Чупахина Г.Н. Система аскорбиновой кислоты растений

Подождите немного. Документ загружается.

Более длительное 6-часовое освещение по-прежнему стимулировало

полифенолоксидазу у альбиносных и этиолированных проростков и только 24-

часовая экспозиция несколько снизила скорость нарастания активности

фермента. Полифенолоксидаза зеленых проростков, снизившись почти до

исходного уровня в первые два часа освещения, в дальнейшем медленно

возрастала, но в конце освещения (24 часа) тем не менее была в два

раза ниже,

чем у альбиносных проростков и почти в три раза меньше, чем у этиолянтов.

Таким образом, у зеленых проростков включение света после темноты

ингибировало активность полифенолоксидазы, а у проростков, лишенных

зеленых пигментов, - стимулировало.

Анализ изоферментов пероксидазы в полиакриламидном геле показал, что в

альбиносных участках мутантных листьев ячменя активность одной

из изоформ

фермента была выше, чем в соответствующих участках зеленых листьев [182], в

этиопластах выше, чем в хлоропластах [135]. В работе М.В. Гусева и др.[30]

указывается, что при нарушении биосинтетических функций листа, в том числе

связанных с накоплением хлорофилла, число молекулярных форм пероксидазы

и активность некоторых из них увеличиваются. В связи с

этим нами проведено

подробное исследование активности пероксидазы в различных зонах листьев

зеленых, этиолированных и мутантных проростков (табл. 28). Оказалось, что

активность фермента практически одинакова по всей длине этиолированных

листьев, а у зеленых она максимальна в нижней части листа.

Таблица 28

Пероксидазная активность различных зон зеленых, этиолированных

и мутантных листьев ячменя (

ΔД, с/г)

Зона листа Зеленые листья Этиолированные Мутантные

Верхняя

14,00 ± 0,84 15,61 ± 0,61 21,60 ± 0,39

Средняя

14,45 ± 0,85 16,04 ± 0,60 24,53 ± 0,85

Нижняя

17,07 ± 0,41 16,91 ± 0,36 31,98 ± 1,10

Наибольшая гетерогенность в распределении ферментативной активности

обнаружена у мутантных листьев, для которых характерен и самый высокий

уровень ее по всем зонам листа по сравнению с зелеными и этиолированными

проростками. Прослеживается обратная зависимость в содержании зеленых

пигментов и активности пероксидазы: наибольшая активность фермента

выявлена в нижней альбиносной зоне мутантного листа, наименьшая -

в верхнем

пигментированном участке.

Влияние света на пероксидазную активность представлено на рис. 26.

Зеленые проростки сутки выдерживались в темноте, что приводило к снижению

активности фермента. Последующее освещение в течение 6 часов резко

активировало пероксидазу. В дальнейшем стимуляция активности фермента

прекращалась, и в конце световой экспозиции через 24 часа она имела

тенденцию к снижению, хотя

все еще оставалась выше, чем в темновом

варианте.

100

Исследовано действие света различной интенсивности (4,4 и 30 тыс.

эрг ⋅ см

-2

⋅ с

-1

) на активность пероксидазы (рис. 27). Оказалось, что

светозависимая стимуляция активности фермента в зеленых проростках

нарастает с увеличением интенсивности света.

Таким образом, показана положительная реакция пероксидазы зеленых

проростков на освещение, которая зависит от продолжительности и

интенсивности действующего света.

Наряду с зелеными проростками изучалось действие света на активность

пероксидазы в этиолированных и альбиносных

проростках (рис. 28), для

которых также оказалась характерна светостимуляция активности фермента.

- темнота

- свет (30 тыс. эрг ⋅ см

-2

⋅ с

-1

)

Рис. 26. Влияние условий освещения на активность пероксидазы

в зеленых проростках ячменя

101

Рис. 27. Влияние различной интенсивности света

(1 - 4,4 тыс. эрг ⋅ см

-2

⋅ с

-1

; 2 - 30 тыс. эрг ⋅ см

-2

⋅ с

-1

) на активность пероксидазы

в зеленых проростках ячменя (в % к исходной активности - 100 %)

- темнота

- свет (4,4 тыс. эрг ⋅ см

-2

⋅ с

-1

)

Рис. 28. Действие двухчасового освещения на активность пероксидазы

в зеленых (А), этиолированных (Б) и альбиносных (В) проростках ячменя

Для определения спектра поглощения возможного фоторецептора,

ответственного за светозависимую стимуляцию пероксидазной активности в

проростках ячменя, исследовалось действие света различного спектрального

состава на данный процесс (табл. 29). Реакция на освещение

монохроматическим зеленым и синим светом была одинакова у всех типов

листьев: зеленый свет повышал, а синий снижал активность фермента. Красный

свет активировал пероксидазу

только у этиолянтов, у других - снижал. Таким

образом, световая стимуляция активности пероксидазы в зеленых,

этиолированных и альбиносных листьях ячменя зависит от качественного

состава действующего света.

102

Исследование действия света на активность ферментов, окисляющих АК,

показало, что характер фотоответа зависел от состояния пигментного аппарата

проростков ячменя: если у зеленых растений активность АО,

полифенолоксидазы и цитохромоксидазы ингибировалась светом и

активировалась в темноте, то у альбиносных проростков свет стимулировал

активность ферментов. У этиолированных растений реакция на освещение

менялась в ходе

прозеленения; так, аскорбатоксидазная активность повышалась

при переходе темнота - свет, но при продолжающемся освещении с появлением

пигментов понижалась.

Вышеназванные ферменты являются медьсодержащими белками, которые в

окисленной форме имеют интенсивное поглощение света в видимой области

спектра 600 и 800 нм [90]. В связи с этим изменение активности АО,

полифенолоксидазы и цитохромоксидазы при освещении можно было

бы

рассматривать как результат посттрансляционной модификации молекулы

фермента. Однако неоднозначная реакция на освещение активности ферментов у

зеленых и бесхлорофилльных растений не подтверждает это предположение.

Таблица 29

Действие света различного спектрального состава

на активность пероксидазы (

ΔД, с/г) в листьях ячменя

(экспозиция 2 ч; интенсивность света 4,4 тыс. эрг

⋅ см

-2

⋅ с

-1

)

№

опыта

Условия опыта Зеленые Этиолированные Альбиносные

1 В темноте

15,04 ± 0,40 9,42 ± 0,12 27,26 ± 1,13

На красном свету

(620-740 нм)

11,82 ± 0,46

11,93 ± 0,13

19,41 ± 1,46

На белом свету

16,45 ± 0,15 14,40 ± 0,36 33,50 ± 1,21

2 В темноте

9,92 ± 0,21 16,31 ± 0,22 28,99 ± 0,45

На синем свету

(440-520 нм)

9,01 - 0,16

13,07 ± 0,32

23,97 ± 0,25

3 В темноте

15,51 ± 0,23 19,50 ± 0,36 23,26 ± 0,74

На зеленом свету

(480-600 нм)

17,72 ± 0,19

20,24 ± 0,32

26,94 ± 1,27

На свету в зеленых и альбиносных проростках ячменя увеличивается

содержание восстановленной формы АК [181], у альбиносов возрастает скорость

образования свободных фенольных соединений [121]. Таким образом, на свету

при возрастании количества соответствующих субстратов активность АО и

полифенолоксидазы снижается. Следовательно, и механизм субстратной

активации ферментов не объясняет изменения их активности в связи с

освещением.

АО, полифенолоксидаза и цитохромоксидаза - дыхательные ферменты, в

частности, они являются компонентами дыхательной цепи хлоропластов.

Учитывая гипотезу о взаимозаменяемости энергетических процессов -

фотосинтеза и дыхания [143], можно полагать, что на свету, когда в

103

ассимилирующих клетках включается фотосинтез, конкуренция за

энергетические кофакторы приводит к снижению дыхания. Следствием этого

является понижение активности дыхательных ферментов. В

нефотосинтезирующих и слабо пигментированных клетках в отсутствии

конкуренции за аденилаты усиливается дыхание [330]. Это показано и для

альбиносных листьев ячменя (рис. 29). Поэтому в этиолированных и

альбиносных растениях в противоположность зеленым на свету

активность АО,

полифенолоксидазы и цитохромоксидазы не снижается, а даже возрастает.

Последнее может быть следствием возрастающих на свету энергетических трат,

связанных со светозависимыми синтезами.

Как показано для анализируемых мутантных проростков ячменя, на свету в

альбиносной ткани стимулируется гликолиз, окислительный пентозофосфатный

цикл и цикл Кребса [80]. Следовательно, учитывая полученные нами данные по

активации

светом АО, полифенолоксидазы и цитохромоксидазы альбиносных и

этиолированных проростков ячменя, можно говорить о стимуляции светом не

только дыхательной цепи переноса водорода, включающей цитохромы, но и

альтернативных путей, включающих полифенолоксидазу и АО. Последняя у

некоторых растений может обеспечить транспорт всего сжигаемого при

дыхании водорода [49].

Рис. 29. Дыхание зеленых (А) и альбиносных (Б) участков листа ячменя

в % к контролю (контроль - 100 %)

Таким образом, светозависимое изменение активности АО,

полифенолоксидазы и цитохромоксидазы в зеленых, этиолированных и

альбиносных проростках ячменя происходит не путем непосредственного

воздействия света на молекулу фермента, а, скорее всего, опосредованно, через

изменение интенсивности дыхательного процесса, в котором задействованы

указанные оксидазы. Из исследованных нами ферментов, окисляющих АК, в зеленых проростках

только пероксидаза активировалась

светом. Этот фермент является

гемпротеидом, поглощающим свет в нескольких областях спектра. Так,

104

пероксидаза хрена поглощает свет с длиной волны 410-430, 498, 583, 645 нм.

Проведенное нами исследование действия света различного спектрального

состава на пероксидазную активность показало, что зеленый свет (480-600 нм)

повышал, а синий (440-520 нм) снижал активность фермента; красный свет (620-

740 нм) активировал пероксидазу только у этиолированных проростков.

Учитывая спектр поглощения молекулы пероксидазы, можно предположить, что

непосредственным акцептором

света в светозависимом изменении ее активности

может выступать сама молекула фермента, тонкая регуляция активности

которой осуществляется светом определенного спектрального состава.

Действие света на активность пероксидазы, вероятно, не связано с

изменением скорости синтеза фермента, так как нами показано ингибирование

активности пероксидазы синим светом, способствующим преимущественному

накоплению белков [215]. Синий свет может оказывать прямое

действие на

ферменты и непрямое - через изменение уровня субстратов и эффекторов [380].

При длительном освещении растений увеличивается чувствительность

некоторых клеточных процессов к Ф

дк

и синий свет может оказывать

специфическое действие на опосредованный фитохромом синтез ферментов -

через модуляцию фитохромом экспрессии генома [353].

Одновременный анализ ферментов, окисляющих АК, в зеленых,

этиолированных и альбиносных проростках ячменя показал, что максимальный

их уровень был у депигментированных проростков. Этот факт находит

подтверждение в работах по исследованию полифенолоксидазы бесцветной

ткани листьев

хлорофитума [137], мутантных растений ячменя [235], и только у

альбиносных проростков кукурузы цитохромоксидазная активность резко

снижалась [136]. Хотя у других С

-растений активность цитохром-с-оксидазы

была близкой в зеленых и неокрашенных участках пестрых листьев [419].

Наличие пероксидазной, полифенолоксидазной, цитохромоксидазной и АО

активности у альбиносных проростков, полученных нами при ингибировании

30S-субъединиц 70S-рибосом, дает основание связывать синтез исследованных

ферментов с 80S-рибосомами цитоплазмы.

Таким образом, реакция на освещение ферментов, окисляющих АК,

неоднозначна и зависит

от функциональной активности фотосинтетического

аппарата: у зеленых проростков ячменя активность АО, полифенолоксидазы и

цитохромоксидазы снижается на свету, активность пероксидазы возрастает. В

альбиносных и этиолированных тканях листа свет активирует все

исследованные ферменты. Следовательно, можно считать, что одной из причин

возрастания пула АК у зеленых проростков на свету является ингибирование

светом большинства

ферментов, ее окисляющих.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

105

Аскорбиновая кислота выполняет важные функции в жизни растений и

человека, при этом участие витамина С в метаболизме гетеротрофных

организмов более конкретизировано. Что же касается автотрофов,

продуцирующих АК, то у них еще нуждается в уточнении и функция данного

соединения, и пути его новообразования.

В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что

одним из важнейших

условий, определяющих биосинтез АК у растений, является свет. В сухих

семенах АК отсутствует, при их прорастании даже в темноте в проростках

синтезируется АК, но, вероятно, за счет предшественников, запасаемых в

семени. В зеленых же растениях АК накапливается преимущественно на свету,

поэтому оправдано было связывать ее биосинтез с

фотосинтезом. Однако

исследование действия света различного спектрального состава на биосинтез АК

показало, что спектры действия фотосинтеза и биосинтеза АК в отдельных

областях не совпадают. В частности, показана высокая активность желто-

зеленого света в процессе образования АК. Отсутствует положительная

корреляция в содержании фотосинтетических пигментов и способности

растений накапливать АК. Кроме этого, светозависимый

синтез АК был

обнаружен у экспериментально полученных альбиносных проростков ячменя.

Все сказанное дает основание говорить об отсутствии прямой связи между

фотосинтезом и биосинтезом АК, хотя полностью отрицать наличие контактов

между этими процессами нельзя, так как углеводный субстрат для

новообразования АК дает фотосинтез. Экспериментально показано наличие связи между светозависимым

биосинтезом АК

и дыхательным процессом в целом, а также с отдельными его

этапами: гликолизом и ЦТК, особенно с последним. При активации ЦТК

интермедиатами цикла (янтарной, α-кетоглутаровой кислотой) и при его

ингибировании соответственно менялось и накопление АК. Исследование

субклеточной локализации АК в связи с освещением выявило активное

накопление АК во фракции, включающей митохондрии

, что также указывает на

связь биосинтеза АК с органоидами дыхания, хотя ингибирование

хлоропластных, митохондриальных и цитоплазматических рибосом показало,

что биосинтез АК в большей степени зависит от функционирования

цитоплазматических 80S-рибосом, чем от митохондриальных и хлоропластных.

Наблюдаемое светозависимое накопление АК в растениях, вероятно, нельзя

связать с каким-либо одним процессом: фотосинтезом или

дыханием, как это

делалось раньше. Уже сейчас видно, что существует несколько процессов,

которые будут определять накопление АК на свету, и эти процессы могут быть

связаны с фотосинтезом или с дыханием, для которого в последние годы

показано наличие реакций, активируемых светом.

Пул АК в растениях определяется одновременно идущими процессами

биосинтеза и использованием

АК во многих процессах, в том числе и связанных

с обоими энергодающими процессами - фотосинтезом и дыханием. Так,

показано, что уровень АК на свету, с одной стороны, зависит от

функционального состояния пластоцианина и Р

700

. С другой стороны, он зависит

от активности дыхательных ферментов - ферментов, окисляющих АК:

аскорбатоксидазы, полифенолоксидазы, цитохромоксидазы и пероксидазы. Три

первых фермента у зеленых проростков ингибируются светом, пероксидаза -

активируется. У дефицитных по зеленым пигментам и альбиносных проростков

свет активирует все вышеуказанные ферменты, поэтому одним из факторов,

определяющих светозависимое накопление АК у нормально пигментированных

растений, является ингибирование светом большинства ферментов, ее

окисляющих.

Говоря о действии света на биосинтез АК, нужно иметь в

виду не только

опосредованное его влияние через фотосинтез, дающий субстрат для

образования АК, но и непосредственное его действие в процессе образования

молекулы АК из глюкозы или галактозы. Одной из таких реакций может быть

фотовосстановление предшественника АК [343] или активирование светом l-

гулоно-γ-лактон дегидрогеназы, катализирующей последнюю ступень

биосинтеза АК и являющейся

флавинсодержащим ферментом.

Фонд АК в растениях на свету может пополняться не только за счет

новообразования АК, но и путем фотовосстановления ДАК в АК в хлоропластах.

Остается неясным, возможно ли восстановление ДАК за счет восстановителя,

образующегося в процессе окислительного фосфорилирования. Следовательно,

уровень АК в растениях будет зависеть от направленности процессов в системе

АК↔ДАК. В связи с этим, характеризуя содержание АК в растениях, и особенно

метаболизм данного соединения, необходимо одновременно анализировать

содержание не только АК и ДАК, но и ДКГК, образующейся при необратимой

трансформации ДАК в результате разрыва ее лактонового кольца. ДКГК

растений практически не исследована, хотя это соединение начинает привлекать

себе внимание благодаря выявленному противоопухолевому его действию

[450]. Таким образом, содержание АК в растениях определяется многими

одновременно идущими процессами (рис. 30), и регуляция ее накопления

требует согласованной их работы. Это имеет место не только при нормальном

функционировании растений, но и в стрессовых условиях, которые обычно

сопровождаются усилением биосинтеза и использования АК. Познание

регуляторных механизмов обменных процессов вообще, и в частности

регуляции биосинтеза физиологически активных соединений, таких, как АК,

является актуальным для физиологии растений в связи с перспективой

биотехнологического использования растительных объектов с целью получения

важных для народного хозяйства метаболитов.

Фотосинтез Пероксидаза

Глюкоза НАДФН · Н

Цитохром-

Биосинтез АК оксидаза

Полифенол-

α-кето- оксидаза

глуторат

Аскорбат-

оксидаза

НАДФН · Н

Пул АК ДАК ДКГК

Изоцит- Орг.

рат к-ты Пируват Фотовосстанов-

ление в хлоро-

ЦТК Гликолиз пластах

Г-SH

ОПФП НАДФ · Н

ГS-SГ

Рис. 30. Процессы, формтирующие пул АК в зеленых проростках ячменя,

активируемые ( ) и ингибируемые ( ) светом

Условные обозначения:

Г-SH - глютатион восстановленный; ГS-SГ - глютатион окисленный;

Орг. к-ты - органические кислоты: янтарная и α-кетоглутаровая

108

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Аксенова О.Ф. // Уч. зап. Томского ун-та. 1960. № 36. С. 219-228.

2. Алиева З.Н. // Уч. зап. Азербайджанского ун-та. 1973. № 4. С. 71-75.

3. Алиева З.Н. // Уч. зап. Азербайджанского ун-та. Сер. биол. наук. 1975. № 2. С.62-

65.

4. Андрейчева М., Байлов Д. // Изв. Ин-та растениевъдства Бълг. АН. 1959. Кн. 8. С.

79-87.

5. Астафурова Т

.П., Верхотурова Г.С., Волкова О.В. и др. Вопросы взаимосвязи

фотосинтеза и дыхания / Отв. ред. В.Л. Вознесенский. Томск, 1988. С. 30-36.

6. Бабаян Р.С., Геворкян А.М., Айрапетян Р.Б. и др. // Физиология растений. 1975.

Т. 22. № 3. С. 484-489.

7. Бил. Д., Ноулз Д. Внеядерная наследственность. М.: Мир, 1981. 168 с.

8. Бохински Р. Современные

воззрения в биохимии. М., 1987. 543 с.

9. Букин В.Н. // Биохимия витаминов. М., 1982. С. 107.

10. Бунаков В.А. // Биол. науки. 1960. № 2. С. 144-147.

11. Бухов Н.Г., Воскресенская Н.П. // Физиология растений. 1986. № 4. Т. 33. С.692-

698.

12. Верхотурова Г.С. // Труды НИИ биологии и биофизики при Томском ун-те.

1977. № 8. С. 134-139.

13. Верхотурова Г.С

., Астафурова Т.Н. // Вопросы биологии. Томск, 1978. С. 77-82.

14. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П. // Физиология растений. 1983. Т. 30. № 3.

С.580.

15. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П., Дудина Е.В. // Фотосинтез и

продуктивность растений / Отв. ред. В.Л. Вознесенский. Томск, 1987. С. 39-44.

16. Верхотурова Г.С., Астафурова Т.П., Кудинова Л.И. // Вопросы взаимосвязи

фотосинтеза и дыхания / Отв. ред. В.Л. Вознесенский. Томск, 1988. С. 19-29.

17. Верхотурова Г.С., Кудинова Л.И., Астафурова Т.П. // Физиология растений.

1987. Т. 33. № 2. С. 261-265.

18. Воскресенская Н.П. // Тр. Ин-та физиологии растений АН СССР. 1953. Т. 8.

№ 1. С. 42-55.

19. Воскресенская Н.П. Фотосинтез и спектральный состав света. М.: Наука, 1965.

311 с

20. Воскресенская Н.П. // Фоторегуляция метаболизма и морфогенеза растений /

Отв. ред. А.Л. Курсанов, Н.П. Воскресенская. М., 1975. С. 16-36.

21. Воскресенская Н.П., Мажуль М.М. // Физиология растений. 1976. Т. 23. № 3.

С.483-489.

22. Врублевская К.Г. // Уч. зап. Томского ун-та. 1962. № 44. С. 199-207.

23. Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.М.

Большой практикум по

физиологии растений. М.: Высшая школа, 1975. 392 с.

24. Гапоненко В.И., Николаева Г.Н., Куперман Н.И. // Ботаника. Исследования.

1982. №24. С. 176-183.

25. Гордон Л.Х., Голубев А.И. // Физиология растений. 1976. Т. 23. № 1. С. 107-110.

26. Гофман Э. Динамическая биохимия. М.: Медицина, 1971. 311 с.

27. Гродзинский А.М. // Укр. ботанiчний журн. 1973. Т. 30.

№ 1. С. 28-35.

28. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений: В 2 т. М.: Мир, 1986.

Т. 1. 392 с.