Дромашко С.Е., Квитко О.В., Конева И.И. и др. Компьютерная видеомикроскопия живых клеток

Подождите немного. Документ загружается.

МФ – митотический фибробласт, ПМФ – постмитотический фибробласт

Рисунок 4 – Схема дифференцировки фибробластов (по Байройтеру,

1991)

Однако данные Байройтера не подтвердились в других лабораториях –

во многом из-за того, что используемые методики не позволяли проследить

изменения единичных клеток и их потомств. С помощью прижизненной ком-

пьютерной видеомикроскопии мы исследовали процесс поэтапного измене-

ния клеточного морфотипа в культурах эмбриональных фибробластов чело-

века и мыши.

На основании полученных видеозаписей в течение ряда последователь-

ных митотических делений нами были составлены клеточные генеалогии, на-

поминающие родословные в генетике человека. Клетки-родоначальницы и

их потомки в течение ряда поколений изучались по многим признакам. Учи-

тывалось до 20 параметров, таких как площадь и форма клетки, моменты ми-

тоза или клеточной гибели, аномальные митозы, размер и количество ядер,

процессы клазматоза, скорость и характер перемещений клеток (рисунок 5).

Анализ видеозаписей показал, что в популяциях фибробластов человека

и мыши, культивируемых in vitro, отсутствуют четко выраженные морфоти-

пы, которые или наследуются в клеточных поколениях, или изменяются при

дифференцировке (рисунок 6). Это демонстрировалось высокой изменчиво-

стью формы клетки в межмитотическом интервале. Так, например, в одном из

изученных случаев фибробласт мыши перед делением имел треугольную

форму (морфотип 2 по схеме терминальной дифференцировки Байройтера),

затем стал веретеновидным (морфотип 1), а после митоза обе дочерние клет-

ки также продолжали изменять форму. Таким образом было показано отсут-

ствие четкого эпигенетического наследования формы клеток в митотических

поколениях.

Рисунок 5 – Клеточные генеалогии человека (а) и мыши (б)

Рисунок 6 – Отсутствие корреляции между морфотипом материн-

ских и дочерних фибробластов человека (а) и мыши (б)

Однако, нельзя было отрицать возможности менее жесткого наследова-

ния формы клетки. В этом случае эпигенетический статус клеток может де-

терминировать лишь вероятность их нахождения в той или иной форме. Дан-

ную вероятность можно выразить в процентной доле пребывания клетки в

одной из форм по отношению ко всему сроку ее наблюдения. В качестве ин-

декса формы использовали долю времени пребывания клетки в веретеновид-

ной форме, соответствующей первой стадии дифференцировки фибробла-

стов, по Байройтеру. Мы сравнили индекс формы у материнских и дочерних

клеток внутри клеточной популяции с целью выявить наследование данного

признака. Корреляции формы материнских и дочерних клеток обнаружено не

было как в культуре фибробластов человека, так и мыши. Таким образом, не

была подтверждена и возможность “нежесткого” наследования клеточных

морфотипов. Следовательно, в культурах фибробластов человека и мыши от-

сутствуют морфотипы, наследуемые в клеточных поколениях.

150-2300

более 2300

человек

мышь

10%

20%

30%

40%

50%

60%

Доля поделившихся клеток

Площадь клеток в мкм

Цифры на столбцах – количество клеток в данной группе. Доля поделившихся

клеток во фракции крупных фибробластов мыши достоверно выше (Р<0,0001),

чем среди крупных фибробластов человека

Рисунок 7 – Митотическая активность фибробластов человека и

мыши в 2-х группах: клеток с площадью от 150 до 2300 мкм

и более 2300

мкм

Вместе с тем обращало на себя внимание то, что в популяциях фиброб-

ластов человека клетки намного чаще находятся в веретеновидной форме. У

них этот показатель нередко достигает 100%, в то время как у фибробластов

мыши он не превышает 50%. Не исключено, что видовые особенности индек-

са формы связаны с генетически детерминированными различиями в продол-

жительности жизни клеток человека и мыши.

Нами была также изучена взаимосвязь между клеточной пролифераци-

ей и размером клетки в культурах фибробластов человека и мыши (рисунок

7). При изучении зависимости митотической активности от площади клеток

было отмечено, что у фибробластов человека не делятся наиболее крупные

клетки, чья площадь превышала 2300 мкм

. В то же время в культуре фиб-

робластов мыши делились и самые крупные клетки (около 8000 мкм

). На

наш взгляд, это явление объясняется тем, что в клетках человека имеется бо-

лее надежная система регуляции пролиферации, ограничивающая деление

крупных клеток. Среди больших клеток чаще встречаются постаревшие и

полиплоидные клетки, которые при делении с большей вероятностью могут

продуцировать дисфункциональные или трансформированные клетки. Тот

факт, что крупные клетки человека не делятся в отличие от крупных клеток

мыши, может быть причиной резких различий данных видов млекопитающих

в скорости старения и частоте раковой трансформации.

1.3 Немитотическое образование трансформированных клеток

Нами было выполнено также исследование по проверке гипотезы об

образовании трансформированных клеток с увеличенным пролиферативным

потенциалом путем немитотического цитокинеза.

В соответствии с концепцией о неозисе, предложенной канадским ис-

следователем Раджараманом, после определенных изменений в геноме нор-

мальных клеток образуются крупные полиплоидные многоядерные клетки,

которые в результате немитотического цитокинеза могут отделять мелкие

клетки, обладающие высоким пролиферативным потенциалом (рисунок 8).

Сходные представления об образовании трансформированных клеток путем

немитотического отделения их от крупных постаревших клеток встречается в

упомянутой выше схеме дифференцировки фибробластов Байройтера.

Рисунок 8 – Схема многоступенчатого канцерогенеза с участием

процесса неозиса (по Раджараману, 2004)

Однако в нашей работе при анализе видеозаписей стареющих и иммор-

тальной клеточных культур не встретилось ни одного случая образования

клеток немитотическим путем. По нашему мнению, исследователи, описы-

вающие такой тип клеточного деления, на самом деле могли наблюдать про-

цесс клазматоза, т.е отделение участков цитоплазмы (рисунок 9). При анализе

видеозаписей живых клеточных культур мы часто наблюдали процесс откре-

пления безъядерных фрагментов цитоплазмы. Эти фрагменты, напоминаю-

щие небольшие клетки, после открепления от клетки могли самостоятельно

двигаться от нескольких часов до трех суток, после чего конденсировались и

погибали. Биологическое значение этого процесса не выяснено. Можно

предположить, что клазматоз служит продлению функционирования клетки

путем регуляции объема и эвакуации шлаков. В работах группы Раджарамана

приводятся иллюстрации, которые, по мнению авторов, демонстрируют

преднеотическую клетку и мелкие клетки, отделившиеся в результате неозиса

от крупной. Однако данные иллюстрации не демонстрируют неозис, посколь-

ку не приведены последовательные этапы этого процесса. Тщательно выпол-

ненный нами анализ видеозаписей не выявил ни одного случая генерирования

новых клеток без истинного митоза (при котором происходит предваритель-

ное округление родительской клетки, чего не наблюдается при клазматозе.

Рисунок 9 – Отделение части цитоплазмы фибробласта человека

Мы также анализировали видеозаписи группы Раджарамана, но не на-

шли ни одного изображения немитотического образования клеток. В то же

время, как и в наших видеоматериалах, мы наблюдали процессы клазматоза,

завершающиеся гибелью отделившихся фрагментов.

Таким образом, в культурах фибробластов человека и мыши, а также в

иммортальной культуре отсутствует процесс образования клеток с увеличен-

ным пролиферативным потенциалом путем немитотического цитокинеза.

Эти данные ставят под сомнение гипотезы о немитотическом образовании

трансформированных клеток.

1.4 Компьютерная видеомикроскопия иммортализированных ли-

ний клеток

Крупные постаревшие или, в данном случае, поврежденные клетки с

большей вероятностью могут продуцировать либо дисфункциональное, либо

трансформированное потомство. Однако, по нашему мнению, образование

трансформированных клеток может происходить путем митотических деле-

ний, а не посредством процесса неозиса. Для анализа данного вопроса мы

провели исследования на иммортализированной линии, полученной нами в

процессе культивирования фибробластов из эмбрионов линейных мышей Af.

Постоянные линии позволяют одновременно исследовать клеточное старение

и трансформацию. Во-первых, отдельные клетки и субклоны иммортальной

культуры могут стареть, утрачивая способность к делению и в конечном сче-

те погибать. Во-вторых, иммортализация сама по себе является одним из эта-

пов онкогенной трансформации.

В культурах полученной нами иммортальной линии образовывались

очаги аномального многослойного роста клеток, которые отмечали другие

исследователи на постоянных линиях. Нами было запланировано изучить

формирование многослойных клеточных очагов для проверки данных лите-

ратуры о том, что такие очаги формируются путем клонального размножения

единичных мутировавших клеток. Мы обнаружили, что многослойные кле-

точные очаги образуются в результате агрегации, а не за счет клонального

размножения мутировавших клеток (рисунок 10а). Этот процесс наблюдался

нами многократно, причем в отличие от процесса отслаивания и слипания

монослоя из погибающих клеток в стареющих культурах в иммортальной

культуре образуются агрегаты живых активно двигающихся клеток. Таким

образом, способность образовывать многослойные агрегаты из отдельных

живых клеток является свойством всей иммортальной культуры, не обуслов-

ленным локальной пролиферацией мутировавших клеток.

Крупные шарообразные агрегаты часто откреплялись от ростовой по-

верхности в культуральную среду. Если такие открепившиеся агрегаты со-

брать и переместить в новый культуральный сосуд, агрегаты прикрепляются

к субстрату, после чего находящиеся в них клетки быстро распространяются

по ростовой поверхности (рисунок 10б). Образование многослойных клеточ-

ных агрегатов с последующим распространением клеток из этих агрегатов на

других участках ростового субстрата имеет сходство с процессом метастази-

рования в организме.

а б

Рисунок 10 – Образование агрегата из иммортальных клеток (а) и

экспансия клеток из агрегатов (б)

В культурах полученной нами линии часто наблюдалось массовое воз-

никновение клеток аномальной морфологии. Образование аномальных клеток

свидетельствует об эпигенетической нестабильности иммортальной линии,

что соответствует представлениям об участии эпигенетической изменчивости

в поэтапной эволюции иммортализированного фенотипа.

Известно, что эпигенетическая нестабильность посредством изменений

метилирования некоторых онкогенов вносит вклад в возникновение и под-

держание трансформированного состояния клеточных популяций. Предпола-

гается, что хромосомная нестабильность также играет роль в трансформации.

В частности, возможно, что при аномальных митозах, приводящих к наруше-

нию хромосомного состава, может происходить амплификация онкогенов и

потеря гетерозиготности генов – супрессоров клеточного деления. Это ведет

к образованию трансформированных клеток.

В этой связи мы исследовали роль аномальных митозов в образовании

клеток с увеличенным пролиферативным потенциалом, а также субклональ-

ную гетерогенность иммортальной культуры в отношении пролиферации и

гибели клеток.

Был проведен эксперимент по продолжительной видеозаписи участка

иммортальной культуры. С помощью специально разработанной компьютер-

ной программы, позволяющей маркировать клетки и регистрировать различ-

ные клеточные параметры (данная программа включена в государственный

регистр информационных ресурсов), была проанализирована видеозапись,

соответствующая 15 суткам реального времени. В результате составлена кле-

точная генеалогия, включающая до 8 поколений клеток, с общей численно-

стью 113 (рисунок 11). Было установлено, что в клеточном клоне достаточно

часто происходили аномальные митотические деления. Среди 71 деления бы-

ло обнаружено 3 трехполюсных митоза, в результате которых образуются 3

клетки. Также было найдено 7 асимметричных биполярных митозов, в ре-

зультате которых образуются две клетки резко различающиеся по размерам.

Рисунок 11 – Пример клеточной генеалогии иммортализированной

культуры фибробластов из эмбиронов мыши

Выяснилось также, что клетки, возникшие в результате аномальных

митозов, обычно не погибают, а напротив, способны к активному делению,

что особенно ярко демонстрируется трехполюсными делениями (рисунок 12).

Возникающие в результате трехполюсного митоза три дочерние клетки, как

правило, обладали высокой пролиферативной способностью и генерировали

субклоны.

- тройные митозы

- ассиметричные митозы

Рисунок 12 – Митотическое деление клетки иммортализированной

линии из эмбриона мыши с образованием трех дочерних клеток

Таким образом, аномальные митотические деления клеток, с повышен-

ной вероятностью приводящие к хромосомным нарушениям, могут вносить

вклад в поддержание иммортализированного состояния и вести к прогрессии

канцерогенеза.

1.5 Молекулярные маркеры клеточного старения

В исследовании эпигенетических предпосылок старения и трансформа-

ции клеток перспективно использовать маркеры, характеризующие экспрес-

сию генов. В этой связи представляет интерес молекулярный маркер клеточ-

ного старения – экспрессия гена бета-галактозидазы. Результаты наших ис-

следований свидетельствуют о целесообразности сочетания методов компью-

терной видеомикроскопии живых клеток и данного цитохимического теста.

Количество клеток, экспрессирующих бета-галактозидазу, повышается

при старении в тканях организма и клеточных культурах. В литературе име-

ются также данные о проявлении этого маркера не только в стареющих, но и

в иммортальных клеточных популяциях in vitro, а также в опухолях в орга-

низме. В нашей работе проведено сравнение экспрессии гена бета-

галактозидазы в нормальных и иммортализированных клеточных культурах.

При увеличении времени культивирования фибробластов человека про-

исходило резкое увеличение количества бета-гал позитивных клеток (таблица

2). В иммортальной популяции активность бета-галактозидазы была обнару-

жена в значительной части клеток (около четверти), причем доля бета-гал по-

зитивных клеток была приблизительно одинаковой при обоих сроках культи-

вирования (рисунок 13).