Біотехнологія 2008 Том 1, №3

Подождите немного. Документ загружается.

Огляди

одержання та маніпулювання ембріонами

сільськогосподарських тварин in vitro на ос

нові детального розуміння процесів гамето,

ембріогенезу, комплексної практичної реа

лізації можливостей цього методу в тварин

ництві, збереженні генофонду і для розроб

лення нових біотехнологічних методів

(трансгенез, клонування) забезпечить сучас

ній вітчизняній біотехнологічній науці по

дальший прогрес.

1. Коммерческая биотехнология. —

http:/www.cbio.ru/modules/news.

2. Буркат В. П., Дзіцюк В. В., Ковтун С. І.

Прикладні аспекти генетики та біотехнології

в тваринництві //Вiсн. Укр. тва генетиків і

селекціонерів. — 2005. — Т. 3, №1–2. —

С. 131–144.

3. Ковтун С. І., Куновський Ю. В., Галаган Н. П.

Вплив наноматеріалів на заплідненість яй

цеклітин свиней //Тваринництво України. —

2007. — №2. — С. 72–74.

4. Буркат В. П. Розведення тварин і збережен

ня їхнього генофонду //Вiсн. аграрної нау

ки. — 2006. — № 3–4. — С. 100–105.

5. Рекомендації по одержанню ембріонів вели

кої рогатої худоби in vitro / В. Є. Кузнєцов,

М. Я. Єфіменко, І. Б. Кузнєцова, Б. Є. Подо

ба. — К.: Міжнар. фін. агенція, 1998. —

33 с.

6. Miller G. F., Gliedt D. W., Rakes J. M., Ro/

rie R. W. Addition of penicillamine, hypotau

rine and pinephrine (PHE) or bovine — 20

oviductal epithelial cells (BOEC) alone or in

combination to bovine in vitro fertilization

medium increases the subsequent embryo

cleavage rate // Theriogenology. — 1994. —

V. 41. — P. 689–696.

7. Coy P., Martinez E., Ruiz S. et. аl. In vitro fer

tilization of pig oocytes after differrnt coin

cubation intervals // Ibid. — 1993. — V. 39. —

P. 1208–1208.

8. Ковтун С. И., Куновский Ю. В. Контроль

спонтанного партеногенетического развития

яйцеклеток коров и свиней в условиях in

vitro // Актуальные проблемы биологии

в животноводстве: Матер. IV междунар.

конф. — Боровск, 2006. — С. 244–245.

9. Lechniak D., Cieslak D., Switohski M. Cyto

genetic analysis of bovine parthenogenone

after spontaneous activation in vitro //

Theriogenology. — 1998. — N49. — Р. 779–785.

10. Зиновьева Н. А., Эрнст Л. К., Брем Г.

Трансгенные животные и возможности их

использования: молекулярногенетичес

кие аспекты трансгенеза в животновод

стве. — М.: ВИЖ, 2001. — 128 с.

застосовують метод створення генетичних

і цитогенетичних моделей. Ґрунтуються такі

моделі на виявленні хромосомних порушень і

мінливості генів, що контролюють процеси,

які проходять у цитоплазмі клітин під час

мітотичного та мейотичного поділу [24].

Встановлено, що хромосомні порушен

ня, часто не впливаючи негативно на процес

запліднення, дають початок розвиткові ано

мальних ембріонів. Такі ембріони є основ

ною причиною ранньої ембріональної смерт

ності та зниження рівня запліднення [25].

Показано, що однією із причин низького

рівня заплідненості жіночих гамет ссавців

є функціональна неповноцінність ооцитів,

їхня знижена здатність до подальшого роз

витку, хромосомні порушення в них, що мо

жуть бути зумовлені аномаліями каріотипу

соматичних клітин.

Відзначено, що хромосомні аномалії со

матичних клітин ссавців можуть у ході

мейозу негативно впливати на морфофунк

ціональний стан ооцитів. У результаті мо

жуть спостерігатися хромосомні аномалії

ооцитів і у вигляді тонких морфологічних

порушень на рівні органел, які пов’язані

з хромосомними аномаліями ооцитів [26].

Такі явища підтверджують існування при

родного біологічного відбору проти гамет зі

структурними аномаліями ядра і цитоплаз

ми під час запліднення яйцеклітин ссавців

поза організмом. Цитогенетичний аналіз

ооцитів ссавців дозволяє оцінити ступінь

їхньої зрілості і компетентності до заплід

нення, виявляти типи цитогенетичних ано

малій, які після запліднення призводять до

утворення аномальних зародків.

Виконані нами дослідження показують,

що з використанням цитогенетичного мето

ду аналізу хроматину яйцеклітини корів та

свиней після дозрівання in vitro, запліднення

можна ефективно аналізувати під світловим

мікроскопом зі збільшенням 100–1 000 раз.

При цьому чітко видно стадії мейозу ооци

тів, стан хроматину в мейозі, а також стан

ядер ембріонів. Дослідження проводили

у комплексі з одержанням ембріонів свиней

in vitro і тому для об’єктивної оцінки рівня

дозрівання поза організмом жіночих гамет

свиней показано, що ефективність цитоге

нетичного контролю становить 87,9%. Тоб

то із 463 ооцитів, відібраних на дозрівання

і подальший ембріональний розвиток, у 407

було виконано цитогенетичний аналіз.

Отже, сучасні методи біотехнології де

далі ширше застосовуються у тваринництві.

Опанування технологічними підходами

ЛІТЕРАТУРА

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

СОВРЕМЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

В ЖИВОТНОВОДСТВЕ

В. П. Буркат

С. И. Ковтун

Институт разведения

и генетики животных УААН

E/mail: kovtun_si@gala.net

Рассмотрены значение и основные направ

ления использования биотехнологии в животно

водстве, освещены достижения репродуктивной

биотехнологии, представлен обзор ряда биотех

нологических исследований, выполняемых в

Институте разведения и генетики животных

УААН. Изложены результаты применения

комплексного морфогенетического анализа при

изучении закономерностей реализации генети

ческой информации в эмбриогенезе полученных

in vitro эмбрионов. Обоснована целесообраз

ность применения цитогенетического контроля

для оценки биологической полноценности раз

вития in vitro эмбрионов млекопитающих.

Ключевые слова: биотехнология в животноводстве,

клеточная и генная инженерия, эмбрионы, трансге

нез, клонирование, цитогенетический анализ.

MODERN BIOTECHNOLOGY

IN ANIMAL HUSBANDRY

V. P. Burkat

S. I. Kovtun

Institute of Animal Breeding

and Genetics UAAS

E/mail: kovtun_si@gala.net

Importance and main directions of biotech

nology application in livestock and progress and

problems of reproductive biotechnology have

been considered. Тhe review of biotechnological

researches carried in the Institute of Animal

Breeding and Genetics is given. Results of com

plex morphologic and genetic analysis utiliza

tion during research of genetic information rea

lization pattern during embryogenesis of

embryos obtained in vitro are shown. Expediency

of cell genetics controls for evaluation of biolog

ical completeness of mammalian embryos devel

opment in vitro is validated.

Key words: biotechnology for farm animals, cell and

gene engineering, embryos, transgenic, cloning, cyto

genetic analysis.

11. Wall R. J., Siedel G. E. Transgenic farm ani

mals critical analysis //Theriogenology. —

1992. — V. 38. — P. 337–357.

12. Газарян К. Трансгенные животные: перс

пективы использования в животноводстве

//Сельскохозяйственная биология. —

1988. — №2. — С. 31–39.

13. Рябова Л. В., Васецкий С. Г. Роль элементов

цитоскелета в созревании ооцитов живот

ных // Успехи современной биологии. — Т.

109, Вып 2. — М.: Наука, 1990. — С. 5–10.

14. Brussow K./P., Kauffold I. Method of embryo

transfer in swine //Mh. Vet. Med. — 1989. —

V. 44. — P. 312–317.

15. Богатырев А. Н., Эрнст Л. К. Генная инже

нерия сельскохозяйственных животных —

мощный рычаг селекции ХХI века //Генно

инженерные сельскохозяйственные жи

вотные: Сб. науч. тр. — 1995. — №1. — С. 3–13.

16. Wilmut I., Schnieke A. E., McWhir J. Viable off

spring derived from fetal and adult mammalian

cells //Nature. — 1997. — V. 385. — P. 810–813.

17. Z. Machaty, K. R. Bondioli, J. J. Ramsoon/

dar, W. L. Fodor. The Use of Nuclear Transfer

to Produce Transgenic Pigs // Cloning and

stem cells. — 2002. — V. 4. — P. 21–27.

18. Pursel V. G., Rexroad Jr., C. E. Status of

research with transgenic farm animals //

J.Anim. Sci. — 1993. — V. 71. — P. 10–19.

19. Brussow K./P., Geissler F., Kauffold M. The

influence of microinjection on early embry

onic development of porcine zygotes // Arch.

Tierz. — 1990. — V. 33. — P 353–356.

20. Вrussow K./P., Schwiderski H. Results of

transfer of porcine split embryos // Ibid. —

1990. — V. 33. — P. 443–447.

21. Ковтун С. І. Стан і перспективи одержан

ня зародків свиней in vitro // Вісн. аграр.

науки. — 2004. — №5. — С. 52–54.

22. Кузнєцов В. Є. Біотехнологія у тварин

ництві //Генетика і селекція в Україні на

межі тисячоліть: У 4 т. — К.: Логос, 2001. —

Т. 4/ Гол. ред. В. В. Моргун. — С. 31–57.

23. Mikamo K., Kamiguchi Y. A new assessment

sustem for Chinese humstеr // Radiation

includes chromosome damage in man. — New

York: Alan R. Liss, 1983. — P. 411–432.

24. Plachot M. Chromosomal abnormalities in

oocytes //Mol. and Cell. Endocrinol. —

2001. — V. 183. — P. 59–63.

25. Стефанович А. В., Червякова Е. В., Шеме/

тун Е. В. и др. Цитогенетическое исследо

вание соматических клеток и морфофунк

циональные характеристики ооцитов

у женщин с нарушением репродуктивной

функции // Цитология и генетика. —

2004. — №1. — С. 3–8.

26. Wall R. J. Biotechnology for the production of

modified and innovative animal products: trans

genic livestock bioreactors //Livestock Produc

tion Science. — 1999. — V. 59. — P. 243–255.

Огляди

Колагенази в організмі людини і тварин

беруть участь у морфогенезі сполучної тка

нини, а також в усуненні деяких патологіч

них процесів при артритах, метастазах то

що, при цьому розщеплюють нативний

колаген у певних локусах на два фрагменти,

не спричинюючи руйнування цілої молеку

ли. Колагенолітичні ферменти мікроор

ганізмів є унікальними за своєю здатністю

в різних умовах ( рН, температури, іонної

сили) вибірково гідролізувати потрійну спі

раль молекули нативного нерозчинного при

родного білка — колагену.

Структура і властивості колагенів

Колагени є компонентами матриксу спо

лучної тканини (шкіра, сухожилля, кістки,

зуби, тощо) вищих тварин і належать до

фібрилярних білків групи склеропротеїнів.

Розрізняють близько 20 типів колагенових

молекул, які відрізняються молекулярною

будовою і належністю до різних органів.

Майже 30% білкової маси тіла людини і 6%

загальної маси тіла припадає саме на кола

ген. Його кількість у біосфері оцінюють

в 1 млрд. т [1].

Основна одиниця будови колагену —

тропоколаген (рисунок), який складається

з трьох поліпептидних αспіралей завдовжки

близько 300 нм (молекулярна маса 95 кДа).

В амінокислотному складі тропоколагено

вих молекул переважають залишки гліцину

(33%), проліну і гідроксипроліну (18%),

а також лізину. Три ланцюги, згортаючись

Протеолітичні ферменти відіграють важ

ливу роль в обміні речовин усіх живих ор

ганізмів, починаючи від бактерій та мікро

міцетів і закінчуючи вищими тваринами

і людиною. Широке застосування протеаз

у наукових дослідженнях, медицині, косме

тології, у легкій та харчовій промисловості

спонукає до пошуку зручних та економічних

джерел для одержання ферментів у промис

ловому масштабі. У цьому сенсі мікроорга

нізми є винятково перспективним об’єктом

досліджень, оскільки багато широко розпов

сюджених мікроорганізмів виділяють вели

ку кількість протеолітичних ферментів

у навколишнє середовище, що значно по

легшує завдання їх виділення та очищення.

Окрім своєї основної функції — розщеп

лення білків їжі до складових амінокислот,

протеолітичні ферменти виконують низку

не менш важливих функцій. Наприклад,

протеоліз лежить в основі таких процесів,

як зсідання крові та лізис тромбів, утворення

ряду білкових гормонів (інсулін), а також

фізіологічно важливих пептидів. Екстраце

люлярні протеолітичні ферменти мікроор

ганізмів розщеплюють білки, які містяться

в навколишньому середовищі, і перетворю

ють їх на форму, що здатна легко проникати

усередину мікробної клітини. Оскільки

мікробну клітину, залежно від умов існу

вання, оточують різні білкові субстрати, то

й синтезуються різні за специфічністю про

теази — широкої специфічності (гідролізу

ють декілька субстратів) або високоспеци

фічні (діють виключно на певний субстрат).

МАЦЕЛЮХ О. В., ВАРБАНЕЦЬ Л. Д.

Інститут мікробіології і вірусології НАН України, Київ

E/mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua

УДК 577.152.34:577.151.5

КОЛАГЕНОЛІТИЧНІ ФЕРМЕНТИ

МІКРООРГАНІЗМіВ

Мікробні колагенолітичні ферменти гідролізують білки родини колагенів. У роботі наведено дані щодо здат

ності деградувати колаген ферментами, виділеними з різних груп мікроорганізмів — бактерій, грибів, акти

номіцетів та дріжджів. Розглянуто фізикохімічні властивості, методи виділення і очищення ферментних пре

паратів колагеназ. Проаналізовано існуючі й можливі шляхи використання цих ферментів у промисловості

і медицині.

Ключові слова: колагенолітичні ферменти мікроорганізмів, фізикохімічні властивості,

методи виділення і очищення, практичне застосування.

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

в субстратзв’язувальній ділянці молекули

ферменту. Проте вони відрізняються за

структурою, специфічністю дії на колаге

нові волокна і використовуються для різних

наукових та прикладних цілей. Виділення

колагеназ із тваринних тканин є надто тру

домістким і неекономічним через малий

вміст порівняно з іншими білками. Також

слід зазначити, що лише мікробні колагена

зи та колагенази амфібій можуть гідролізува

ти колагени до повного їх руйнування. Деякі

з них було отримано як електрофоретично го

могенні препарати й охарактеризовано за мо

лекулярною масою, ізоелектричною точкою,

чутливістю до інгібіторів, специфічністю дії

та класифіковано за складом активних

центрів. Однак загалом питання щодо синтезу

колагенолітичних ферментів мікроорганіз

мами, їхніх властивостей, можливостей ви

користання досліджено недостатньо.

Уперше колагеназу мікробного поход

ження було виділено в 1957 р. з анаеробної

патогенної бактерії Clostridium histolyticum,

яка є збудником клостридіального міонекро

зу (газової гангрени) — захворювання з ви

соким рівнем смертності [3, 4]. Цей фермент

був здатен гідролізувати нативний колаген

за фізіологічних значень рН і температури.

Клостридіальній колагеназі дали назву «β

токсин». У комплексі з іншими метаболіта

ми бактерії фермент бере участь у поширен

ні тканинної деструкції. Останнім часом

з’явилися дані про те, що колагенази роду

Сlostridium не є домінантою у вірулентній

інфекції [5]. Так, на хромосомальних colA

мутантах C. perfringens було встановлено,

що колагеназа (каппатоксин) не відіграє

вирішальної ролі у вірулентному процесі [6,

7]. Здатність гідролізувати колаген мають

ферменти й інших патогенних мікроор

ганізмів. Стрептококи групи В є головними

патогенами в неонатальному сепсисі, пнев

монії та менінгітах [8, 9]. У дослідах in vitro

показано властивість стрептококів групи В

окупувати багату на колаген амнеостатичну

навколо спільної осі, утворюють потрійну

спіраль. Для первинної структури характер

ним є чергування полярних (5%) і неполяр

них (95%) ділянок. Будова неполярних

ділянок однорідна — це чергування послі

довності GlyProX, де X — будьяка аміно

кислота, але найчастіше пролін і оксип

ролін, які надають молекулі форми ламаної

спіралі [2]. Полярні ділянки локалізовані на

Nкінцях кожного ланцюга, мають глобу

лярну структуру і чутливі до атаки протеаз

широкої специфічності дії. Їхню будову вив

чено недостатньо, хоча й встановлено, що

кожною третьою амінокислотою в них

є гліцин. Структура колагену стабілізована

численними міжмолекулярними, водневи

ми, а також ковалентними зв’язками (між

лізином і оксилізином, проліном і окси

проліном). Усе це робить молекулу колагену

достатньо міцною та стійкою до розтягнен

ня. Так, наприклад, волокно колагену зав

товшки 1 мм витримує навантаження до 100 Н.

У тканинах волокна орієнтовані строго па

ралельно лініям напруги, що виникає в них

в результаті виконання притаманних їм

функцій (рисунок). Як й інші фібрилярні

білки, колаген майже нерозчинний у нейт

ральних розчинах солей, слабких кислотах і

лугах. Лише невелика частина колагенової

молекули екстрагується при температурі

С розчином хлориду натрію і кислими

(нітратними, ацетатними) буферами. Про

цес не супроводжується денатурацією кола

гену, розчинені молекули якого за певних

умов знову утворюють фібрили. Колаген,

який екстрагується цитратним буфером

з рН 4,0, називається проколагеном, а той, що

екстрагується нейтральними розчинами со

лей, — тропоколагеном. Більшість протеаз

можуть гідролізувати лише одиночні спіралі

або денатуровані колагенові пептиди, і лише

«істинні» колагенази (ферменти бактеріаль

ного походження, які атакують велику кіль

кість сайтів уздовж спіралі, чим відрізняють

ся від матриксних металопротеаз ссавців) та

протеази з колагенолітичною дією здатні

розщеплювати молекулу нативного колагену.

Біологічні функції і джерела

виділення колагеназ

Колагенази різних типів було виділено із

тканин хребетних, крабів, личинок мух,

екскретів комах, а також із культуральної

рідини або клітин мікроорганізмів — бак

терій, грибів, актиноміцетів. Колагенази,

що їх одержано з різних джерел, мають де

які спільні структурні особливості, зокрема

Структура колагенового волокна

(за Campbell, 1995)

Огляди

ізолювали й охарактеризували багато ґрунто

вих мікроорганізмів з колагенолітичною ак

тивністю. Вони належали до різних таксо

номічних груп, але більшість із них була

представлена стрептоміцетами та мікроміце

тами [25, 26]. Так, ґрунтовий Streptomyces

wartii був здатен гідролізувати колаген сухо

жиль, плаценти та деякі інші види колагену

[27], а колагеназу із Streptomyces sp. А8 за

фізикохімічними властивостями і субстрат

ною специфічністю можна віднести до «істин

них» колагеназ [28]. Також здатність синтезу

колагенази було виявлено у ґрунтової бак

терії Cytophaga sp. L43/1 [29], непатогенного

мікроорганізму Vibrio alginolyticus [30, 31] та

у термофільних (Streptomyces sp.) і психро

фільних (Azospirillum sp., Arthrobotrys tortor)

мікроорганізмів [32, 33, 34, 35].

ФізикоKхімічні властивості колагеназ

Колагенази, виділені з різних джерел,

відрізняються за своїми фізикохімічними

властивостями (рН і температурним опти

мумом дії, молекулярною масою, ізоелект

ричною точкою, кінетичними характерис

тиками тощо). За здатністю гідролізувати

колагенові волокна ферменти з колагенолі

тичними властивостями поділяють на

«істинні» та «неспецифічні». «Істинна» ко

лагеназа є ферментом, що гідролізує тільки

колаген і не діє на інші білки. «Неспецифіч

на» колагеназа гідролізує й інші білкові

субстрати, окрім нативного колагену [36].

Серед колагеназ мікробного походження

добре відомими і найбільш вивченими є ко

лагенази C. histolyticum (КФ 3.4.24.3), які

характеризуються високою специфічністю

дії на колагенові волокна і належать до

«істинних» колагеназ. Їх широко застосову

ють у біотехнології та для лабораторних

цілей (наприклад, препарати фірм Sigma

Aldrich, Serva). Проте для культивування

цієї бактерії потрібні складні запобіжні за

ходи, живильні середовища і відповідні умо

ви культивування. У результаті багатоста

дійного процесу очищення позаклітинного

ферментного комплексу клостридій одержу

ють групу з 6–7 колагеназ із молекулярною

масою від 68 до 125 кДа [37, 38]. Усі колаге

нази є нейтральними металопротеазами,

у зв’язку з чим у процесі вирощування про

дуцента для біосинтезу їх необхідні іони

цинку та кальцію. Дані, отримані під час

вивчення атомноадсорбційних спектрів

і впливу інгібіторів, свідчать про наявність

цинку в активному центрі молекули фер

менту, а для зв’язування з колагеновим

мембрану плаценти, колагенові фібрили

при цьому руйнуються, що призводить до

передчасного розриву мембран. Streptococ/

cus mutans є збудником коронального каріє

су і відповідає за поширення його на всю по

рожнину рота [10]. Також проводяться

дослідження, спрямовані на з’ясування ролі

колагенази Candida albicans у розвиткові

карієсу зубів [11, 12]. Інша патогенна анае

робна бактерія Porphyromonas gingivalis та

кож спричинює захворюванння порожнини

рота — періодонтити. Було встановлено, що

цей мікроорганізм синтезує багато екзопро

теаз і принаймні декілька з них — у формі

більш високомолекулярних зимогенів [13,

14, 15]. Серед протеаз P. gingivalis виявлено

як тіолові, так і серинові протеази, які дег

радують імуноглобуліни, фібриноген, фібро

нектин, колаген, еластин тощо [16, 17]. Для

фітопатогенної бактерії Corynebacterium

(Clavibacter) rathayii встановлено, що її ко

лагеназа бере участь у прикріпленні клітин

до волокон колагену [18, 19]. Колагеназа

Bacillus cereus є одним з основних вірулент

них факторів цієї бактерії — збудника

швидкоплинних ендофтальмітів. Очищений

фермент, виділений із цього патогену, вик

ликав некрози сітківки in vivo. Нещодавні

досліди показали інфільтрацію бактеріаль

них клітин у склисте тіло, що пов’язано

з руйнуванням протективної захисної кола

генової капсули [20, 21]. Staphylococcus

aureus продукує різні екзопротеїни, які зу

мовлюють здатність цього мікроорганізму

колонізувати тканини і спричинювати за

хворювання організмухазяїна. Майже всі

штами секретують цитокіни і групу фер

ментів у складі гемолізинів (α, β, γ, δ), нук

леаз, протеаз, ліпаз, гіалуронідаз і колаге

наз. Основна функція цих білків полягає

у прикріпленні до тканини хазяїна і пере

творенні її на джерело живлення [22, 23].

До 90х років XX ст. панувала думка, що

в мікроорганізмів украй рідко трапляється

здатність деградувати колаген і використо

вувати його як джерело їжі. Однак було до

ведено, що колагенолітичні ферменти здатні

виділяти в навколишнє середовище не лише

патогенні штами. З ґрунту та стічної води

можна виділити штами, які мають влас

тивість синтезувати колагеназу. Так, за да

ними чеських учених [24], із 437 бактеріаль

них культур, що їх було виділено зі стічної

води і різних зразків ґрунту, колагенолітичну

дію мали (у % від кількості штамів у зраз

ку): стічна вода — 6,6; ґрунт смерекових

лісів — 15; польовий ґрунт — 30; присадиб

ний ґрунт — 29; садовий ґрунт — 37. Згодом

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

наявність фракцій, неактивних навіть щодо

желатину [40, 41].

Окрім групи клостридіальних колагеназ,

одержана в гомогенному стані, детально вив

чена і застосовується для промислових потреб

колагеназа (КФ 3.4.24.3), яку виділено

з культуральної рідини бактерії Achromobac/

ter iophagus [42]. Було показано, що цей фер

мент складається з двох ідентичних субоди

ниць з молекулярною масою 35 кДа.

Дисоціація димеру в різних умовах призводи

ла до втрати ферментативної активності [43].

Цей фермент також можна віднести до групи

«істинних» колагеназ. Субстратами ферменту

можуть бути, окрім нативного й денатурова

ного колагену, синтетичні пептиди, що іміту

ють амінокислотну послідовність колагену.

Встановлено, що колагеназа з A. iophagus так

само, як і ферменти, виділені з C. histolyticum,

містить в активному центрі цинк і для вияву

активності потребує іонів кальцію.

Протеолітичні ферменти з активною ко

лагенолітичною дією, як з металом в актив

ному центрі, так і серинового типу, отрима

но з культуральної рідини штамів, які

належать до родів Streptomyces i Actino/

myces. Металозалежними протеазами є ко

субстратом і повної каталітичної активності

потрібні іони кальцію, які також запобіга

ють інактивації. Так, на кожну молекулу

ферменту припадає, за даними [39], 1 моль

цинку. Препарати з колагенолітичною дією,

виділені з C. histolyticum, мають специфіч

ність до XGly зв’язку (X — нейтральна аміно

кислота) у послідовності ProXGlyPro.

Усе це свідчить про «істинність» клостри

діальних колагеназ. Високоочищені клост

ридіальні колагенази активні щодо натив

ного і денатурованого колагену, желатину,

деяких синтетичних субстратів, які іміту

ють послідовності амінокислот у молекулі

колагену: 2фуранакрилоїлLeuGlyProAla

(FALGPA), PzProArgGlyPro (Pzпептид),

[ProOxyProGly]

, [ProProGly]

, але не ді

ють на інші глобулярні й фібрилярні білки

(казеїн, гемоглобін, альбумін, фібрин, кера

тин, еластин). Водночас неочищені препара

ти, що містять домішку неспецифічних про

теаз, здатні розщеплювати ще й інші білки,

у зв’язку з чим їх широко застосовують для

ізоляції клітин у різних типах тваринних

тканин. Утім, специфічність цих колагеназ

може бути ще вужчою, оскільки у дослідах

із фракціонування препарату встановили

ФізикоKхімічні властивості деяких колагеназ мікробного походження

Джерело виділення

колагенази

Моле

куляр

на ма

са, кДа

Оптимум дії

Ізоелект

рична

точка,рІ

Інгібітор Субстрат

рН t,

Candida albicans [68] 46 6,5–7,0 37–55 6,2 ЕДТА БСА, колаген, FALGPA

Candida albicans

ATCC 1002 [11]

40 4,0 40–50 4,0

Пепстатин, се

човина, цистеїн

БСА, колаген, FALGPA

Achromobacter iopha/

gus (EC 3.4.24.3) [31]

82 – – –

ДПФФ,

гістидин

Казеїн, пролактин, міозин,

фібронектин, аденілаткіназа

Hypoderma lineatum

(3.4.21.49) [60]

25,2 7,0–7,5 25–37 4,1 ДПФФ

Нативний колаген, окисне

ний Вланцюг інсуліну

Cytophaga sp. L431

[29, 72]

120 – – 4,96 ЕДТА Колаген, желатин, казеїн

Streptococcus mutans

[10]

–– –

ЕДТА,

офенантролін

Желатин, колаген, FALGPA

Alicyclobacillus

sendaiensis NTAP1

[69]

37 3,9 – – Пепстатин Колаген, FALGPA

Clostridium his/

tolyticum [37]

115

100

110

125

7,0–7,5 37

5,9

5,6

6,1

5,8

5,9

5,4

ЕДТА, цистеїн,

офенантролін

Желатин, колаген, FALGPA

Azospirillum sp. [34] 48,6 8,5 40 8,5 EДТА Нативний колаген

Примітка: «–» — даних немає; ДПФФ — діізопропілфторфосфат; ЕДТА — етилендіамінтетраацетат.

Огляди

3.4.21.66), з максимумом стабільності при

температурі 60–85

С. За каталітичними

властивостями цей фермент нагадує суб

тилізини. З іншого штаму Thermoactino/

myces vulgaris sp. 21Е виділено термофільну

серинову колагеназу з молекулярною масою

50 кДа. Температурний оптимум дії для цьо

го ферменту становив 60–65

С, а в присут

ності іонів кальцію підвищувався до

70–75

С. У разі нагрівання до 85

С, знову

ж таки у присутності іонів кальцію, протя

гом 30 хв залишалося до 50% вихідної ак

тивності. Фермент виявляв досить вузьку

специфічність дії — гідролізував лише кола

ген І типу, желатин і Pzпептид [53].

Деякі представники Streptomyces i Actino/

myces є джерелами промислових протеолі

тичних препаратів, які мають і колагенолі

тичну активність (проназа, протелін,

римопротелін, протофрадин) [54]. Проназа,

виділена із S. griseus, є комплексом протеаз

та пептидаз, які належать до класів серино

вих і металопротеаз [55]. Проназа, на відмі

ну від клостридіальних колагеназ, гідролі

зує внутрішньомолекулярні зв’язки, які

з’єднують молeкулу колагену латерально

і на кінцях, при цьому не порушуються

поліпептидні ланцюги потрійної спіралі.

Протелін також одержують із S. griseus. Він

гідролізує внутрішньо і міжмолекулярні

поперечні зв’язки колагену. Подібним чи

ном діє комплексний ферментний препарат

римопротелін, виділений із S. rimosus.

Комплексний препарат протофрадин, який

містить трипсиноподібні серинові протеази

з колагенолітичною дією, виділено із S. fra/

diae. Встановлено [56], що він може спричи

няти глибокий гідроліз колагену лише за до

вготривалого протеолізу і в разі великої

концентрації ферменту.

У деяких мікроорганізмів виявлено здат

ність до синтезу позаклітинних колагенолі

тичних протеаз серинового типу, які відріз

няються від «істинних» колагеназ передусім

будовою активного центру, в якому містить

ся серин. Такі самі колагенази виділено

з комах Hypoderma lineatum, краба Uca pu/

gilator, деяких земноводних і ссавців [57, 58,

59, 60, 61]. Серинові протеази з колагенолі

тичною дією мають низьку молекулярну ма

су. За властивостями і механізмом дії вони

схожі на трипсиноподібні протеази тварин.

Відома властивість серинових протеаз із ро

дини субтилізинів, джерелом яких є деякі

штами B. subtilis [62], розщеплювати натив

ний і денатурований колаген. Так, із бак

терії Bacillus sp. B16, якій притаманна нема

тодотоксична активність (на Panagrellus

лагенази, виділені з культуральної рідини

таких мікроорганізмів, як Streptomyces sp.

C/51 і Streptomyces sp. A8 [44, 45]. Специфіч

ність цих ферментів ширша, ніж клост

ридіальних, оскільки вони деградують, по

ряд з колагеном, ще й казеїн, кератин,

еластин та інші білкові субстрати. Зі штаму

Streptomyces sp. 3B [46] було виділено два

металозалежних ферменти з колагеназною

активністю. Молекулярна маса їх становила

116 і 97 кДа. Вони належать до нейтральних

протеаз і мають досить вузьку специфіч

ність — активно деградують лише колаген,

желатин і синтетичні субстрати — аналоги

послідовностей у молекулі колагену. Для

Streptomyces sp. 1349 було показано, що цей

штам виділяє в середовище культивування

принаймні три ферменти з колагенолітич

ною активністю: два з них є металопротеаза

ми, а один — сериновою протеазою з моле

кулярною масою 30–40 кДа. Ці ферменти

мають високу субстратну специфічність,

активні в досить широкому діапазоні рН —

від 5,0 до 11,0 і мають декілька термоопти

мумів: при 37–40

С і 60

С [47].

Металозалежні колагенолітичні протеа

зи було знайдено і в бацил. Так, із культу

ральної рідини Geobacillus collagenovorans

MO1 виділено дві металопептидази, які гід

ролізували синтетичні субстрати, що містять

специфічну послідовність молекули колаге

ну GlyProX [48]. Окрім того, ця бактерія

синтезує серинову колагенолітичну протеа

зу з молекулярною масою 210 кДа, що скла

дається з двох субодиниць 105 кДа кожна.

Цей фермент унікальний тим, що має най

вищу молекулярну масу серед мікробних

колагеназ. Він активний стосовно колагенів

I і IV типів і желатину, однак не гідролізує

синтетичні пептидні субстрати FALGPA

і Pzпептид [49].

Багато мікробних ферментів мають висо

ку стійкість до температури і денатуруючих

агентів. Зі штаму Aneurinibacillus thermo/

aerophillus DSM 10154T було виділено термо

стабільну металозалежну пролінспецифічну

амінопептидазу, яка ефективно гідролізува

ла й колаген. За даними SDSPAGE, її моле

кулярна маса становить 51 кДа. Фермент

максимально активний при температурі

C і втрачає до 50% вихідної активності

при 36 і 75

C [50]. Термостабільний ферме

нтний комплекс, який містив декілька ком

понентів і мав колагенолітичну дію, було

одержано з культуральної рідини Thermo/

actinomyces vulgaris [51, 52]. У найбільшій

кількості в комплексі містилася серинова

протеаза, яку назвали термітазою (КФ

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

моген відіграє певну роль не тільки в деграда

ції колагену, але й у його адгезії на субстраті.

У штамів роду Candida встановлено здат

ність до синтезу як внутрішньо (C. albicans

[68]), так і зовнішньоклітинних протеаз

із колагенолітичною дією. Останні, у пере

важній більшості, є кислими протеазами.

Так, C. albicans АТСС 1002 синтезує кислу

колагеназу з молекулярною масою 46 кДа

і оптимумом дії при рН 3,5–4,0, що є чутли

вою до дії пепстатину, сечовини і цистеїну.

Зі збільшенням рН до 6,0 відбувається дена

турація ферменту. Активність також зни

жується в разі підвищення температури до

С. Нещодавно було виділено кислу кола

геназу з ацидофільного штаму A. sendaiensis

NTAP1 [69]. Окрім оптимуму дії при рН 3,9

ця протеаза відзначається термостабіль

ністю. Структура ферменту мономерна, мо

лекулярна маса — 37 кДа. Активність фер

менту інгібується пепстатином, він виявляє

специфічність до нативного колагену і за ти

пом дії належить до карбоксипептидаз.

Деякі фізикохімічні властивості колаге

наз різного походження подано в таблиці.

Методи виділення і очищення

мікробних колагеназ

Для виділення індивідуальних колаге

наз застосовують різні методи. Так, діалізат

супернатанту культуральної рідини C. his/

tolyticum після осадження сульфатом амо

нію 90%го насичення піддавали гель

фільтрації на колонці з сефадексом G50,

а потім — G75. У результаті очищений пре

парат містив окрім βтоксину (колагеназа)

ще й неспецифічні протеїнази. Для одер

жання комерційних препаратів колагенази

проводили багатостадійне очищення на

гідроксилапатиті, сефакрилі S200, а також

із застосуванням афінної хроматографії

з біоспецифічними лігандами (LArgAffi

Gel202 і забарвленим червоним лігандом)

[38]. Отриманий таким чином препарат під

дають іонобмінній хроматографії на ДЕАЕ

целюлозі та гельфільтрації на SPсефадексі

й одержують 6 очищених індивідуальних

колагеназ, які позначають α, β, γ, δ, ε та ζ.

Для очищення колагенази C. albicans вда

ються до центрифугування культуральної

рідини, ультрафільтрації супернатанту крізь

мембрани Diaflo марки PU10, хроматографії

на ДЕАЕсефацелі, внаслідок чого отриму

ють очищений у 600 разів фермент [11, 70].

Колагеназу з P. gingivalis виділяють

екстрагуванням із клітин 1%м розчином

тритону X100 та гельхроматографією на се

фадексі G50 і G75 [71]. Для очищення кола

redivivus), виділено позаклітинний білко

вий комплекс, що вбивав до 80% нематод

у досліді протягом 24 год. Основним компо

нентом цього комплексу і основним патоген

ним агентом є серинова колагенолітична

протеаза з молекулярною масою 28 кДа. Цей

фермент виявляв максимум активності при

температурі 50

С і рН 10 [63].

Одним із мікроорганізмів, який синтезує

серинову протеазу з широкою субстратною

специфічністю, у тому числі з колаге

нолітичною дією, є патогенний гриб Entomo/

phthora coronata [64]. Цей фермент гідролі

зує нативний колаген шкіри людини,

а також синтетичні пептиди — аналоги

амінокислотних послідовностей колагену.

Із цією протеазою схожа за дією на колаген

серинова протеаза, виділена з гриба Mal/

branchеa pulchella var. sulfuria [52], однак

вона має нижчу активність.

Cеринові протеази з грибів роду Aspergil/

lus також виявляють високу колагенолітич

ну активність, проте за специфічністю дії

відрізняються від колагенази E. coronata.

Відомий штам A. niger, який синтезує аспер

гілопептидазу з високою колагенолітичною

активністю [65]. Фермент здатен розщеплю

вати синтетичні пептиди зі специфічною ко

лагеновою структурою. Його молекулярна

маса становить 21 кДа, оптимальні умови

дії — при температурі 45

С і значеннях рН

середовища 7,5–7,8. Подібні за властивос

тями аспергілопептидази було виділено

з культуральної рідини A. oryzae [66]. Моле

кулярна маса виділеного ферменту станови

ла 20 кДа, оптимальні умови для вияву ко

лагенолітичної активності — рН 9,0–10,0

і40

С. Ця протеаза має широку специфіч

ність дії і гідролізує низку білкових субстра

тів — нативний колаген, сироватковий аль

бумін, βлактоглобулін, пептон.

Серед протеаз з колагеназною активніс

тю виявлено також кислі протеази. Їх виді

ляють з таких мікроорганізмів, як Porphyro/

monas gingivalis, Candida albicans та

Alicyclobacillus sendaiensis. Так, із клінічно

го ізоляту P. gingivalis 1101 [67] — грамнега

тивної патогенної анаеробної бактерії, яка

спричиняє захворювання ротової порожни

ни, — було виділено і очищено протеазу зі

специфічністю до людського колагену і син

тетичних пептидів. Колагеназа інактивува

лась інгібіторами тіолових протеаз (пепста

тин, Nетилмалеімід) і відновлювальними

агентами (βмеркаптоетанолом). Фермент

синтезується у вигляді зимогену з молекуляр

ною масою 94 кДа і розщеплюється на фраг

менти — 75,5 і 19 кДа. Припускають, що зи

Огляди

заклітинного матриксу тканин з метою от

римання індивідуальних клітин з культури

або для вирощування культуральних клі

тин. Виділені за допомогою мікробних кола

геназ життєздатні клітини острівків Лан

герганса застосовують у лікуванні діабету

[76]. Колагеназу А, одержану з C. his/

tolyticum, використовують, наприклад, для

ізоляції гепатоцитів із печінки щурів (збері

гається до 80% живих клітин), а також ен

дотеліальних клітин [77]. Колагеназа А та

кож входить до складу мазей «Норуксол» та

«Імозимаза», що їх застосовують для фер

ментативного очищення ран від опіків, об

морожень, варикозних виразок. Ці препарати

не викликають алергічних реакцій і скоро

чують строки лікування у 1,5–2 рази [78].

Колагеназу В того самого продуцента вико

ристовують для ізолювання клітин із тка

нин. Колагеназа із Streptomyces sp. може зас

тосовуватись для лізису пухлинних клітин

інвертебрального диска хребта. На основі

колагеназ створюють нові засоби для перев’я

зування, у тому числі плівкові покриття.

Використання ферментів у косметиці

відкриває можливість для створення косме

тичних засобів лікувальнопрофілактично

го напряму, які не мають побічної дії (под

разнень, алергії, токсикозів). Колагеназа

ефективна у складі очищувальних кремів

і масок, оскільки прискорює процес гідролі

зу колагену в шкірі і сприяє синтезу нового

колагену та «омолоджуванню» шкіри [57].

Використання колагенази дозволить до

сягти високого рівня виробництва і якості

готової продукції в таких галузях, як, нап

риклад, шкіряна промисловість. Тут кола

геназу застосовують як у складі препаратів

для пом’якшення голини, так і на стадії

утилізації відходів виробництва [79]. Усе це

сприяє поліпшенню якості голини, оскіль

ки ферментативний процес відбувається за

м’яких умов, а тому структура отримуваної

голини виходить якіснішою, ніж при хіміч

ному пом’якшенні. Ферментативні процеси

також зумовлюють зниження температури об

роблення шкіри, зменшують забруднення ви

робничих стоків і агресивні умови праці [80].

Таким чином, деякі колагенази, що проду

куються мікроорганізмами, використовують

для наукових і практичних потреб. Для кола

геназ Clostridium histolyticum створено техно

логічні лінії виробництва. Утім, цю групу

протеолітичних ферментів виявлено лише

у небагатьох представників світу мікробів,

і тому вона викликає заінтересованість і увагу до

слідників для подальшого пошуку і вивчення.

генази з Cytophaga sp. L431 використовува

ли ультрафільтрацію й дворазову хромато

графію на ДЕАЕсефарозі і таким чином

одержували препарат ферменту, гомогенність

якого підтверджували дані SDSPAGE [72].

Очищення аспергілопептидази з A. niger

здійснювали шляхом осадження з культу

ральної рідини ацетоном. Препарат, розчине

ний у воді, пропускали через хроматографіч

ну колонку з ДЕАЕцелюлозою. Гомогенність

препарату визначали аналітичним диск

електрофорезом. У результаті виявили два

компоненти, один з яких видаляли за допомо

гою вторинного осадження ацетоном і отри

мували гомогенну протеазу з колагенолітич

ною дією і молекулярною масою 21 кДа [73].

Практичне застосування

колагеназ мікроорганізмів

Колагенолітичні ферменти мікробного

походження відзначаються здатністю гідро

лізувати колагенові волокна різних типів.

Їх можна використовувати для повного або

часткового гідролізу відповідних колагенів,

зокрема для вивчення і визначення аміно

кислотного складу тропоколагенової моле

кули [74, 75].

Інші важливі галузі застосування кола

геназ — медицина і біотехнологія. Так, для

дезінтеграції сполучної тканини, одержан

ня суспензії клітин або клітинних новоутво

рень зі збереженням життєздатності клітин

необхідним є вибіркове руйнування позаклі

тинного матриксу без ушкодження поверхні

живих клітин. Механічні засоби у цьому разі

неефективні через високу стійкість матрик

су порівняно з клітинами. Протеази з широ

кою субстратною специфічністю сильніше

руйнують білкове покриття клітин, аніж

матрикс, оскільки колаген практично не

піддається їхній дії. Єдиним ефективно

діючим засобом є високоспецифічні колаге

нази, які вибірково руйнують молекули ко

лагену і не діють на інші білки.

Колагенолітичні ферменти мікроорганіз

мів можуть бути використані в медицині —

для лікування деяких захворювань печінки,

грижі інвертебрального диска хребта, опі

ків, обморожувань, для прискорення від

торгнення струпів і некротичних тканин,

трофічних виразок, щоб пришвидшити очи

щення гнійнонекротичних нальотів. Поряд

із цим колагенази необхідні для одержання

і культивування клітинних культур людсь

ких і тваринних тканин, які є джерелами

активаторів плазміногену в тромболітичній

терапії. У біології клітин колагенолітичні

ферменти застосовують для руйнування по

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

12. Sepulveda P., Murgui A., Lopez/Ribot J. L. et

al. Evidence for the presence of collagenous

domains in Candida albicans cell surface

proteins // Infect. Immun. — 1995. —

V. 63, N6. — P. 2173–2179.

13. Sela M. N., Kohavi D., Krausz E. et al.

Enzymatic degradation of collagenguided

tissue regeneration membranes by periodon

tal bacteria // Clin. Oral. Implants. Res. —

2003. — V.14, N3. — Р. 263–268.

14. Lamont R. J., Jenkinson H. F. Life below the

gum line: pathogenic mechanisms of

Porphyromonas gingivalis // Microbiol. Mol.

Biol. Rev. — 1998. — V. 62, N4. —

P. 1244–1263.

15. Wittstock M., Flemmig T. F., Schmidt H. et al.

Serodiagnosis of Porphyromonas gingivalis

infection by immunoblot analysis with recom

binant collagenase // J. Clin. Microbiol. —

1996. — V. 34. — P. 2411–2413.

16. Lawson D. A., Meyer T. F. Biochemical char

acterization of Porphyromonas (Bacteroides)

gingivalis collagenase // Infect. Immun. —

1992. — V. 60, N4. — P. 1524–1529.

17. Bleeg H. S., Polenik P. Sodium dodecyl sul

fate potentiates collagen degradation by pro

teases from Porphyromonas (Bacteroides) gin/

givalis // FEMS Microbiol. Ecol. — 1991. —

V. 85, N2. — P. 125–132.

18. Labadie J. Synthesis of collagenase by phy

topathogenic bacterium Corynebacterium

rathayii // J. Appl. Bacteriol. — 1990. —

V. 69, N6. — P. 828–833.

19. Labadie J. C., Gaillard B., Potier P. Invol

vement of the collagenase produced by Cory/

nebacterium rathayii in its adhesion to colla

gen // FEMS Microbiol. Lett. — 1991. —

V. 79, N1. — P. 75–82.

20. Lund T., Granum P. E. The 105kDa protein

component of Bacillus cereus nonhaemolyt

ic enterotoxin (Nhe) is a metalloprotease

with gelatinolytic and collagenolytic activi

ty // FEMS Microbiol. Lett. — 1999. —

V. 178, N2. — P. 355–361.

21. Beecher D. J., Olsen T. W., Somers E. B.,

Wong A. C. L. Evidence for contribution of

tripartite hemolysin BL, phosphatidylcholi

nepreffering phospholipase C, and collage

nase to virulence of Bacillus cereus endoph

thalmitis // Infect. Immun. — 2000. —

V. 68. — P. 6269–5276.

22. Chakrabarty A. N., Dastidar S. G., Sen A. et al.

Leprosy bacillus — possibly the first

chemoautotrophic human pathogen cultivat

ed in vitro and characterised // Indian J. Exp.

Biol. — 2001. — V. 39, N10. — P. 962–983.

23. Dinges M. M., Orwin P. M., Schlievert P. M.

Exotoxins of Staphylococcus aureus // Clin.

1. Неклюдов А. Д. Пищевые волокна живот

ного происхождения. Коллаген и его фрак

ции как необходимые компоненты новых и

эффективных пищевых продуктов //

Прикл. биохимия и микробиология. —

2003. — T. 39, №3. — С. 261–272.

2. Ramachadran G. N., Reddi A. H. Biochemistry

of collagen. — N.Y. and London: Plenum

Press, 1976. — 576 p.

3. Bond M. D., Van Wart H. E. Relationship

between the individual collagenases of

Clostridium histolyticum: evidence for evo

lution by gene duplication // Biochemistry.

— 1984. — V. 23, N13. — P. 3092–3099.

4. Mandl J., Zipper H., Ferguson L. T. Clostri/

dium histolyticum collagenase: its purifica

tion and properties // Arch. Biochem.

Biophys. — 1958. — V. 74. — P. 465–472.

5. Bruggemann H., Baumer S., Fricke W. F. et

al. The genome sequence of Clostridium

tetani, the causative agent of tetanus disease

// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2003. —

V. 100, N3. — P. 1316–1321.

6. Awad M. M., Ellemor D. M., Bryant A. E. et

al. Consruction and virulence testing of a

collagenase mutant of Clostridium perfrin/

gens // Microb. Pathog. — 2000. — V. 28,

N2. — P. 107–117.

7. Shimamoto S., Moriyama R., Sugimoto K. et

al. Partial characterization of an enzyme

fraction with protease activity which con

verts the spore peptidoglycan hydrolaze

(SleC) precursor to an active enzyme during

germination of Clostridium perfringens s40

spores and analysis of a gene cluster

involved in the activity // J. Bacteriol. —

2001. — V. 183, N2. — P. 3742–3751.

8. Jakson R. J., Dao M. L., Lim D. V. Cellasso

ciated collagenolytic activity by group B

Streptococci // Infect. Immunol. — 1994. —

V. 62, N12. — P. 5647–5651.

9. Jakson R. J., Lim D. V., Dao M. L.

Identification and analysis of a collagenolyt

ic activity in Streptococcus mutans //

Curr.Microbiol. — 1997. — V. 34, N1. —

P. 49–54.

10 Harrington D. J., Russell R. R. B. Identifica

tion and characterization of two extracellular

proteases of Streptococcus mutans // FEMS

Microbiol. Lett. — 1994. — V. 121, N2. —

P. 237–242.

11. Nishimura M., Nikawa H., Yamashiro H. et

al. Cellassociated collagenolytic activity by

Candida albicans // Mycopathologia. —

2002. — V. 153, N3. — P. 125–128.

ЛІТЕРАТУРА