Чупахина Г.Н. Система аскорбиновой кислоты растений
Подождите немного. Документ загружается.
89
В темноте восстановленные на свету ферменты вновь окисляются, и этот
процесс может катализировать окисленный глутатион, также содержащий
дисульфидную группу.
Механизм активации ферментов на свету путем тиол-дисульфидного обмена
не является единственным. Активность ферментов в этих условиях может
усиливаться аллостерическими эффекторами: АТФ и NАДРН - для рибулозо-1,
5-бисфосфат-карбоксилазы, ионами кальция - для N
АД-киназы [61].
Свет может не только менять активность уже имеющихся ферментов, но и
индуцировать их синтез, что показано для глицеральдегид-3-
фосфатдегидрогеназы [454] и фосфоенолпируват-карбоксилазы [189].
Действие света на ферменты катаболиза, и в частности ферменты гликолиза,
пентозофосфатного окислительного пути превращения соединений углерода,
ферменты ЦТК, исследовано в меньшей степени [189, 14, 17, 161].
Изменение ферментативной активности под действием
света зависит от
качества последнего. Кроме того, механизмы контролирования активности
различных ферментов светом одной и той же длины волны могут быть
различны. Так, синий свет способен оказывать прямое действие на активность
фермента, за счет чего может повышаться активность гликолатоксидазы,
глюкозооксидазы и др., или же изменять активность опосредованно, через
изменение уровня
субстратов или эффекторов [380].
Восстановленная форма аскорбиновой кислоты на свету увеличивается
[103]. Объяснение этого факта предполагает анализ активности ферментов, ее
окисляющих: специфической оксидазы АК - аскорбатоксидазы и ферментных
систем, которые опосредованно переводят АК в дегидроформу -
полифенолоксидазы, пероксидазы и цитохромоксидазы. Однако действие света
на эти ферменты исследовано крайне слабо.
Аскорбатоксидаза (КФ. 1.10.3.3) - глобулярный конъюгированный
медьсодержащий
белок. Медь в молекуле фермента находится в смешанном
валентном состоянии: два атома - одновалентные, они не несут ферментативной
функции; шесть - двухвалентные, ответственные за оксидазную активность и
голубую окраску водного раствора очищенного фермента. В молекуле белка
содержится 18 различных аминокислот и гексозамин. Апофермент содержит 10
сульфгидрильных групп. Предполагается, что каталитические функции
осуществляются не только при
обратимом изменении валентности меди, но и
при обратимых структурных изменениях белковой части молекулы фермента.
Аскорбатоксидаза катализирует реакцию окисления:
C
6
H
8
O
6
+ 1/2 О
2
→ С
6
Н
6
О
6
+ Н
2
О.
АК ДАК
Методом ЭПР-спектрометрии было показано возникновение свободных
радикалов АК в этой реакции [452].
Активность фермента угнетается цианидом и диэтилдитиокарбаматом
натрия, который, активно захватывая ионы меди, образует прочный фермент-
ингибиторный комплекс [134].
90
Аскорбатоксидаза обнаружена практически во всех хлорофиллоносных
клетках. Она отсутствует в клубнях картофеля [326], в покоящихся семенах
гороха, но при прорастании последних быстро появляется в осевой части побега
и корня, где увеличивается и изоферментный состав оксидазы [418]. В
гипокотиле маша активность аскорбатоксидазы снижается от апекса к нижним
зонам [256]. Несколько изоформ аскорбатоксидазы обнаружено в тыкве
, однако
в семядолях и гипокотиле горчицы, освещенной дальним красным светом и
находящейся в темноте, присутствует лишь одна изоформа фермента [345]. На
клеточном уровне аскорбатоксидаза ассоциирована с клеточной стенкой и
цитоплазмой [229].
В процессе роста и старения растений аскорбатоксидазная активность
меняется. При снижении интенсивности света за счет общей освещенности и
удалении УФ-излучения
в растениях ячменя и девясила корнеглавого в
онтогенезе активность аскорбактоксидазы понижается [157], что происходит и
при созревании ягод черной смородины [141].
Неодинакова аскорбатоксидазная активность и в течение года: в хвое сосны
с максимального уровня в весенние месяцы - в марте-апреле - она снижается до
минимума в октябре, повторяя ритмический характер накопления АК [240].
Аналогичная закономерность
выявлена у деревьев, теряющих на зиму листья
(конский каштан) или хвою (лиственница), и вечнозеленых (ель) [258]. Наличие
прямой корреляции между содержанием АК и активностью аскорбатоксидазы
показано и для хлопчатника [3].
В работе М.М.Окунцова и А.Н. Плотниковой отмечено, что активность АО в
растениях фасоли хорошо коррелирует с суточными ритмическими движениями
листьев. В дневные часы, когда листья подняты, фермент находится в активном
состоянии; ночью, в темноте, в опущенных листьях окислительные ферменты
переходят в неактивное состояние. Авторы полагают, что активность АО не
зависит от непосредственного влияния света, а связана только с эндогенным
суточным ритмом растения [99].
Как считает Н.Т.Бакарджиева [211], световой режим
выращивания растений
гороха незначительно влияет и на изоферментный состав АО, который в
большей степени определяется наличием в средах выращивания определенного
типа ионов. Так, показано, что ионы меди активировали синтез АО в темновых
растениях.
В литературе имеются данные, указывающие на индукцию светом
активности АО [17]. Особое значение в фотоактивации АО придается дальнему
красному
свету, который значительно повышает активность фермента [364, 238,
196, 360]. Фитохром-зависимая репрессия и индукция ферментативного синтеза
изучена на горчице [364, 210]. Фитохром ускорял синтез АО в семядолях и
гипокотилях и не менял в корнях проростков. Причем активность АО,
появившейся при фитохромной индукции, в гипокотиле была выше, чем в
семядолях [26]. Фитохром, активируя скорость образования фермента, тем
самым увеличивал суммарную активность АО [196].
В исследованиях по фитохромной регуляции синтеза АО показано, что у
проростков горчицы определенное время активность фермента возрастает и в
91
темноте, хотя в меньшей степени, чем на дальнем красном свету. Темновой и
индуцированный светом фермент - один и тот же молекулярный тип [345].
Авторы [360] считают, что появление АО в темноте и на свету - независимые
явления. И можно только предполагать, что наряду с фотоактивацией синтеза
АО в темноте имеет место субстратная стимуляция ферментативного синтеза
,
так как в прорастающих семенах появляется субстрат АО - аскорбиновая
кислота.
Что же касается механизма фотоактивации аскорбатоксидазной активности,
то, признавая факт стимуляции синтеза фермента дальним красным светом и
связывая его с фитохромной регуляцией, стоит отметить, что действие света
других спектральных участков на ферментативную активность АО совершенно
не исследовано. Поэтому в опытах
по изучению действия дальнего красного
света на активность фермента [364, 238, 196], где в качестве контроля
использовались растения, находящиеся в темноте, вероятно, стоило бы вводить
и другой контроль - растения, освещающиеся полихроматическим светом.
Таким образом, учитывая немногочисленные и крайне противоречивые
данные по действию света на активность АО, стоит отметить, что данный вопрос
требует дальнейшего
исследования, которое должно объяснить механизм
световой регуляции активности АО, что в конечном итоге поможет определить
условия, формирующие пул АК на свету.
Помимо прямого окисления АК специфической оксидазой -
аскорбатоксидазой - возможно непрямое окисление при участии гемпротеида -
пероксидазы. Этот фермент способен окислять субстрат за счет кислорода
перекиси водорода, а в отсутствии последней - за счет
молекулярного кислорода.
Предполагается, что обе функции фермента - пероксидазная и оксигеназная -
локализованы в пределах одной субъединицы.
Биосинтез компонентов молекулы пероксидазы имеет различную
локализацию. Апопротеиновая часть синтезируется преимущественно на
гранулярной эндоплазматической сети, гем - в митохондриях, гликозидная
простетическая группа присоединяется к полипептиду в аппарате Гольджи [281].
В клетках листьев и кончиков корней целого ряда
растений активность
пероксидазы связана с клеточными оболочками, вакуолями, плазмодесмами,
ламеллами [290], возможно, и с особыми секреторными органеллами -
пероксидазосомами [127]. Пероксидазы широко распространены среди растений. Наряду с
классической пероксидазой (КФ 1.11.1.7) известны НАД- и НАДФ-пероксидазы,
пероксидаза жирных кислот, глутатионпероксидаза, цитохром-пероксидаза.
Аскорбат пероксидаза окисляет АК до ДАК следующим образом [292]:
1) 2 Н
2
О + 2 НАДФ
+
h
ν
⎯→⎯
2 НАДФН + 2 Н
+
+ О
2
;
2) 2 НАДФН + 2 Н
+
+ ГSSГ → 4 ГSН + 2 НАДФ
+
;
3) 4ГSН + 2 ДАК → 2 ГSSГ + 2 АК;
4) 2 АК + 2 H
2
O
2
→ ДАК + 4 Н
2
О.
Пероксидаза АК встречается в хлоропластах и в цитозоле, но в
митохондриальной и микросомальной фракциях отсутствует [429]. У хлореллы
92
это основной фермент окисляющей АК, так как АК-аза у нее не обнаружена
[403]. Молекула пероксидазы поглощает свет определенной длины волны; так,
пероксидаза хрена в растворе имеет поглощение при 645, 583 и 498 нм, а также
наиболее выраженное при 410-430 нм (линия Соре). После восстановления
остаются линия Соре и поглощение при 594 и 586 нм. Взаимодействие с
перекисью водорода ведет к образованию промежуточных компонентов (их
четыре типа), которые обладают различными спектральными характеристиками
[134].
Обладая собственным поглощением, молекула пероксидазы должна быть
чувствительна к действию радиации. При светоимпульсном облучении семян
растений меняются физиологические и биохимические параметры растений, они
приобретают колебательный характер. Механизм обнаруженных колебательных
процессов, как показал Б.Г. Явишев [190],
связан с активностью пероксидазы, а
кроме этого - с синхронными изменениями SН ↔ S = S перехода. Обнаружено
обратимое смещение в спектре ЯМР трех линий S- и N-содержащих групп
глутатиона.
Реакция на освещение пероксидазы различных видов растений, как
показывают литературные данные, неоднозначна. Активность фермента на свету
резко уменьшалась в стеблевой части гибридных проростков пшеницы [226] и в
молодых проростках гороха, растущих при избытке Zn и Mn [212]. Замедление
роста стебля гороха при освещении красным светом также сопровождалось
падением активности пероксидазы [124]. В листьях риса, напротив, освещение
после темноты вызывало подъем активности фермента, а в темноте она
снижалась [373], так же, как и в листьях ячменя [399]. Имеются и другие данные
о стимуляции активности
пероксидазы белым светом [423].
Показана фитохромная регуляция активности пероксидазы кукурузы.
Красный свет увеличивал активность фермента на 50-70% (5мин, 500 мкВт ⋅ см
-2
⋅
с
-1
), эффект красного света был обратим дальним красным светом. При
продолжительном (24 часа) освещении дальним красным светом наблюдалась
стимуляция активности пероксидазы за счет синтеза фермента [401].
Механизм действия красного света на пероксидазную активность
представляется следующим образом: под действием красного света в растениях
синтезируется флавоноид кемпферол, который в качестве монофенольного
кофактора стимулирует ферментативную активность [254].
В работе [359] объясняется механизм фотоактивации пероксидазы
инфракрасным светом. Установлено, что при прямом освещении верхних
листьев шпината в них активировались щелочные пероксидазы. Активность
повышалась и в затемненных верхних листьях, если начинали освещать нижние
листья; ответ наблюдался через 1,5 минуты. Наблюдаемый эффект
инфракрасного света, по мнению исследователей, связан с изменениями
мембранного аппарата. Коротковолновое УФ
-облучение 254 нм вызывало повышение активности
растворимой и связанной ионными силами пероксидазы в листьях фасоли [223].
Таким образом, наряду с изучением действия белого света на пероксидазную
активность предпринимается исследование света более узких спектральных
93
участков с попыткой объяснения механизма их действия. Что же касается других
ферментов, участвующих в непрямом окислении АК, в частности
полифенолоксидазы (КФ 1.10.3.1), то вопрос о действии света на ее активность
практически не исследован, хотя изучение субклеточной локализации фермента
показало его присутствие в хлоропластах [299, 337]. Полифенолоксидаза
локализована в тилакоидных мембранах хлоропластов и других пластид
растений, но белок ее кодируется ядерным геномом. Предполагается, что все
пластиды содержат полифенолоксидазу, активность которой с возрастом
растений имеет тенденцию к увеличению [113], и хотя фермент относится к
числу широко распространенных, функция его недостаточно ясна. Возможно,
она связана с реакцией Мелера в хлоропластах и с созданием в них
"кислородного буфера" [440].
Что
касается цитихромоксидазы (КФ 1.9.3.1), которая наряду с
полифенолоксидазой участвует в непрямом окислении АК, то показана ее
определенная реакция на освещение. В листьях пшеницы на свету (10 минут)
значительно повышался стационарный уровень восстановленной
цитохромоксидазы, что связывается с уменьшением на свету энергизации
митохондрий и значительным уменьшением в них НАД
+
. В хорошо
сопряженных митохондриях в темноте при стационарном уровне дыхания
цитохромоксидаза находилась в более окисленном состоянии [347].
Цитохромоксидаза присутствует в хлоропластах [134], в бесхлорофилльных
тканях ее активность резко снижена. В связи с этим предполагается, что в
альбиносных тканях доля участия в дыхании цитихромоксидазы снижается, а
окисление дыхательных субстратов осуществляется при участии иных
ферментных систем [136]. По другим данным [419], активность цитохром-с-
оксидазы зеленых и неокрашенных листьев была близкой.
Таким образом, вопросы, касающиеся действия света на ферменты,
окисляющие АК, начинают привлекать внимание исследователей, но они еще
далеки от окончательного решения. Изучение их является необходимым не
только для выяснения условий и механизмов, формирующих пул АК на
свету,
но также и для решения более общих проблем взаимосвязи фотосинтеза и
дыхания. В связи с этим в своей работе мы изучали действие
полихроматического света на активность АО, пероксидазы, полифенолоксидазы
и цитохромоксидазы, а для пероксидазы - и монохроматического синего,
зеленого, красного света в проростках ячменя с различной пигментацией с тем,
чтобы
обсудить вопрос о возможных фоторецепторах светозависимых
процессов, а в конечном итоге попытаться объяснить механизм действия света
на указанные ферменты [179]. Действие света на активность АО изучалось в опытах с 7-9-дневными
зелеными, этиолированными и альбиносными проростками ячменя, в которых
определялась исходная активность фермента, уровень ее после суточного
пребывания растений в темноте и последующего
двухчасового освещения.
Оказалось, что начальный уровень активности АО значительно отличается у
проростков с различной пигментацией: минимальным он был у зеленых
проростков, максимальным - у альбиносных (табл. 27).
94
Таблица 27
Влияние условий освещения на активность аскорбатоксидазы в 8-дневных
проростках ячменя (интенсивность света 30 тыс. эрг
⋅ см
-2
⋅ с
-1
)
Вариант опыта Активность аскорбатоксидазы в проростках в единицах
падения оптической плотности, ΔД
Зеленые Этиолированные Альбиносные
Исходная активность
2,58 ± 0,18 3,65 ± 0,18 4,89 ± 0,14
24 часа темноты
5,54 ± 0,10 3,55 ± 0,10 7,85 ± 0,02
+ 2 часа света
4,84 ± 0,12 4,65 ± 0,17 9,58 ± 0,36
Выдерживание в темноте в течение 24 часов повысило активность фермента
у зеленых растений более чем в два раза и в несколько меньшей степени (в 1,6
раза) у альбиносов. У этиолянтов, для которых условия освещения в данном
варианте опыта не изменились, активность фермента осталась на прежнем
уровне. Последующее двухчасовое освещение проростков, предварительно
выдержанных в
темноте, снизило активность АО у зеленых растений и
стимулировало у проростков, лишенных зеленых пигментов.
- темнота
95
- свет (30 тыс. эрг ⋅ см
-2
⋅ с
-1
)
Рис. 21. Влияние условий освещения на активность аскорбатоксидазы
в зеленых проростках ячменя
Характер светозависимых изменений активности АО при более длительной
(24 часа) световой экспозиции представлен на рис. 21-23. Опытные зеленые и
альбиносные проростки перед освещением помещались в темноту на 24 часа;
этиолянты, напротив, затемнялись после освещения. Активность фермента
определялась через каждые 2 часа в течение первых 12 часов пребывания
растений на свету или в темноте, а затем
в конце 24-часовой экспозиции.
У зеленых растений (рис. 21), помещенных в темноту, резко возросла
активность АО. Этот подъем продолжался в течение 4 часов, в последующие 4
часа активность фермента снижалась, значительно не доходя до исходного
уровня. Дальнейшее присутствие проростков в темноте (от 10 до 12 часов)
стабилизировало активность фермента, и этот уровень сохранялся в следующие
12 часов. После темновой экспозиции опытные растения сутки находились на свету. В
течение первых 6 часов освещения активность фермента снизилась почти до
исходного уровня и после небольшого подъема через 8 часов поддерживалась на
одном уровне до конца опыта.
9
6
- темнота
- свет (30 тыс. эрг ⋅ см
-2
⋅ с
-1
)
Рис. 22. Влияние условий освещения на активность аскорбатоксидазы
в этиолированных проростках ячменя
В этиолированных проростках (рис. 22) в первые 2 часа освещения
активность повысилась, но в оставшееся до конца световой экспозиции время
была значительно ниже исходной. Последующее затемнение растений
стимулировало фермент, и через 7 часов его активность достигала исходного
значения. Подъем продолжался в течение 10 часов, однако в дальнейшем
ферментативная активность стала снижаться и почти приблизилась к
исходному
уровню через 24 часа. Следует отметить, что через два часа прозеленения
этиолированных проростков их реакция на освещение стала такой же, как у
зеленых растений: свет ингибировал активность АО, темнота - стимулировала.
Иной была реакция на освещение АО альбиносных проростков (рис. 23), у
которых активность фермента повышалась не только в темноте, но еще
в
большей степени при освещении. Причем при смене условий освещения в
первые 6-8 часов опыта отмечался резкий подъем активности фермента, в
дальнейшем она стабилизировалась и поддерживалась на одном уровне до конца
световой или темновой экспозиции.
9
7
- темнота
- свет (30 тыс. эрг ⋅ см
-2
⋅ с
-1
)
Рис. 23. Влияние условий освещения на активность аскорбатоксидазы
в альбиносных проростках ячменя
Таким образом, реакция на освещение АО проростков ячменя в
значительном степени зависит от состояния пигментного аппарата
анализируемых растений, а в конечном итоге, вероятно, от функционирования
того или иного энергетического процесса - фотосинтеза или дыхания.
Действие света на активность цитохромоксидазы исследовалось в опытах с
6-дневными проростками ячменя с различной пигментацией (рис. 24), у
которых
ферментативная активность определялась до и после 24-часовой темновой
экспозиции. В темноте значительно повысилась активность цитохромоксидазы в
зеленых проростках и в меньшей степени, но статистически достоверно,
снизилась в этиолированных и альбиносных. Реакция на 4-часовое освещение
растений, предварительно находившихся сутки в темноте, была неоднозначной:
в зеленых проростках на свету активность цитохромоксидазы резко
снизилась,
тогда как в этиолированных и альбиносных - возросла. Следует отметить, что во
всех вариантах опыта уровень активности цитохромоксидазы оставался самым
высоким у альбиносов, самым низким - у зеленых растений.
98
- темнота
- свет
Рис. 24. Влияние условий освещения на активность цитохромоксидазы в зеленых (1),
этиолированных (2) и альбиносных (3) проростках ячменя (в усл. единицах)
Действие света на активность полифенолоксидазы представлено на рис. 25.
В зеленых, этиолированных и альбиносных проростках, находившихся сутки в
темноте, активность фермента медленно нарастала. Включение света резко
изменило скорость процесса, причем если у этиолированных и альбиносных
проростков активность полифенолоксидазы продолжала увеличиваться еще с
большей скоростью, то у зеленых проростков она быстро снизилась.
- темнота
- свет (30 тыс. эрг ⋅ см
-2
⋅ с
-1
)
Рис. 25. Влияние условий освещения на активность полифенолоксидазы (ΔД, с/г)
в зеленых (1), этиолированных (2) и альбиносных (3) проростках ячменя