Чупахина Г.Н. Система аскорбиновой кислоты растений

Подождите немного. Документ загружается.

насыщенный аммиаком, 2 направление - бутанол - метанол - этанол -

муравьинная кислота - вода (30:30:36:5:4 соответственно). Хроматограммы

совмещали с рентгеновской пленкой РТ-1,

С-соединения идентифицировали по

метчикам, радиоактивные соединения просчитывали в сцинтилляционном

счетчике. Расчет радиоактивных соединений вели на радиоактивность всей

водорастворимой фракции.

Спектр поглощения ацетонового экстракта из альбиносных участков 11-

дневных листьев ячменя показал отсутствие в объекте хлорофилла и

каротиноидов (рис. 18). На этом же рисунке представлены спектры поглощения

белков, полученных из ацетоновых экстрактов альбиносных

и зеленых листьев.

Видно, что белки альбиносных и контрольных растений поглощают в одной

области, однако следует отметить большее поглощение первых в области

полосы Соре (от 350 до 425 нм).

Рис. 18. Спектры поглощения:

А - ацетонового экстракта из альбиносных участков листьев ячменя;

Б - белков ацетонового экстракта из альбиносных участков листьев ячменя;

В - белков ацетонового экстракта зеленых листьев ячменя

Более подробный анализ белков ацетоновых экстрактов показал, что

электрофореграммы, окрашенные красителем, а также зимограммы пероксидаз и

диафораз существенно не отличаются у зеленых и альбиносных листьев.

Обнаружена лишь незначительная разница в интенсивности окрашивания одной

изоформы пероксидаз, ферментативная активность которой оказалась выше у

альбиносных листьев (рис. 19).

Рис. 19. Электрофореграммы изоферментов пероксидазы (А) и диафоразы (Б)

зеленых (1) и альбиносных (2) листьев ячменя

В обоих вариантах опыта обнаружены ферредоксин, содержащий

негеминовое железо, и пластоцианин, содержащий ионы меди, что

свидетельствует о биосинтезе в альбиносных листьях функционально активного

ферредоксина и пластоцианина. Приведенные данные указывают на то, что

биосинтез белков ЭТЦ не ингибируется теми концентрациями СМ, которые

использованы в опыте. В гомогенатах, полученных из альбиносных и зеленых

участков листьев

опытных растений, определены РДФ-карбоксилаза, фосфорибулокиназа и

рибозо-5-фосфатизомераза (табл. 21). Из представленных данных видно, что

ассимиляция СО

альбиносными тканями очень низкая, что коррелирует с

низким уровнем активности РДФ-карбоксилазы. Активность двух других

ферментов - фосфорибулокиназы и рибозо-5фосфатизомеразы - у альбиносов

также снижена, но остается на достаточно высоком уровне.

Таблица 21

Ассимиляция СО

и активность ферментов цикла Кальвина в зеленых

и альбиносных участках листьев ячменя, полученных из обработанных СМ семян

Участки Процент ингибирования от контроля (зеленые листья - 100%)

листьев Скорость ас- Количество Активность

симиляции

СО

водораство-

римого белка

РДФ-кар-

боксилазы

фосфори-

булокиназы

рибозо-5-фос-

фатизомеразы

Зеленые

49,1 ± 1,3 37,3 ± 2,7 41,7 ± 2,2 17,7 ± 2,1 35,5 ± 5,2

Альбиносные

99,6 ± 0,3 - 41,8 ± 2,8* 89,4 ± 5,2 26,5 ± 0,3 44,5 ± 6,6

* В данном варианте ингибирование отсутствовало. Количество водорастворимого

белка увеличилось на 41,8% по сравнению с контролем.

Таким образом, в листьях ячменя под действием СМ происходит

уменьшение активности ферментов цикла Кальвина, и в основном это относится

к РДФ-карбоксилазе, большая субъединица которой кодируется ДНК

хлоропласта и там же синтезируется, что и объясняет ингибирующее действие

СМ, связывающегося с 70S рибосомами, на активность РДФ-карбоксилазы [367].

Данные по распределению

С в продуктах пятиминутного фотосинтеза

показывают, что по основным продуктам контроль и зелёная часть опытных

листьев не отличаются (табл. 22). Более 80% радиоактивного углерода в них

включается в сахара и фосфорные эфиры сахаров. При хроматографировании

экстракта из альбиносной ткани почти вся радиоактивность (93%) была

обнаружена в зоне стартового пятна. Можно предположить, что у альбиносов

отсутствии фотосинтеза идет ассимиляция CO

по типу гетеротрофной

фиксации высокомолекулярными соединениями, которые при

хроматографировании не отрываются от старта использованными системами

растворителей. Возможность ассимиляции СO

белыми листьями

подтверждается и другими исследователями [387]. На основании приведенных данных можно заключить, что СМ избирательно

ингибирует биосинтез белков в хлоропласте: мало влияя на образование

исследованных белков ЭТЦ, он нарушает биосинтез хлорофилла, каротиноидов,

ассимиляцию CО

и активность РДФ-карбоксилазы. Предлагается использовать

экспериментально полученные альбиносные проростки как модель для изучения

биогенеза хлоропласта, его функциональной активности и регуляции

метаболизма.

Глава 6. ОБРАЗОВАНИЕ АСКОРБИНОВОЙ,

ДЕГИДРОАСКОРБИНОВОЙ И ДИКЕТОГУЛОНОВОЙ КИСЛОТ ПРИ

ИНГИБИРОВАНИИ ДЫХАНИЯ И ОТДЕЛЬНЫХ ЕГО ЭТАПОВ

Биосинтез аскорбиновой кислоты связан с окислительным превращением

гексоз [306], в зеленых растениях она накапливается

преимущественно на свету

[110]. Этот процесс идет независимо от фотосинтеза, так как увеличение

содержания аскорбата отмечено и у альбиносных проростков при наличии

экзогенного субстрата [246, 181]. Пул АК у освещенных растений определяется

скоростью ее новообразования и использования, например, в качестве

восстановителя в реакциях, связанных с функционированием электрон-

транспортной цепи фотосинтеза и дыхания, и

кроме того, скоростью

фотовосстановления образующейся в данных процессах окисленной формы

аскорбиновой кислоты - ДАК [286]. При разрыве лактонового кольца

дегидроформы образуется ДКГК, накопление которой может служить

показателем направленности процессов в системе АК↔ДАК. В связи с этим

нами одновременно определялось содержание АК, ДАК и ДКГК в зависимости

от процесса дыхания в целом и от отдельных его этапов - гликолиза и цикла

трикарбоновых кислот с

тем, чтобы оценить вклад указанных процессов в

формирование пула АК на свету [174].

Объектом исследования служили зеленые и этиолированные 6-7-дневные

проростки ярового ячменя сорта Майя. Перед опытами в зеленых проростках

уровень аскорбиновой кислоты снижали сорокачасовым выдерживанием их в

темноте. В работе использовали следующие ингибиторы: 2,4-динитрофенол (2,4-

ДНФ) в концентрации 1 ⋅ 10

-3

М, ингибитор гликолиза - фторид натрия (1,5 ⋅ 10

-2

М), ингибитор цикла Кребса - малоновая кислота (5 ⋅ 10

-2

М). Навески листьев,

помещенные на растворы ингибиторов, освещались в течение 1 часа светом

люминесцентных ламп дневного света интенсивностью 15 тыс. эрг.⋅см

-2

⋅с

-1

Контрольные растения освещались на воде.

2,4-ДНФ в концентрации 1 ⋅ 10

-3

М ингибировал накопление АК и ДКГК в

зеленых и этиолированных проростках ячменя на свету (табл. 23). Содержание

ДАК при этом в этиолянтах увеличилось более чем в три раза, тогда как в

зеленых проростках данный процесс был выражен слабее.

Таблица 23

Влияние 2,4-динитрофенола на накопление АК, ДАК и ДКГК

в проростках ячменя на свету

Соединение Содержание кислот, мкг/г t

исходное

(а)

на воде

(б)

на

1 ⋅ 10

-3

2,4-ДНФ (в)

Зеленые проростки*

АК 356 403 368 6,34 4,04 1,68

ДАК 67 30 44 6,07 2,73 4,92

ДКГК 88 117 85 5,69 6,34 0,60

Этиолированные проростки**

АК 370 439 348 5,51 7,23 1,74

ДАК 50 21 74 7,06 16,88 9,44

ДКГК 52 91 47 8,48 11,56 1,54

* n = 4, t

табл.

= 3,18 для Р ≤ 0,05;

** n = 6, t

табл.

= 2,57.

Используемая в опытах концентрация 2,4-ДНФ на 52% подавляла дыхание

(рис. 20). Таким образом, ингибирование дыхания оказывает существенное

влияние на содержание исследуемых кислот. Выявлена различная способность

накапливать ДАК в присутствии 2,4-ДНФ у зеленых и этиолированных

проростков, что связано с особенностями фотовосстановления ДАК [286] или

необратимого окислительного превращения AK [272] у этих растений.

В следующей серии опытов

мы исследовали биосинтез АК, ДАК и ДКГК

при ингибировании гликолиза (табл. 24). В присутствии фторида натрия

содержание восстановленной формы АК и ДКГК возрастало, что

сопровождалось уменьшением количества дегидроформы.

Рис. 20. Влияние ингибиторов на дыхание листьев ячменя:

1 - контроль (на воде),

2 - в присутствии 2,4-ДНФ (1 × 10

-3

М),

3 - в присутствии малоната (5 × 10

-2

М),

4 - в присутствии фторида натрия (1,5 × 10

-2

М)

(экспозиция 1 ч)

Таблица 24

Влияние фторида натрия на накопление АК, ДАК и ДКГК

в проростках ячменя на свету

Соединение Содержание кислот, мкг/г t

исходное

(а)

на воде

(б)

на

1,5 ⋅ 10

-2

фториде натрия (в)

Зеленые проростки*

АК 434 510 530 15,5 2,1 11,5

ДАК 68 35 28 3,9 2,2 5,9

ДКГК 90 117 226 5,8 22,9 27,9

Этиолированные проростки**

АК 374 437 575 15,0 23,1 19,3

ДАК 38 24 0 12,8 13,4 8,1

ДКГК 61 89 210 13,8 31,8 4,9

* n = 4, t

табл.

= 3,18 для Р ≤ 0,05;

** n = 6, t

табл.

= 2,57.

АК в составе окислительно-восстановительной системы глутатион-аскорбат

участвует в превращении дыхательного субстрата [315]. Аллен, Холл [199],

Мазурова [78] отмечали стимуляцию дыхания под действием АК, а величины

ингибирования дыхания и синтеза АК под действием ликорина -

специфического ингибитора биосинтеза АК - коррелировали между собой [206].

В связи с этим можно предположить, что факт стимуляции накопления АК

фторидом натрия является результатом снижения использования ее в

дыхательном процессе в присутствии данного ингибитора. Но, принимая во

внимание то, что фторид натрия лишь на 11% ингибировал дыхание (рис. 20),

можно заключить, что высказанное предположение лишь

частично объясняет

наблюдаемые изменения в содержании АК под действием ингибитора

гликолиза.

Процесс биосинтеза АК и ДКГК не связан с гликолизом как с

энергетическим процессом, так как с энергетической точки зрения гликолиз

малоэффективен [134]. Скорее всего, биосинтез АК и ДКГК идет из гексоз без

окончательного расщепления их в процессе гликолиза. Это хорошо

подтверждается данными опыта, представленными в табл. 25, из которых видно,

что дополнительное снабжение листьев ячменя экзогенной глюкозой - одним из

основных субстратов в биосинтезе AK [402] - снимает эффект накопления АК и

уменьшает накопление ДКГК под действием фторида натрия. Следовательно,

биосинтез АК, ДКГК и гликолиз конкурируют за один и тот же субстрат и

ингибирование гликолиза, отвлекающего

часть имеющихся углеводов, может

способствовать накоплению АК и ДКГК.

Таблица 25

Влияние фторида натрия на накопление АК, ДАК и ДКГК в этиолированных

проростках ячменя, плавающих на растворе глюкозы на свету

Соединение Содержание кислот, мкг/г

исходное на 1%-ном растворе глюкозы

без фторида натрия

1,5 ⋅ 10

-2

М фторида натрия

АК

420 ± 20 512 ± 3 521 ± 14

ДАК

32 ± 6 14 ± 3

ДКГК

72 ± 2 106 ± 1 123 ± 6

Данные этих опытов не отрицают наличия субстратной связи между

биосинтезом АК, ДКГК и гликолизом, так как фторид натрия ингибирует

дыхание на стадии превращения 2-фосфоглицериновой кислоты в

фосфоенолпируват и не исключено, что в биосинтезе АК и ДКГК используется

не целая молекула глюкозы, а метаболизированная в реакциях гликолиза, не

ингибируемых фторидом натрия.

Кроме этого гликолиз имеет альтернативу -

гексозомонофосфатный шунт, который не блокируется данным ингибитором

[163]. Эффект стимулирования биосинтеза АК фторидом натрия в

этиолированных проростках выше, чем в зеленых, что можно объяснить тем, что

часть вновь синтезированной АК в зеленых растениях отвлекается на процессы

фотосинтеза и дыхания хлоропластов [206]. Таким образом, указанный эффект в

конечном

итоге определяется уменьшением использования АК в процессе

дыхания в присутствии фторида натрия и увеличением количества субстрата,

необходимого для образования АК и ДКГК. Субстратом может быть целая

молекула глюкозы или глюкоза, преобразованная в гексозомонофосфатном

цикле или начальных реакциях гликолиза.

При ингибировании ЦТК малонатом (дыхание снизилось на 31%)

содержание всех исследуемых кислот в зеленых и этиолированных проростках

на свету уменьшилось по сравнению с контролем (табл. 26). Следовательно,

биосинтез АК и ее производных зависит от функционирования ЦТК. Эта

зависимость может быть энергетической

, поскольку для образований АК

необходимо фосфорилирование ее предшественников, если признать схему

биосинтеза аскорбата, предложенную Левусом [304]. С другой стороны, ЦТК

может быть донором предшественников, необходимых для образования АК.

Известно, что некоторые органические кислоты способны отвлекаться из цикла.

Среди них α-кетоглутаровая, янтарная, щавелевая - кислоты, стимулирующие

биосинтез АК в проростках ячменя [110].

Таблица 26

Влияние малоната на накопление АК, ДАК и ДКГК

в проростках ячменя на свету

Соединение Содержание кислот, мкг/г t

Исходное

(а)

На воде

(б)

На 5

⋅ 10

-2

раствора малоната

(в)

Зеленые проростки*

АК 399 512 303 6,5 19,5 12,4

ДАК 58 38 15 4,0 5,4 11,8

ДКГК 86 110 96 34,9 5,7 3,8

Этиолированные проростки**

АК 432 444 371 2,2 9,2 4,1

ДАК 35 24 15 6,9 3,7 3,9

ДКГК 64 92 83 14,0 20,9 12,1

* n = 4, t

табл.

= 3,18 для Р ≤ 0,05;

** n = 6, t

табл.

= 2,57.

Учитывая полученные данные, можно заключить, что на свету в проростках

ячменя функционирует система трех кислот - АК↔ДАК→ДКГК. При окислении

ДКГК образуется винная кислота и C

-фрагмент, который может вовлекаться в

обмен углеводов [306, 405]. Биосинтез двух кислот из этой системы - АК и

ДКГК - носит светозависимый характер, тогда как ДАК на свету уменьшается.

Изменения в содержании АК, вызванные присутствием ингибиторов дыхания,

всегда коррелировали с изменением уровня ДКГК. Это не относится к ДАК,

которая является нестабильной и на свету

быстро или фотовосстанавливается,

или необратимо окисляется до ДКГК, что объясняет светозависимый характер

накопления последней.

Таким образом, биосинтез АК и ДКГК в зеленых и этиолированных

проростках идет с использованием органических кислот или глюкозы - целой ее

молекулы или метаболизованной в начальных реакциях гликолиза и

гексозомонофосфатного цикла. Светозависимое накопление АК и ДКГК связано

с процессом дыхания, причем в большей степени с ЦТК, чем с гликолизом,

которые вносят определенный

вклад в формирование пула АК на свету.

Глава 7. ФОТОРЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ,

ОКИСЛЯЮЩИХ АСКОРБИНОВУЮ КИСЛОТУ

Регуляция обмена веществ растений идет на двух уровнях: на уровне синтеза

ферментов и изменения их активности. Значительные колебания

ферментативной активности происходят в ответ на такие факторы, как свет,

темнота, субстраты, гормоны, оводненность тканей, аэрация и

т.д.

Механизм световой регуляции активности ферментов особенно важен для

фототрофных организмов. Световая и темновая модуляции активности

ферментов [201] регулируют обмен веществ у фотосинтезирующих организмов

таким образом, что на свету идет синтез сахаров и запасных веществ, а в темноте

их использование. Отсюда тот интерес, который проявляют исследователи к

вопросу фоторегуляции ферментов восстановительного

пентозофосфатного

цикла [21, 191]. На свету в хлоропластах быстро активизируются четыре

фермента этого цикла: НАДФН-зависимая глицеральдегид-3-фосфат-

дегидрогеназа, седогептулозо-1,7-бисфосфатаза, фруктозо-1,6-бисфосфатаза и

фосфорибулокиназа, а ферменты гликолитического пути - фосфофруктокиназа и

НАДФ-зависимая глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа окислительного

пентозофосфатного пути - на свету инактивируются [61].

Изменение активности ферментов на свету, предполагается [201],

происходит за счет посттрансляционной модификации

хлоропластных и

цитоплазматических ферментов. Некоторые модификации, вероятно, включают

восстановление дисульфидных связей.

Активация светом ферментов восстановительного пентозофосфатного цикла

путем тиол-дисульфидного превращения происходит за счет перевода

неактивных -S-S- форм ферментов в активные SH-формы. Это реализуется за

счет того, что на свету осуществляется перенос электронов от хлорофилла на

атом железа активного центра ферредоксина.

Восстановленный

белок ферредоксин, окисляясь, передает водород

тиоредоксину при участии фермента ферредоксин-тиоредоксин-редуктазы.

Тиоредоксин в восстановленной форме выступает как редуктаза дисульфидных

групп белков, он функционирует как донор водорода для ряда ферментов.