, G.P., Lee, X., Basile, G., Acosta, M., Scott, G., Roskelley, C., Me-

drano, E.E., Linskens, M., Rubelj, I., Pereira-Smith, O. e.a. A biomarker that iden-

tifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo / G.P. Dimri [e. a.]

// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1995. – Vol. 92. – P. 9363–9367.

* Hayflick, L., Moorhead, P.S. The serial cultivation of human diploid cell

strains / L.Hayflick [e. a.] // Exp. Cell. Res. – 1961. – Vol. 25. – P. 177–185.

* Hong Yu, Dong Fang, Kumar, S.M., Ling Li, Nguyen, T.K., Acs, G., Her-

lyn, M., Xiaowei Xu. Isolation of a novel population of multipotent adult stem cells

from human hair follicles / Hong Yu [e. a.] // American Journal of Pathology. –

2006. – Vol. 168. – P. 1879–1888.

* Horisberger, M. A method for prolonged survival of primary cell lines /

M.Horisberger // In Vitro Cellular and Developmental Biology. – 2006. – Vol. 42,

№ 5–6. – P. 143–148.

* Gho, C.G., Braun, J.E., Tilli, C.M., Neumann, H.A., Ramaekers, F.C. Hu-

man follicular stem cells: their presence in plucked hair and follicular cell culture /

C.G.Gho [e. a.] // Br. J. Dermatol. – 2004. – Vol. 150. – P. 860–868.

* Langhout, D.J., Spice, L.J., Geisert, R.D. Development of a culture system

for bovine granulose cells: effects of growth hormone, estradiol, and gonadotropins

on cell proliferation, steroidogenesis, and protein synthesis / D.J.Langhout [e. a.] //

J. Anim. Sсi. – 1991. – Vol. 6. – P. 3321–3334.

* Simons, J.W. Genetic, epigenetic, dysgenetic, and non–genetic mechanisms

in tumorigenesis / J.W.Simons // Critical Reviews in Oncogenesis. – 1995. – Vol.

6, № 3–6. – P. 261–273.

* Sundaram, M., Guernsey, D.L., Rajaraman, M.M., Rajaraman, R. Neosis: a

novel type of cell division in cancer / M.Sundaram [e. a.] // Cancer Biol. Ther. –

2004. – Vol. 3, № 2. – P. 207–218.

** Квитко, О.В., Жукова, Л.Н., Конева, И.И. Антираковый эффект экзо-

генных нуклеиновых кислот / О.В.Квитко [и др.] // Доклады АН Беларуси. –

1992. – Т. 36, № 7–8. – С. 652–655.

** Квитко, О.В., Шейко, Я.И., Конева, И.И., Анисович, М.В. Активность

бета–галактозидазы в стареющей и иммортализированной клеточных популя-

циях / О.В.Квитко [и др.] // Известия НАН Беларуси, сер. биол. наук. – 2006,

№ 4. – С. 53–57.

** Квитко, О.В., Шейко, Я.И., Конева, И.И., Дромашко, С.Е. Разработка

клеточных тест–систем для создания полинуклеотидных антираковых препа-

ратов / О.В.Квитко [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика. – 2008. –

Т. 7. – С. 18–24.

** Конева, И.И., Войтович, А.М., Наджарян, Л.А., Афонин, В.Ю., Коте-

ленец, А.И., Квитко, О.В. Эпибрассинолид модифицирует пролиферацию и

апоптоз эмбриональных фибробластов / И.И.Конева [и др.] // Новости меди-

ко–биологических наук. – 2005. – № 2. – С. 112–117.

** Bahnson, A., Athanassiou, C., Koebler, D., Shun, T., Shields, D., Yu, H.,

Wang, H., Goff, J., Cheng, T., Houck, R., Cowsert, L. Automated measurement of

cell motility and proliferation / A.Bahnson [e. a.] // BMC Cell Biol. – 2005. – Vol.

6. – P. 19.

** Cremisi, C., Duprey, P. Spontaneous differentiation of murine teratocar-

cinoma stem cells at low temperature / C.Cremisi [e. a.] // J. Cell Physiol. – 1986.

– Vol. 129. – P. 230–236.

** Hayflick, L. Aging under glass / L.Hayflick // Mutation Research. – 1991.

– Vol. 256. – P. 69–80.

** Kumar, N., Gammell, P., Meleady, P., Henry, M., Clynes, M. Differential

protein expression following low temperature culture of suspension CHO–K1 cells

/ N.Kumar [e. a.] // BMC Biotechnol. – 2008. – Vol. 8. – P. 42.

** Kvitko, O.V., Koneva, I.I., Sheiko, Y.I., Anisovich, M.V. Hunting the me-

chanisms of self–renewal of immortal cell populations by means of real–time imag-

ing of living cells / O.V.Kvitko [e. a.] // Cell Biology International. – 2005. – Vol.

29. – P. 1019–1024.

** Zwaka, T.P., Thomson, J.A. Differentiation of human embryonic stem

cells occurs through symmetric cell division / T.P. Zwaka [e. a.] // Stem Cells. –

2005. – Vol. 23. – P. 146–149.

*** http://labmcp.at.tut.by/

*** http://www.medicine.dal.ca/rajaraman/

*** http://www.confocal.ru/

*** http://www.informnauka.ru/scicafe/scicafe081020.shtml

Условные обозначения:

* основная литература;

** дополнительная литература;

***интернет-сайты.

Учебное издание

Дромашко Сергей Евгеньевич, Квитко Олег Викторович,

Конева Ирина Ивановна и др.

КОМПЬЮТЕРНАЯ ВИДЕОМИКРОСКОПИЯ

ЖИВЫХ КЛЕТОК

Учебно-методическое пособие

Редактор-корректор А. А. Сычѐв

Компьютерная верстка С. Е. Дромашко

Подписано в печать 20.05. 2010. Формат 60х80 1/16 Бумага офсетная. Гарнитура Таймс.

Печать цифровая. Усл. печ. л. 2,1 Уч.-изд. л. 1,55 Тираж 100 экз. Заказ 226.

ГУО «Институт подготовки научных кадров Национальной академии наук Беларуси»

ЛИ №02330/0552815 от 17.02.2010.

Ул. Кнорина, 1, 220049, г. Минск.

Типография РУП «Научно-практический центр Национальной академии наук

Беларуси по механизации сельского хозяйства»

ЛП № 02330/0150026 от 10.05.2007.

Ул. Кнорина, 1, корп. 3, 220049, г. Минск.