Біотехнологія 2008 Том 1, №3

Подождите немного. Документ загружается.

Експериментальні статті

тату в середовище з етанолом або використо

вуючи посівний матеріал, вирощений на

ацетаті чи етанолі у присутності ацетату.

Встановлено, що додавання екзогенного аце

тату під час одержання інокуляту і біосинте

зу ЕПС дало змогу збільшити у 2,5−3 рази

активність ацетилКоАсинтетази та швид

кість дихання за присутності ацетату і реа

лізувати процес синтезу етаполану на неза

буферених середовищах 3 і 5, в яких

загальний вміст солей було знижено у 2 і 4

рази (до 5,1–2,95 г/л) [25].

Умови культивування продуцента впли

вають не тільки на синтез ЕПС, а й на фізи

кохімічні властивості кінцевого продукту

[26]. У різних умовах культивування мо

жуть змінюватися хімічний склад ЕПС,

їхня молекулярна маса, співвідношення

декількох полісахаридів, що впливає на ре

ологічні властивості ЕПС, які визначають

практичну значущість цих полімерів. Рані

ше було з’ясовано, що необхідною умовою

для синтезу ацильованого полісахариду

є наявність у середовищі культивування

продуцента етаполану 100 мМ К

[1]. Вста

новлено, що тільки етаполан з високим

вмістом ацильованого компонента (>50%)

характеризувався сукупністю реологічних

властивостей, необхідних для практичного

використання. Оскільки вміст К

у середо

вищах 3 і 5 становить 40 та 20 мМ відповід

но, на наступному етапі досліджували рео

логічні властивості синтезованого за таких

умов етаполану. Згідно з попередніми дани

ми такої концентрації К

недостатньо для

синтезу ацильованого ЕПС з необхідними

реологічними властивостями.

Результати дослідження, що їх наведено

в табл. 4, свідчать, що ЕПС, синтезовані на

середовищах з різним вмістом К

, мають

практично однакові реологічні характерис

тики. Отже, культивування продуцента на

незабуференому середовищі з низьким

вмістом солей (і катіонів калію) не впливало

на властивості синтезованого етаполану.

Для з’ясування причин, що зумовлюють це

явище, ми детальніше дослідили хімічний

склад одержаних полісахаридів.

Встановлено, що незалежно від умов

культивування продуцента (вміст мінераль

них компонентів, співвідношення С/N і мо

лярність буфера в середовищі культивування)

нативні ЕПС характеризувалися практично

однаковим вмістом вуглеводів (44,5−46,7%)

та піровиноградної кислоти (3,2−3,7%)

(табл. 5). Співвідношення глюкози, манози,

галактози та рамнози у складі всіх ЕПС було

однаковим і становило 3:2:1:1.

торами ацетилКоАсинтетази є іони натрію,

а також продукти окиснення етанолу й аце

тальдегіду — НАДН і НАДФН; активатора

ми ферменту є катіони калію і магнію [23].

Виходячи з отриманих результатів ми

припустили, що одним із можливих шляхів

регуляції метаболізму ацетату в клітинах

штамів В7005 і В7005 (1НГ) під час росту

на етанолі може бути вилучення Nа

із сере

довища культивування і підвищення в ньо

му концентрації К

і Мg

. Для усунення

інгібувального впливу інтермедіатів окис

нення етанолу й ацетальдегіду на актив

ність ацетилКоАсинтетази було знижено

початкову концентрацію етанолу в середо

вищі з подальшим додаванням його части

нами у процесі культивування бактерій. По

казано, що в разі зниження у два рази

концентрації етанолу (до 0,5 %) спостеріга

лось підвищення швидкості дихання клітин

за присутності ацетату, причому її величина

практично не відрізнялася від швидкості

окиснення етанолу й ацетальдегіду. Окрім

того, швидкість окиснення ацетату істотно

не змінювалась у процесі тривалого голоду

вання клітин. Слід зазначити, що за почат

кової концентрації етанолу 0,5 % у середо

вищі вміст пантотенату кальцію можна було

знизити до 0,0006 %, при цьому не було пот

реби підвищувати концентрацію Mg

У табл. 3 наведено активність ключових

ферментів метаболізму етанолу у штаму

Acinetobacter sp. В7005, вирощеному за різ

них умов культивування. Встановлено, що зі

зниженням початкової концентрації етанолу

в середовищі, за відсутності сполук натрію

і наявності 100 мМ К

активність ацетил

КоАсинтетази підвищувалася більш ніж у два

рази. За таких умов стала можливою ре

алізація процесу біосинтезу етаполану на не

забуферених середовищах 4 і 6 (0,025−0,125

М). Отримання аналогічного результату при

початковій концентрації етанолу 1,0% забез

печувало підвищення вмісту вітаміну В

в се

редовищі до 0,0009%, концентрації Mg

— до

5 мМ і катіонів калію — до 100 мМ.

Таким чином, у результаті досліджень

регуляції активності ацетилКоАсинтетази

нам вдалось істотно знизити молярність бу

фера зі збереженням вмісту солей у середо

вищі культивування, що тільки частково

усувало лімітування С

метаболізму у про

дуцента етаполану.

Відомо, що ацетилКоАсинтетаза є інду

цибельним ферментом, індуктором якого

є ацетат [24]. У зв’язку із цим ми припусти

ли, що можна повністю зняти лімітування

метаболізму внесенням екзогенного аце

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

середовищах 3 і 5, зумовлено зменшенням

кількості одновалентних катіонів (зокрема ка

тіонів калію) у цих середовищах. Так, раніше

нами було встановлено, що у процесі культиву

вання продуцента етаполану відбувається

структурування синтезованих ЕПС катіонами,

що містяться у живильному середовищі [1].

Проте полісахариди різнилися за кіль

кістю уронових (7,5−13,8 %), жирних (5,9−

8,8%) кислот, мінеральних компонентів

(6,2−28,6 %), а також за вмістом ацильованого

компонента (70−100 %). Ми припускаємо,

що зниження вмісту мінеральних компо

нентів у складі етаполану, синтезованого на

Таблиця 3. Вплив умов культивування Acinetobacter sp. ВK7005 на активність

ключових ферментів метаболізму етанолу

Примітка. Культивування бактерій здійснювали на середовищі 2 (у середовищі відсутні сполуки Nа

вміст К

— 100 мМ).

Умови культивування Активність, нмоль

хв

–1

мг

–1

білка

концент

рація В

, %

концент

рація Мg

мМ

початкова

концент

рація ета

нолу, %

НАД

залежна

алкоголь

дегідрогеназа

НАД

+НАДФ



залежна аль

дегіддегідрогена

за

ацетилКоА

синтетаза

ізоцит

ратліаза

0,0006 1,6 1,0 354,8±17,7 367,3±21,2 95,0±5,6 98,4±6,3

0,0009 1,6 1,0 349,9±22,9 356,7±24,4 130,9±7,6 130,0±7,9

0,0009 5,0 1,0 359,6±17,9 349,7±24,0 180,9±9,6 185,4±11,8

0,0009 1,6 0,5 265,9±16,1 277,9±15,4 219,8±11,0 225,4±13,8

0,0006 1,6 0,5 279,4±13,9 285,7±19,0 225,3±15,2 230,7±15,5

Таблиця 4. Реологічні властивості 0,03%Kх

розчинів етаполану, синтезованого за різних умов культивування

Примітка. Концентрація етанолу 1 %; у середовища 3 і 5 додатково вносили 0,1 % ацетату калію для

одержання інокуляту і біосинтезу ЕПС.

Таблиця 5. Хімічний склад нативного і дезацильованого етаполану,

синтезованого на середовищах різного складу

Примітки: 1. Концентрація етанолу 1 %; у середовище 5 додатково вносили 0,1% ацетату калію для

одержання інокуляту і біосинтезу ЕПС.

2. « – » — не визначали.

3. Дезацильований ЕПС одержано в результаті лужного оброблення нативного препарату.

Середовище

Концентрація К

у середовищі, мМ

Відносне збільшення в’язкості, %

за присутності 0,1 М KCl у системі Cu

гліцин

2 100 325,7±21,0 1400,3±78,0

3 40 480,3±35,2 1865,0±93,2

5 20 315,6±18,8 1700,5±100,5

Компонентний склад ЕПС ЕПС

Вміст складових компонентів (%) в ЕПС,

синтезованих на середовищах

1235

Вуглеводи

нативний 44,5 45,0 46,7 45,9

після дезацилювання 60,0 59,1 58,6 55,7

Піровиноградна кислота

нативний 3,3 3,7 3,4 3,2

після дезацилювання 4,8 4,4 4,7 4,8

Уронові кислоти

нативний 7,5 7,7 11,4 13,8

після дезацилювання 20,0 22,0 20,6 –

Жирні кислоти

нативний 6,5 6,8 8,8 5,9

після дезацилювання 0000

Мінеральні компоненти

нативний 24,3 28,6 7,2 6,2

після дезацилювання 3,5 3,9 – –

Експериментальні статті

Таким чином, на основі досліджень особ

ливостей метаболізму у штаму Acinetobacter

sp. В7005 і В7005 (1НГ) визначено шляхи

регуляції С

метаболізму, що уможливило

вдосконалення технології біосинтезу етапо

лану на етанолі. Ключовими елементами цієї

технології є: відсутність у середовищі куль

тивування катіонів натрію, підвищення

в ньому концентрації пантотенату кальцію

до 0,0009%, а також наявність 0,1% ацетату

калію під час одержання інокуляту і біосин

тезу полісахариду. Це дало змогу здійснити

без зниження показників синтезу процес

одержання етаполану на незабуференому сере

довищі, в якому вміст солей зменшено в 4 рази

(з 11 до 2,95 г/л). За умов усунення ліміту

вання С

метаболізму молекулярна маса ета

полану становила 1,5 млн. і не знижувалась

у процесі його виділення й очищення, а вміст

жирних кислот в ацильованому полісаха

риді досягав 15%. Підвищений вміст жир

них кислот у складі етаполану і висока мо

лекулярна маса зумовлюють поліпшення

реологічних властивостей, що визначають

практичну цінність цього полісахариду.

Після дезацилювання нативних ЕПС

вміст уронових кислот збільшувався у 2−3 ра

зи і становив 20−22 % для всіх досліджува

них полісахаридів (табл. 5). У попередніх

роботах було з’ясовано, що реальний вміст

уронових кислот у складі нативних ЕПС

вдається виявити тільки після їх дезацилю

вання [1]. Підвищення вмісту уронових кис

лот у цьому разі можна пояснити тим, що

під час дезацилювання відбувається ди

соціація високомолекулярних конгломе

ратів ЕПС, змінюється конформація поліса

харидних молекул і просторова структура

ЕПС, внаслідок чого уронові кислоти стають

доступнішими для взаємодії з різними реа

гентами. Варто зазначити, що після дезаци

лювання у складі етаполану суттєво знижу

вався вміст мінеральних компонентів. На

сьогодні причини, що зумовлюють це яви

ще, залишаються невідомими. На з’ясуван

ня цих причин буде спрямовано наші по

дальші дослідження.

Дослідження молекулярної маси етапо

лану, синтезованого за різних умов культи

вування, показало, що середня молекулярна

маса полісахаридів, одержаних на середови

щах 3 та 5, практично не змінювалась у про

цесі виділення й очищення і становила 1,5 млн.

(табл. 6). Це можна пояснити тим, що одер

жані полісахариди є високоацильованими,

а в результаті ацилювання вуглеводного

ланцюга формується щільна структура

ЕПС, яка залишається без змін у процесі об

роблення розчинів етаполану органічними

розчинниками. Слід зазначити, що аналіз

молекулярномасового складу етаполану,

синтезованого в різних умовах культивуван

ня, показав наявність компонентів з моле

кулярною масою від 13,5 тис. до 2 млн., при

чому основну масу препарату становили

фракції з молекулярною масою понад 2 млн.

У попередніх дослідженнях встановлено,

що тільки високомолекулярному етапола

ну, у складі якого міститься не більше 35%

фракцій з молекулярною масою до 2 млн.,

притаманні необхідні для практичного ви

користання реологічні властивості [1].

Дослідження реологічних властивостей

ЕПС показало, що розчини етаполану, син

тезованого на середовищі 5 з 20 мМ К

, на

всіх етапах його виділення й очищення ха

рактеризувалися вищою в’язкістю у присут

ності 0,1 М КСl і в системі Cu

–гліцин

(1 200 та 1 500−2 000% відповідно) порівня

но з ЕПС, синтезованими на середовищі зі

100 мМ К

(1 000 та 800−1 000% відпо

відно).

Таблиця 6. Молекулярна маса етаполану,

синтезованого за різних умов культивування

Примітка. Концентрація етанолу 1 %; у середо

вище 5 додатково вносили 0,1% аце

тату калію для одержання інокуляту

і біосинтезу ЕПС.

Се

редо

ви

ще

Випарений кон

центрат ЕПС

ЕПС після осаджен

ня і висушування

серед

ня мо

леку

лярна

маса,

млн.

фракції

з молеку

лярною ма

сою до

2 млн., %

середня

молеку

лярна

маса,

млн.

фракції

з молеку

лярною ма

сою до

2 млн., %

1 1,44 31,7±2,19 0,48 82,7±4,89

2 1,44 29,9±1,92 0,50 71,2±3,56

3 1,61 23,7±1,59 1,54 25,7±1,80

5 1,57 25,4±1,27 1,48 27,8±1,39

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

terium Phormidium laminosum // J. Bacte

riol. — 1988. — V. 170, N10. — P. 4897− 4902.

14. Nakamura I., Ohmura Y., Kamihara T.

Effect of thiamininduced vitamin B

defi

ciency on NAD and NADPlinked glutamate

dechydrogenases in Yeast // J. Gen. Micro

biol. — 1983. — V. 129, №4. — P. 945−952.

15. Bredford M. A rapid sensitive method for

the quantitation of microgram quantities of

protein utilizing the principle of proteindye

binding // Anal. Biochem. — 1976. — 72,

N3. — P. 248− 254.

16. Пирог Т. П., Гринберг Т. А., Пинчук Г. Э. и др.

Разделение экзополисахаридов, синтезиру

емых Acinetobacter sp., на ацилированный и

неацилированный компоненты // Микроби

ология. — 1994. — Т.63, № 5. — С.840−846.

17. Dubois M., Gilles K., Hamilton J. et al.

Colorimetric method for determination of

sugars and related substances // Anal.

Chem. — 1956. — V.28, N3. — P. 350−356.

18. Sloneker J. N., Orentas D. G. Pyruvic acid —

a unique component of an exocellular bacter

ial polysaccharide // Nature. — 1962. —

V.194, N4827. — P. 47 8−479.

19. Dische Z. A new specific color reaction of

hexuronic acids // J. Biol. Chem. — 1947. —

V.167, N1. — P. 189−198.

20. Votselko S. K., Pirog T. P., Malashenko Y. R.,

Grinberg T. A. A method for determining the

massmolecular composition of microbial

exopolysaccharides // Microbiol. Methods. −

1993. — V. 18. — P. 349−356.

21. Пирог Т. П., Соколов И. Г., Кузьминская Ю. В.,

Малашенко Ю. Р. Некоторые особенности

метаболизма этанола у мутантного штам

ма Acinetobacter sp., не образующего экзо

полисахариды // Микробиология. —

2002. — Т.71, № 2. — С. 222− 229.

22. Пирог Т. П., Кузьминская Ю. В. Особеннос

ти центрального метаболизма штамма

Acinetobacter sp, растущего на этаноле //

Там же. — 2003. — Т.72, № 4. — С. 459–465.

23. Пирог Т. П., Кузьминская Ю. В. Регуляция

метаболизма ацетата у штамма Acinetobac/

ter sp., растущего на этаноле // Прикл. био

хим. и микробиол. — 2003. — Т. 39,

№2. — С. 180−188.

24. Kumari S., Beatty C. M., Browning D. F. et al.

Regulation of acetyl coenzyme A synthetase

in Escherichia coli // J.Bacteriol. — 2000. —

V. 182, N15. — P. 4173−4179.

25. Пирог Т. П., Корж Ю. В. Влияние ацетата

на синтез экзополисахарида этаполана при

культивировании Acinetobacter sp. В7005

на среде с этанолом // Мікробіол.журн.–

2006. — Т.68, № 5. — С. 12− 19.

26. Пирог Т.П., Кузьмінська Ю.В. Вплив умов

культивування мікроорганізмівпроду

центів екзополісахаридів на їхній синтез

та фізикохімічні властивості // Біополімери

і клітина. — 2003. — Т. 19, № 5. — С. 393−413.

1. Пирог Т. П. Принципы регуляции состава и фи

зикохимических свойств экзополисахаридов,

синтезируемых Acinetobacter sp.: Дисс. ... докт.

биол.наук: 03.00.20.− К., 1999. — 450 с.

2. Гринберг Т. А., Пирог Т. П., Малашенко Ю. Р.,

Пинчук Г. Э. Микробный синтез экзополи

сахаридов на С

−С

соединениях. — К.: На

ук. думка, 1992. — 212 с.

3. Пирог Т. П., Столяр С. М., Малашенко Ю. Р.

Получение и исследование мутантных

штаммов Acinetobacter sp., не образующих

экзополисахариды // Микробиология. —

2000. — Т.60, № 5. — С. 674−680.

4. Пирог Т. П., Кузьмінська Ю. В., Коваленко М. О.

Метаболізм С

−С

субстратів в умовах

міксотрофного росту штамів Аcinetobacter

sp. В7005 та В7005 (1НГ) // Укр. біохім.

журн. — 2004. — Т.76, № 1. — С. 33−38.

5. O’Brien R. W., Stern J. R. Requirement for

sodium in the anaerobic growth of Aerobacter

aerogenes on citrate // J. Bacteriol.

— 1969. —

V.98, N2. — P. 388−393.

6. O’Brien R. W., Geisler J. Citrate metabolism

in Aerobacter cloacae // Ibid. — 1974. —

V. 119, N3. — P. 661−665.

7. Kornberg A. Isocitric dehydrogenase of yeast

(DPN) // Methods in enzymology (Ed.

Colowick S.P. and Kaplan N.O.). — New York:

Acad. Press, 1955. — V. 1. — P. 707–709.

8. Kitto G.B. Intra and extramitochondrial

malate dehydrogenase from chiken and tuna

heart // Methods in enzymology (Ed.

Lowenstein J.M.).− New York and London:

Acad. Press, 1969. — V. 13. — P. 106− 116.

9. Johnson H. S., Hatch M. D. Properties and

regulation of leaf nicotinamideadenine din

ucleotide phosphatemalate dehydrogenase

and «malic» enzyme in plants with the C



dacarboxylic acid pathway of photosynthesis

// Biochem. J. —1970. — V.119, N2. —

P. 273−280.

10. Mukherjee B. B., Matthews J., Horney D. L.,

Reed L.J. Resolution and reconstitution of

the Escherichia coli ketoglutarate dehydro

genase complex // J. Biol. Chem. — 1965. —

V. 240, N5. — P. 2268− 2269.

11. Cooper R. A., Cornberg H. L. Phosphoenolpy

ruvate synthetase // Methods in enzymology

(Ed. Lowenstein J.M.). − New York: Acad.

Press, 1969. — V. 13. — P. 309− 314.

12. Huei/Che Chang, Lane M. D. The enzymatic

carboxylation of phosphoenolpyruvate. II. Pu

rification and properties of liver mitochondrial

phosphoenolpyruvate carboxykinase // J. Biol.

Chem. — 1966. — V. 241, N10. — P. 2413−2420.

13. Martinez/Bilbao M., Martinez A., Urkijo I.et

al. Induction, isolation and some properties

of the NADPHdependent glutamate dehydro

genase from the nonheterocystous cyanobac

ЛІТЕРАТУРА

Експериментальні статті

IMPROVEMENT OF BIOTECHNOLOGY OF

MICROBIAL EXOPOLYSACCHARIDE

ETHAPOLAN ON ETHANOL

T. P. Pirog, Ju. V. Korzh

Zabolotny Institute of Microbiology

and Virology of National Academy of Science

of Ukraine, Kiev

E/mail: tapirog@usuft.kiev.ua

The study is devoted to investigating of the

basic stages of С

compounds assimilation in

Аcinetobacter sp. В7005, to reveal «bottleneck»

of С

metabolism and to develop of approaches to

their removal to improve process of microbial

exopolysaccharide ethapolan synthesis.

Limitation of ethanol metabolism in Acinetobacter

sp. В7005 by the rate of acetate assimilation in

a reaction catalyzed by acetylCoAsynthetase,

was shown. Basing on the investigations of

metabolism regulation the cultivation condi

tions were developed which allowed to increase

the acetylCoAsynthetase activity in Acineto/

bacter sp. В7005.

Ethapolan synthesized under these condi

tions was characterized by high level of acyla

tion (3−15%). Molecular mass of this polysac

charide was 1,5 million and was not changed

during purification. Improved reological proper

ties of ethapolan were associated with high mol

ecular mass and increasing fatty acids content.

Key words: exopolysaccharides, biosynthesis, metab

olism of ethanol, regulation of C

metabolism, physi

cal and chemical properties.

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ БИОТЕХНОK

ЛОГИИ МИКРОБНОГО ЭКЗОПОЛИСАХАK

РИДА ЭТАПОЛАНА НА ЭТАНОЛЕ

Т. П. Пирог, Ю. В. Корж

Институт микробиологии и вирусологии

им. Д. К. Заболотного

НАН Украины, Киев

E/mail: tapirog@usuft.kiev.ua

Определены особенности энергетического

и конструктивного метаболизма С

субстратов

у Acinetobacter sp. В7005 — продуцента экзо

полисахарида этаполана, выявлены сайты ме

таболического лимитирования и разработаны

подходы к их устранению.

Показано, что «узким» местом метаболиз

ма этанола в Acinetobacter sp. В7005 является

ассимиляция ацетата: реакция, катализируе

мая ацетилКоАсинтетазой, — скоростьлими

тирующая. Установлены условия культивиро

вания бактерий, позволяющие устранить

лимитирование С

метаболизма и повысить

в три раза активность ацетилКоАсинтетазы.

В таких условиях синтезируется высокоа

цилированный этаполан со степенью ацилиро

вания 3−15%. Средняя молекулярная масса

полисахарида составляет 1,5 млн. и не изменя

ется в процессе выделения и очистки препара

та. Повышенное содержание жирных кислот и

молекулярная масса этаполана обусловливают

улучшение реологических свойств его раство

ров, определяющих практическую ценность

этого полисахарида.

Ключевые слова: экзополисахариды, биосинтез,

метаболизм этанола, регуляция С

метаболизма,

физикохимические свойства.

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

Нами запропоновано культуру тканин

E. plantagineum як джерело сировини для

отримання червоних шиконінових пігмен

тів. Перспективним є розроблення промис

лової біотехнології одержання шиконінових

похідних.

Матеріали і методи

Насіння. Для проведення досліджень ви

користано насіння E. plantagineum урожаю

2003 р., отриманого з колекції Національно

го ботанічного саду ім. М. М. Гришка НАН

України (м. Київ).

Знезаражування. Знезаражування на

сіння проводили за допомогою хлоровмісної

рідини «Купава» та етилового спирту за та

кою методикою: насіння заливали 25%м

розчином «Купави» з додаванням поверхнево

активної речовини TWEEN (0,2 мл на 100 мл)

для кращого змочування насіння. Знезара

жування тривало 20 хв за постійного перемі

шування. Насіння тричі відмивали стериль

ною дистильованою водою і переносили

в 96%й C

ОН на 2 хв, після чого ще двічі

відмивали дистилятом. Далі в стерильних

умовах насіння переносили в маленькі про

бірки з живильним середовищем (по одній

насінині) для проростання.

Культивування. Культуру тканин отри

мували з насіннєвих проростків на агаризо

Синяк подорожниковий — Echium plan/

tagineum L. ( E. licopsis L.) належить до ро

дини Boraginaceae, представники якої здав

на привертають увагу як лікарські, барвні,

алкалоїдовмісні, глікозидовмісні, вітамінні,

ефіроолійні, кормові, харчові та декора

тивні рослини [1].

E. plantagineum — трав’яниста рослина

дворічник, 20–60 см заввишки. Зростає пе

реважно в Криму, на Кавказі та Західному

Закавказзі. Підземна частина рослини міс

тить від 0,17 до 0,35% червоного пігменту

шиконіну [2]. Шиконін та його похідні здав

на використовували на Сході як найцінні

ший червоний барвник (технічний, харчо

вий, косметичний), що виявляє й лікарські

властивості [3, 4]. Рослинні пігменти фе

нольного походження нетоксичні та перс

пективні для використання їх як дефіцитних

природних харчових червоних барвників,

оскільки застосовувані наразі антоціани

є нестійкими. Синтетичні ж сполуки визна

но шкідливими [5].

Природна рослинна сировина для одер

жання нафтохінонових пігментів у промис

лових масштабах в Україні відсутня. Ши

конін японського виробництва, що його

одержують із культури тканин горобинника

червонокореневого, є досить дорогим. Ціна

його на світовому ринку сягає 4 500 дол.

США за 1 кг.

УДК 581.143.6:576.5+663.1

ОДЕРЖАННЯ КУЛЬТУРИ ТКАНИН

СИНЯКА ПОДОРОЖНИКОВОГО

(

Echium plantagineum

L.) — ПРОДУЦЕНТА

ШИКОНІНОВИХ ПІГМЕНТІВ

Одержано культуру тканин E. plantagineum із корінців насіннєвих проростків на агаризованому живильно

му середовищі 5С01. Культивування на живильному середовищі LSм ініціювало біосинтез червоних шиконіно

вих пігментів. Відселектовано варіант калюсної культури (3Ер), що накопичує 2,11% похідних шиконіну від

сухої біомаси, вихід якої на 14ту добу росту становить16 г/л живильного середовища. Методами тонкошарової

хроматографії (на пластинках Sorbfill УФ 254) та хроматографії на колонці (Silica gel 60) досліджено спектр ши

конінових похідних у процесі становлення культури. Встановлено, що органогенна культура на перших етапах

культивування на живильному середовищі LSм разом із червоними фракціями шиконінових пігментів синте

зувала й сині. Проте через 1,5 року культивування клітини калюсу синяка синтезували тільки червоні фракції

шиконінових пігментів.

Ключові слова: Echium plantagineum L., культура тканин рослин, червоні пігменти, похідні шиконіну,

клітинні лінії — продуценти біологічно активних речовин.

Пороннік О. О.

Шаблій В. А. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ

Кунах В. А. E/mail: oksana_poronnik@ukr.net

Експериментальні статті

Промивали дистильованою водою і елююва

ли похідні шиконіну гексаном в іншу колбу

Бунзена.

Кількісний аналіз шиконінових пігменF

тів. Оцінюючи кількісний вміст шиконіну

та його ефірів у екстрактах калюсів, вико

ристовували фотоелектроколориметричний

метод аналізу. Для досягнення цієї мети ми

отримали калібрувальну криву, побудовану

за наважками очищених нафтохінонів. Оп

тичну густину вимірювали при довжині

хвилі λ = 526 нм (log e

526

=3,87) в етанолі [7].

Адсорбційна хроматографія на силікаF

гелі. Колонки розміром 1,5×7,0 набивали

Silica gel 60 у хлороформі, зрівноважували

системою розчинників гексан — етилацетат

(50:1) до повної стабілізації базової лінії.

Зразок сухої тканини масою 400 мкг нано

сили на колонку в гексані й елюювали в сту

пінчастому градієнті системи розчинників

гексан — етилацетат у співвідношеннях:

50:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 0:1. Отриму

вали сім фракцій, які аналізували методом

тонкошарової хроматографії. Фракції І і ІІ

мали жовте забарвлення (жовті пігменти),

відповідно фракції ІІІ, ІV і V — червоне забарв

лення (червоні пігменти), останні дві фрак

ції — синє забарвлення (сині пігменти).

Було розроблено умови швидкого виді

лення фракцій синіх пігментів. До етаноль

ного екстракту культури тканин додавали

2–3% етанольного розчину Cu(OAc)

, прогрі

вали 3 хв при температурі 50–60

С до повно

го осадження червоних пігментів, після чо

го наносили екстракт на колонку розміром

1,5×7,0 (Silica gel 60). Eлюцію проводили

ступінчасто системами бензол — етилацетат —

оцтова кислота у співвідношеннях 3:1:0,1

і 3:1:0,2. Отримали дві фракції: перша —

розчин комплексу солей міді з червоними

пігментами, друга — із синіми пігментами.

Тонкошарову хроматографію (ТШХ)

здійснювали на пластинках Sorbfill УФ 254

у системі розчинників гексан – етилацетат –

оцтова кислота, 100:15:1 [9].

Гідроліз шиконінових похідних. Гекса

новий розчин шиконінових похідних змішу

вали з 0,1 н. NaOH, ресуспендували. Пігменти

кількісно переходили з гексану в луг, забарв

люючи його в інтенсивноблакитний колір.

NaOH нейтралізували 0,1 н. НСІ і екстрагу

вали похідні шиконіну петролейним ефіром

у ділильній воронці.

Спектральний аналіз. Кожну фракцію,

яку в чистому вигляді було виділено із ко

лонки, висушували у роторному випарю

вачі, перерозчиняли у рівних об’ємах етано

лу і вносили до вимірювального приладу.

ваному живильному середовищі з мінераль

ною основою, розробленою А. Г. Волосови

чем зі співавторами (1979). Склад викорис

таного варіанта середовища 5С01 див. [6 ].

Біосинтез шиконінових пігментів іні

ціювали на модифікованому середовищі

Лінсмайєр–Скуга (LSм) [7].

Пророщували насіння та ініціювали ка

люсоутворення у пробірках об’ємом 30 мл,

що містили 5 мл агаризованого живильного

середовища. Отриману культуру тканин

E. plantagineum вирощували в плоскодон

них колбах об’ємом 100 мл, що містили 25 мл

середовища, при температурі 25–27

С без

освітлення за відносної вологості повітря

70–80%.

Усі матеріали і складові живильних се

редовищ були вітчизняного виробництва.

Первинний добір культури на підвищенF

ня продуктивності за шиконіном. Неве

ликі частинки калюсу занурювали у рідкий

парафін «Парекс». Через декілька хвилин

відбувалась екстракція червоних пігментів.

Перевагу надавали варіантам калюсу, що

давали найяскравіше забарвлення парафі

нового екстракту [8].

Матеріали та обладнання для біохімічних

досліджень. Для рідинної хроматографії ви

користовували Silica gel 60 (Merck, Німеччина),

пластинки для тонкошарової хроматографії

Silufoll (Czechlab, Чехія) та Sorbfill (Росія),

Аl

(Czechlab, Чехія). Хроматографію про

водили на хроматографі LKB Bromma (8300

Uvicord II, Чехія). Для спектрофотометрич

ного аналізу застосовували спектрофотометр

Specord UV VIS (Carl Zeiss Jena), кількісний

вміст шиконіну визначали на фотоелектро

калориметрі Фотометр КФК3. Решта реак

тивів —вітчизняного виробництва.

Методи біохімічних досліджень

Екстракція. Висушену до повітряносу

хого стану при температурі 40

С і подрібне

ну біомасу вичерпно екстрагували етанолом

в апараті Сокслета, екстракт упарювали

в ротаційному випарювачі. Залишок зали

вали етанолом при температурі 50–70

С.

Ресуспендували і змивали розчинником ши

коніновий осад зі стінок колби. Готували

2–3%й етанольний розчин Cu(OAc)

або

CuCO

і додавали його до розчину шиконіно

вих похідних, прогрівали 3 хв при темпера

турі 50–60

С. Фільтрували розчин на скля

ному фільтрі під водострумним насосом.

Фільтрат промивали етанолом, ацетоном,

гексаном. Темнофіолетовий осад висушува

ли і обробляли розведеною HCl (5–10%).

Трансгенные технологии составляют од

но из наиболее спорных достижений совре

менной науки, вызывая неослабевающую

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

тури пройшла відмінно. Культура активно

росла, спостерігали також окремі червоно

забарвлені мікроділянки калюсу. Калюс був

відносно щільним, складався з клітинних

агрегатів (глобул) розміром 1–3 мм.

Протягом другого пасажу на середовищі

LSм спостерігали масове утворення дрібних

ниткоподібних корінців. Поверхневий шар

цих корінців наприкінці пасажу синтезував

невелику кількість шиконіну, про що свід

чило червоне забарвлення. Калюс при цьому

також набув бурого забарвлення (рис. 1, в).

Утворення корінців можна пояснити дією

індолілоцтової кислоти (ІОК), що входить до

складу середовища LSм. Відомо, що невисо

ка концентрація ІОК (0,28–0,3 мг/л) спри

чинює ризогенез [11]. У цей період нами

проведено первинний добір культури на під

вищений вміст шиконіну за допомогою рід

кого парафіну [8]. Як найперспективніший

за вмістом шиконіну й інтенсивністю росту

визначено варіант калюсу 3Ер, який утво

рював найменше корінців (рис. 2).

Отримані з різних насінин калюсні тка

нини синяка мали значні фенотипні відмін

ності (табл. 1). Порівняльні дані з продуктив

ності за похідними шиконіну подано в табл. 2.

Через 20 пасажів варіант 5Ер загинув.

Відселектований калюс культури E. plant/

agineum 3Ер накопичує 2,11% шиконіну на

суху масу, маючи приріст біомаси 16 г/л за

тривалості пасажу 14 діб. Саме цей варіант

отриманої калюсної культури тканин синя

ка використаний нами в подальшому для

вирощування у вигляді суспензії, що є про

міжним етапом у створенні біотехнології

одержання червоних пігментів.

Біохімія вторинних метаболітів. Під

час становлення культури тканин рослини

Аналіз проводили у двох режимах: перший —

при ультрафіолетовому освітленні (200–300 нм),

другий — у видимій частині спектра

(300–700 нм).

Статистична обробка. Застосовували за

гальноприйнятий метод варіаційної статисти

ки [10]. Обчислення критерію Стьюдента вико

нували на ПК за допомогою програми Origin.

Результати та обговорення

Одержання первинних калюсів. Пер

винні калюси одержали з корінців насіннє

вих проростків синяка подорожникового на

середовищі 5С01, яке розроблено для рослин

них культур тканинсуперпродуцентів [6].

Перші проростки синяка з’явились через

місяць після перенесення на живильне сере

довище. З 35 насінин утворилося 6 пророст

ків. Проростки довжиною 2–3 см, що пере

бували на живильному середовищі того

самого складу і торкались поверхні середо

вища, протягом 1–2 днів утворили калюс

(варіанти 1Ер, 2Ер, 3Ер, 4Ер та 6Ер). Одна

з насінин дала карликову рослинку розмі

ром 3 мм, яка на середовищі 5С01 упродовж

тривалого часу не росла і не розвивалась.

І тільки через два місяці утворився первинний

калюс (варіант 5Ер). Первинні калюси, утво

рені з проростків різних насінин синяка, на

початку культивування були ідентичними.

Вони складались із світлокоричневих клітин

них агрегатів розміром 2–3 мм (рис. 1, а). Од

нак через три пасажі варіант 1Ер загинув.

Через чотири місяці культивування пер

винний калюс було перенесено на живильне

середовище LSм, розроблене для рослинних

культур тканин, що продукують шиконін

[7] (рис. 1, б). Адаптація всіх варіантів куль

вб

Рис. 1. Первинний калюс культури тканин синяка подорожникового Echium plantagineum:

а — перетворення насіннєвого корінця на калюс (живильне середовище 5С01); б — 3й пасаж калюсу на живиль

ному середовищі LSм; в— 5й пасаж: клітини калюсу починають синтезувати пігменти (стрілкою позначено чер

воний корінець)

полемику вокруг создаваемых ими возмож

ностей и порождаемых проблем. Поднимае

Експериментальні статті

E. plantagineum у процесі її пасажування на

живильному середовищі LSм спостерігали

мінливість кількісного і якісного складу ефі

рів шиконіну. Так, протягом перших па

сажів одразу після перенесення калюсу з жи

вильного середовища 5С01 на LSм калюс

формував багато червоноколірних корінців.

Кірковий шар корінців синтезував шиконін

та його похідні. Сам калюс також почав син

тезувати шиконінові пігменти (рис. 3).

Однак якісний склад етанольних екст

рактів калюсу і утворених корінців відріз

нявся. На тонкошарових хроматограмах

в екстрактах, виділених із корінців, спос

терігали лише фракцію червоних пігментів,

тимчасом як у калюсі поряд із червоними

були також і сині пігменти (рис. 4). Такий

умовний розподіл шиконінових ефірів було

зроблено на основі кольору плям на тонко

шаровій хроматограмі. Синтез клітинами

первинного калюсу E. plantagineum синіх

вб

Рис. 2. Селекція на підвищений вміст шиконінових пігментів калюсу культури Echium plantagineum L.

на живильному середовищі LSKм: а, б, в — різні етапи селекції

Варіант калюсу

E. plan/

tagineum

Характеристика агрегатів тканини

Розмір

Структу

ра

Забарв

лення

Інтен

сивність

росту

2Ер

До

2 см

Щільна

Поверхня

частково

червоно

бура,

у розрізі —

світло

жовта

Інтен

сивний

3Ер

До

3мм

Се

редньої

щіль

ності

Яскраво

червоне

Інтен

сивний

4Ер

До

6мм

Щільна

Бурочер

воне

Повіль

ний

5Ер

До

1см

Середньої

щіль

ності

Червоно

бурувате

Се

редній

6Ер

До

5мм

Пухка Світле

Інтен

сивний

Таблиця 1. Фенотипні відмінності варіантів калюсу

Echium plantagineum, отриманих з різних насінин

Таблиця 2. Вміст шиконінових ефірів,

% від сухої маси

Па

саж

№

Варіант калюсу Echium plantagineum

2Ер 3Ер 4Ер 5Ер 6Ер

5 Сліди

0,38±

0,019

Сліди Сліди Сліди

0,36±

0,018

0,94±

0,047

0,39±

0,019

0,95±

0,047

Сліди

0,30±

0,015

1,25±

0,062

0,27±

0,013

1,00±

0,050

Сліди

0,29±

0,014

1,24±

0,062

0,85±

0,042

0,52±

0,026

Сліди

0,64±

0,032

1,18±

0,059

0,46±

0,023

0,59±

0,029

0,33±

0,016

0,40±

0,020

1,22±

0,061

0,51±

0,025

–

0,20±

0,010

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

пігментів, не характерних для культур —

продуцентів червоних шиконінових пігмен

тів, можна пояснити стресовими умовами,

в яких перебувають клітини рослини під

час калюсоутворення. При цьому змінюєть

ся реалізація генетичної інформації (акти

вуються репресовані або сплячі гени, діють

генимодифікатори), припиняється синтез

одних і починається утворення інших речо

вин вторинного синтезу. Проте з часом від

бувається пристосування рослинних клітин

(калюсу) до нових умов існування і може

мати місце зворотний процес, коли нетипові

для цієї рослини речовини, раніше чи

пізніше, припиняють синтезуватись і в ка

люсі [12].

Після гідролізу етанольного екстракту

біомаси синяка в 0,1 н. КОН з наступним

хроматографічним аналізом методом тонко

шарової хроматографії на силікагелі (див.

розділ Матеріали і методи) було виявлено

одну речовину червоного забарвлення

(рис. 5). Методом спектрального аналізу

в ультрафіолетовій та видимій частинах

спектра було встановлено максимуми по

глинання, а саме 275 нм, 490 нм, 520 нм

5432

Рис. 3. Тонкошарова хроматографія складу

шиконінових похідних у різних частинах

первинного калюсу:

1 — етанольний екстракт калюсу E. plantagineum;

2 — етанольний екстракт корінців.

Стрілками позначено:

червоні пігменти;

сині пігменти

Рис. 4. Тонкошарова хроматографія етанольного

екстракту калюсу культури E. plantagineum:

1 — етанольний екстракт;

2 — етанольний екстракт після проведення гідролі

зу 0,1 н. розчином КОН

Рис. 5. Тонкошарова хроматографія етанольних

екстрактів різних пасажів варіанту 3 Ер

калюсної культури E. plantagineum:

1 — 3 Ер/7; 2 — 3 Ер/10;

3 — 3 Ер/13; 4 — 3 Ер/15;

5 — 3 Ер/17