Біотехнологія 2008 Том 1, №3

Подождите немного. Документ загружается.

Експериментальні статті

На відміну від антидДНК АТ, антигісто

нові АТ було виявлено у складі 12 препара

тів Ig молозива породіль (рис. 3). При цьому

у шести препаратах рівень їх був близьким

або перевищував рівень антигістонових АТ,

виявлених у препаратах IgG сироватки

крові хворих на розсіяний склероз. Найви

щим вмістом антигістонових АТ характери

зувався препарат № 4, де рівень антигістоно

вих АТ у 2,5 раза перевищував рівень їх

у препаратах IgG сироватки крові хворих на

розсіяний склероз. Варто зазначити, що, на

відміну від інших препаратів Ig, молозиво

породіллі №4 окрім антигістонових АТ міс

тило також антидДНК АТ. Присутність ав

тоАТ із різною специфічністю у молозиві

жінки дає підстави припустити, що в її орга

нізмі можуть відбуватися зміни в імунному

статусі, а отже в подальшому це може приз

водити до виникнення автоімунних або

алергічних захворювань.

Важливою характеристикою автоАТ

є їхня каталітична активність щодо автоАГ.

Встановлено, що ДНКгідролізуючі антиті

ла (ДНКзими) присутні у крові хворих на

автоімунні та деякі інші захворювання,

однак їх не виявлено у крові клінічно здоро

вих людей. ДНКзими було знайдено у сиро

ватці крові пацієнтів з автоімунними захво

рюваннями (системний червоний вівчак,

ревматоїдний артрит, автоімунний тирої

дит, розсіяний склероз та ін.), а також у хво

рих на СНІД, променеву хворобу та деякі

лімфопроліферативні захворювання (Влім

фолейкози) [8, 25]. ДНКгідролізуючі анти

тіла ізотипів sIgA та IgG було також виявле

но у молоці та молозиві клінічно здорових

породіль [17]. Частота, з якою ці абзими

трапляються у молозиві, та взаємозвязок їх

з автоімунними порушеннями у породіль за

лишаються малодослідженими.

Ми провели аналіз ДНКгідролізуючої

активності препаратів Ig молозива породіль.

Відомо, що ДНКзимам притаманна топоізо

меразна активність щодо надспіралізованої

ДНК плазміди [26]. ДНКзими, подібно до

топоізомераз, каталізують розриви в одній

із двох ниток ДНК, що призводить до утво

рення релаксованої форми ДНК плазміди.

Оскільки ці дві форми ДНК мають різну

електрофоретичну рухливість, їх можна

розділити електрофорезом у гелі агарози.

Було встановлено, що препарати Ig №4, 8,

18 та 21 гідролізують надспіралізовану плаз

мідну ДНК подібно до ДНКзимів, виділених

із сироватки крові пацієнтів з автоімунними

захворюваннями (рис. 4). В інших препаратах

Ig топоізомеразну активність не виявлено.

розсіяний склероз, а як негативний — пре

парати IgG сироватки крові клінічно здоро

вих донорів. Було встановлено, що вміст ан

тидДНК АТ в усіх препаратах Ig молозива

породіль, окрім препарату Ig №4, суттєво не

відрізнявся від вмісту антидДНК АТ у пре

паратах IgG, виділених із сироватки крові

здорових донорів (рис. 3). Вміст антидДНК

АТ у препараті № 4 був достовірно вищим,

ніж у інших препаратах АТ, хоча й був ниж

чим, ніж у препаратах IgG, виділених із си

роватки крові хворих на розсіяний склероз.

Рис. 2. Рівень виживання ТKклітин лінії Jurkat під

впливом препаратів Ig (1–25), очищених із молоK

зива породіль. К — контроль (за відсутності Ig)

Рис. 3. Імуноферментний аналіз (ІФА) відносного

вмісту автоKАТ зі спорідненістю до дволанцюгової

ДНК (антиKдДНК АТ) та гістонів (антигістонові

АТ) у препаратах Ig.

На діаграмі показано співвідношення вмісту авто

АТ у препаратах Ig, визначеного за величиною оп

тичного поглинання забарвлених продуктів перок

сидазної реакції: 1–25 — препарати Ig молозива

породіль; К1+, К2+ — препарати Ig сироватки

крові хворих на розсіяний склероз; К1–, К2– —

препарати Ig сироватки крові клінічно здорових до

норів

антигістонові АТ

антидДНК АТ

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

не є вузькоспецифічними щодо субстратів

і крім ДНК вони можуть також гідролізува

ти синтетичні олігонуклеотиди та різні типи

РНК [7, 26]. Тому не виключено, що ДНК

зими каталітично активних препаратів Ig

№4, 8, 21 є автоАТ зі спорідненістю до одно

ланцюгової ДНК або РНК.

У табл. 1 подано узагальнені результати

дослідження антигенної специфічності, ци

тотоксичної та каталітичної активності пре

паратів Ig молозива породіль. Як випливає

із результатів цього аналізу, функціональна

активність Ig молозива двох породіль (№4

і №21) суттєво відрізняється від функціона

льної активності Ig інших породіль. Спіль

ною ознакою для породіль №4 і №6 є:

– високий вміст секреторних імуногло

булінів класу А;

– низька (або відсутня) цитотоксична ак

тивність щодо людських лейкемічних Т

клітин лінії Jurkat;

– наявність антигістонових АТ;

– топоізомеразна та протеолітична ак

тивність.

Наведена сукупність ознак свідчить про

те, що стан гуморального імунітету цих по

роділь відрізняється від стану інших поро

діль, і причиною цих змін можуть бути авто

імунні процеси, пов’язані з вагітністю та

пологами. В анамнезі цих породіль виявле

но суттєві відхилення від норми, зокрема

перебіг вагітності у них супроводжувався

загрозою переривання вагітності, токсико

зом, набряками кінцівок, що певною мірою

Іншим типом абзимів, присутність яких

в організмі свідчить про автоімунні порушен

ня, є протеїнгідролізувальні автоАТ (про

табзими). Протабзими класів sIgA і IgG, що

здатні гідролізувати бетаказеїн жіночого та

коров’ячого молока, було виявлено у молоці

клінічно здорових жінок і в сироватці крові

хворих на СНІД [27, 28]. Нами було встанов

лено, що високоочищені препарати sIgA,

виділені з молозива породіль, гідролізують

гістон Н1 [29]. Антитіла класу IgG із подіб

ною субстратною специфічністю також було

знайдено у сироватці крові хворих на розсія

ний склероз (дані не опубліковано). Одержа

ні результати вказують на те, що абзими, які

гідролізують гістон Н1, подібно до інших

протабзимів, можуть слугувати маркерами

автоімунних порушень в організмі людини.

У даній роботі встановлено, що препарати Ig

№ 4 та № 21 гідролізують гістон Н1 (рис. 5).

Іншим препаратам не притаманна каталі

тична активність щодо цього білка.

Враховуючи ту обставину, що препарати

Ig були недостатньо очищені від домішок

інших білків молозива, не можна виключи

ти, що каталітична активність деяких із цих

препаратів може бути наслідком дії домі

шок ензимів молока. Підвищений вміст ав

тоАТ зі спорідненістю до ДНК та гістонів

у складі каталітично активних препаратів

Ig №4 і №21 свідчить на користь присутнос

ті в них абзимів. Відсутність автоАТ зі спо

рідненістю до дволанцюгової ДНК у складі

препаратів Ig № 8, 18, 21 не виключає мож

ливості функціонування ДНКзимів. Відомо,

що, на відміну від протабзимів, ДНКзими

Рис. 4. Гідроліз плазмідної ДНК під впливом

препаратів Ig молозива породіль:

3, 7, 17, 20 — препарати Ig, у яких топоізомеразна

активність відсутня;

4, 8, 18, 21 — препарати Ig, яким притаманна топо

ізомеразна активність;

К — плазміда pBR322. Стрілками вказано положен

ня на гелі релаксованої (РП) та надспіралізованої

(СП) форм плазмідної ДНК

Рис. 5. Гідроліз гістону Н1 під впливом препаратів

Ig молозива породіль:

3, 22 — препарати Ig, у яких протеолітична актив

ність відсутня;

4, 21 — препарати Ig, здатні гідролізувати гістон

Н1; К — гістон Н1. Стрілкою вказано положення на

гелі гістону Н1

Н1

2221

СП

РП

2120

181787

Експериментальні статті

нуклеопротеїнів ядра можуть слугувати

діагностичними маркерами розвитку дея

ких автоімунних захворювань [6, 23]. Для

визначення положення ядер фіксовані

клітини лінії Jurkat фарбували флуоресцен

тним барвником DAPI. Встановлено, що

у препаратах Ig №4, 21 і 24 присутні авто

АТ класу IgA зі спорідненістю до біострук

тур Тклітин лінії Jurkat (рис. 6). У препа

раті Ig породіллі № 20 автоАТ класу sIgA

з подібною антигенною специфічністю не

виявлено. Накладання фазовоконтрастних

та флуоресцентних зображень клітин дозво

лило продемонструвати, що антигени авто

sIgA антитіл препаратів Ig №4 містяться

у ядрі клітин і, ймовірно, є компонентами

підтверджує припущення щодо розвитку ав

тоімунних порушень.

Важливою ознакою автоімунних пору

шень у людини є поява у сироватці крові ав

тоАТ до внутрішньоклітинних автоанти

генів [23]. Враховуючи ту обставину, що

sIgA є головним компонентом фракції Ig мо

лозива людини, було проведено досліджен

ня спорідненості sIgAантитіл препаратів Ig

до антигенів Тклітин лінії Jurkat. Викорис

тано препарати Ig породіль №4, 20, 21, 24,

у яких вміст sIgA, згідно з даними, наведе

ними на рис.1, був найвищим. Для виявлен

ня sIgA застосовували FITCмічені IgG кози,

моноспецифічні до Нланцюгів sIgA люди

ни. Відомо, що автоАТ зі спорідненістю до

Таблиця 1. Характеристика функціональної активності препаратів Ig,

виділених із молозива породіль

Донори

молозива

№ п/п

Цитотоксична

активність Ig

Мітогенна

aктивність

Вміст

антиДНК

АТ

Вміст анти

гістонових

АТ

Топоізоме

разна

активність

Протеолітич

на

активність Ig

щодо гістону

Н1

1 + + +

2 + +

3 + + + +

4 + + + ++ + + + +

5 + + +

6 + + +

7 + + +

8 + +

9 + + +

10 + +

11 + + +

12 + + + + +

13 + + + ++

14 + +

15 +

16 + +

17 + +

18 + + +

19 + +

20 + + + + +

21 + + + + + + + +

22 +

23 + + +

24 +

25 + + +

Примітка: «+» — низький, «++» — середній, «+++» — високий рівень прояву функціонального марке

ра у препаратах Ig.

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

1. Полетаев А. Г. Иммунологический гомун

кулус (иммункулус) в норме и при патоло

гии // Биохимия. — 2002. — Т. 67, №5. —

С. 721–730.

2. Mackay I. R. Autoimmunity: Paradigms of

Burnet and complexities of today // Immun.

Cell. Biol. — 1992. — V. 70, N3. —

P. 159–171.

3. Avrameas S. Natural autoantibodies. From

horror autotoxicus to gnothi seauton //

Immunol. Today. — 1991. — V. 12, N5. —

P. 154–159.

4. Bouvet J/P., Dighitro G. From natural

polyreactive autoantibodies to a la Carte

monoreactive antibodies to infection agents:

is it a small world after all? // Infection and

Immunity. — 1998. — V. 66, N1. — C. 1–4.

5. Dawson K., Bell D. Production and patho

genic effect of antiDNA antibodies: rele

vance to antisense research // Antisense

Res. Devel. — 1991. — V. 1, N4. —

C. 351–360.

6. Kurien B. T., Scofield R. H. Autoantibody

determination in the diagnosis of systemic

lupus erythematosus // Scan. J. Immunol. —

2006. — V. 64, N3. — P. 227–235.

7. Невинский Г. А., Канышкова Т. Г., Бунева В. Н.

Природные каталитически активные ан

титела (абзимы) в норме и при патологии

// Биохимия. — 2002. — Т. 65, №11. —

С. 1473–1487.

8. Gabibov A., Ponomarenko N., Tretyak E. et al.

// Catalytic autoantibodies in clinical auto

immunity and modern medicine // Auto

imm. Rev. — 2006. — V. 5, N5. —

P. 324–330.

9. Сучков С. В. Сравнительное исследование

каталитических (ДНКгидролизирующих)

и цитотоксических свойств антиДНК ау

тоантител // Бюл. эксперим. биол. мед. —

2001. — Т. 131, №4. — С. 420–423.

10. Kozyr A. V., Sashchenko L. P., Kolesnikov A. V.

et al. AntiDNA autoantibodies reveal toxi

city to tumor cell lines // Immunol. Lett. —

2002. — V. 80, N1. — P. 41–47.

11. Gabibov A. Antibody catalysis: Biochemist

ry, immunology, pathology // Ibid. —

2006. — V. 103, N1. — P. 1–2.

12. Nevinsky G., Bunetva N. Catalytic antibodies

in healthy humans and patients with

autoimmune and viral diseases // J. Cell.

Mol. Med. — 2003. — V. 7, N3. —

P. 265–276.

13. Сervera R., Font J., Balasch J. Pregnancy

outcome in systemic lupus erythematosus:

хроматину. Водночас антигени автоsIgA

антитіл препаратів Ig № 21 і № 24 розміщені

головним чином у цитоплазмі та плазма

тичній мембрані Тклітин лінії Jurkat.

Аналіз результатів проведених дослі

джень дає підстави зробити висновок про те, що

функціональні властивості імуноглобулінів

молозива можуть відображати індивіду

альні особливості стану гуморального імуні

тету у породіль. Проте отримані результати

поки що не дозволяють однозначно стверд

жувати, які саме характеристики антитіл

молозива — цитотоксичність, спорідненість

до автоантигенів чи каталітична актив

ність — можуть слугувати маркерами у ран

ній діагностиці автоімунних порушень у по

роділь. Щоб відповісти на це запитання,

потрібно провести комплексне дослідження

стану здоров’я ширшої вибірки породіль,

яких за сумою виявлених нами ознак можна

віднести до групи ризику.

Автори висловлюють подяку д.б.н. М. Д. Лу

цику за надані ним препарати гістонів. Ро

боту виконано за фінансової підтримки

спільного проекту НАН України та Сибір

ського відділення Російської АН.

Рис. 6. Аналіз антигенної специфічності

секреторних IgA препаратів Ig молозива породіль

щодо лейкемічних ТKклітин лінії Jurkat:

К — клітини, не інкубовані з препаратами Ig (конт

роль);

4, 21 — клітини, інкубовані з Ig препаратів №4 та 21;

ФМК — фазовоконтрастна мікроскопія препаратів

клітин;

AIgA — флуоресцентна мікроскопія препаратів

клітин після оброблення їх FITCмічени

ми IgG кози, специфічними до Нланцюгів

IgA людини;

DAPI — флуоресцентна мікроскопія препаратів

клітин, зафарбованих DAPI

ЛІТЕРАТУРА

Експериментальні статті

Mol. Med. — 2003. — V. 7, N3. —

P. 265–276.

26. Nevinky G. A., Buneva V. N. Human cathalyt

ic RNA and DNAhydrolyzing antibodies //

J. Immunol. Methods. — 2002. — V. 269,

N1–3. — P. 235–249.

27. Odintsova E. S., Buneva V. N., Nevinsky G. A.

Caseinhydrolyzing activity of sIgA antibod

ies from human milk // J. Mol. Recognit. —

2005. — V. 18, N5. — P. 413–421.

28. Одинцова Е. С., Харитонова М. А., Барано/

вский А. Г. и др. Протеолитическая актив

ность IgG антител из крови больных синд

ромом приобретенного иммунодефицита

человека // Биохимия. — 2006. — Т. 71,

№3. — С. 320 — 332.

29. Кіт Ю. Я., Стойка Р. С. Каталітично ак

тивні антитіла (абзими) молока людини

і деякі механізми регуляції їх активності

// Матеріали IX Укр. біохім. з’їзду, 24–27

жовтня 2006 р., Харків. — Т. 1. — 20 с.

good news for the new millennium // Auto

immun. Rev. — 2002. — V. 1, N6. —

P. 354–359.

14. Канышкова Т. Г., Бунева В. А., Невинс/

кий Г. А. Биологические функции молока

человека и его компонентов // Успехи

совр. биологии. — 2002. — Т. 122, №3. —

С. 259–271.

15. Quan C. P., Berneman A., Pires R., Bouvet J. P.

Natural polyreactive secretory immuno

globulin A autoantibodies as a possible barri

er to infection in humans // Infect. Im

mun. — 1997. — V. 65, N10. —

Р. 3997–4004.

16. Кит Ю. Я., Семенов Д. В., Канышкова Т. Г.

и др. Секреторные иммуноглобулины А мо

лока человека обладают сродством к оли

гонуклеотидам и нуклеиновым кислотам

// Биохимия. — 1999. — Т. 64, №1. —

С. 52–59.

17. Кіт Ю. Я., Стойка Р. С. Каталiтично ак

тивні антитіла (абзими) молока людини //

Укр. біохім. журн. — 2007. — Т. 79,

№2. — С. 5–16.

18. Иммуноглобулины / Под ред. Г. Леитмена

и Р. Гуда. — М.: Мир, 1981. — C. 212–230.

19. Lowry O. H., Rosebrough N. J // Protein mea

surement with the folin phenol reagent // J.

Biol. Chem. — 1951. — V. 193, N1. —

P. 265–270.

20. Laemmly U. K. A cleavege of structugal pro

tein during the assambly of the head of bac

teriofage T4 // Nature. — 1970. — V. 227,

N5259. — P. 2244–2750.

21. Nevinsky G. A., Kanyshkova T. G., Semenov

D. V. et al. Secretory immunoglobulin A from

healthy human mothers’ milk catalyzes

nucleic acid hydrolysis // Appl. Biochem.

Biotechnol. — 2000. — V. 83, N1–3. —

P. 115–129.

22. Polosukhina D. I., Buneva V. N., Doronin B. M.

et al. Hydrolysis of myelin basic protein by

IgM and IgA antibodies the sera of patients

with multiple sclerosis // Med. Sci.

Monit. — 2005. — V. 11, N8. —

P. 266–272.

23. Herrington C. S., McGee J. O. D. Diagnostic

Molecular Pathology. — Oxford.: IRL Press,

1992. — 536 p.

24. Старикович М. А., Кит Ю. Я., Хавунка М. Я.

и др. Цитотоксическая активность имму

ноглобулинов плазмы крови клинически

здоровых людей и больных рассеянным

склерозом // Цитокины и воспаление. —

2006. — Т. 5, №4. — С. 26–31.

25. Nevinsky G. A, Buneva V. N. Catalytic anti

body in healthy humans and patients with

autoimmune and viral diseases // J. Cell

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

IMMUNOGLOBULINS OF COLOSTRUM

AS NOVEL MOLECULAR MARKERS

OF PRECLINICAL DIAGNOSTICS

OF AUTOIMMUNE DISORDERS

IN PARTURIENT WOMEN

Yu. Ya. Kit

, M. O. Starykovych

R. O. Bilyy

, N. R. Skorohyd

L. B.Yanyv

, R. S. Stoika

Institute of Cell Biology of National

Academy of Sciences of Ukraine, Lviv

Lviv Regional Perinatal Center

E/mail: kit@cellbiol.lviv.ua

Analysis of antigen specificity, catalytic and

cytotoxic activity of colostrum immunoglobu

lins was carried out in order to detect novel mole

cular markers of autoimmune disorders.

Immunoglobulins were isolated from parturient

women colostrums by precipitation with 50%

ammonium sulfate. It was shown that prepara

tions of immunoglobulins possessed significant

ly different cytotoxic activity towards Jurkat

leukemia Tcells, various hydrolyzing ability

towards plasmid DNA and histone H1, and also

differed by content of autoantibodies to double

stranded DNA and histones. We concluded that

functional properties of colostrums immuno

globulins depended on individual peculiarities of

parturient women humoral immunity. These

properties can be used for complex detection of

early autoimmune disorders linked with preg

nancy and delivery.

Key words: colostrum of healthy women, immunoglo

bulins, cytotoxic activity, catalytic activity, level of

autoAB.

ИММУНОГЛОБУЛИНЫ МОЛОЗИВА

КАК МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ

ДОКЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

АУТОИМУННЫХ НАРУШЕНИЙ

У РОЖЕНИЦ

Ю. Я. Кит

, М. О. Старикович

Р. О. Билый

, Н. Р. Скорохид

Л. Б. Янив

, Р. С. Стойка

Институт биологии клетки

НАН Украины, Львов

Львовский областной перинатальный центр

E/mail: kit@сellbiol.lviv.ua

С целью выявления новых молекулярных

маркеров аутоимунных нарушений у рожениц

проведен анализ антигенной специфичности,

каталитической и цитотоксической активнос

ти иммуноглобулинов, полученных из молози

ва осаждением 50%м сульфатом аммония.

Установлено, что препараты иммуноглобули

нов существенно различаются по цитотокси

ческой активности относительно лейкемичес

ких Тклеток линии Jurkat, способности

гидролизовать плазмидную ДНК и гистон Н1,

а также по содержанию аутоАТ к двухцепоч

ной ДНК и гистонам. Сделан вывод о том, что

функциональные свойства иммуноглобулинов

молозива зависят от индивидуальных особен

ностей состояния гуморального иммунитета

рожениц. Эти свойства могут быть использова

ны для комплексного определения ранних ау

тоиммунных нарушений у женщин, связан

ных с беременностью и родами.

Ключевые слова: молозиво здоровых рожениц, им

муноглобулины, цитотоксическая активность, ка

талитическая активность, уровень аутоАТ.

Експериментальні статті

нози, Dглюкуронової і піровиноградної

кислот (3:2:1:1:1:1) та структурою повторю

ваної ланки вуглеводного ланцюга. Різниця

між цими ЕПС полягає в тому, що ацильова

ний полісахарид містить жирні кислоти

(С

–С

) [1].

Глюкуронова й піровиноградна кислоти

є бічними замісниками повторюваної ланки

вуглеводного ланцюга, з’єднаними із залиш

ками рамнози і манози, відповідно. Залежно

від умов культивування продуцента у складі

етаполану міститься 25–35% мінеральних

компонентів (одновалентних катіонів). На

явність мінеральних компонентів у складі

етаполану зумовлена структуруванням цьо

го ЕПС у процесі його біосинтезу катіонами,

що містяться в середовищі культивування

продуцента [1]. Реологічні властивості роз

чинів етаполану, що визначають його прак

тичну значущість (здатність до емульгуван

ня, підвищення в’язкості за присутності

одно і двовалентних катіонів у разі зниження

pH, за низьких швидкостей зсуву, у системі

гліцин), залежить від співвідношення

у його складі ацильованих і неацильованих

компонентів, а також від співвідношення

жирних кислот в ацильованому полісаха

риді [1].

Слід зазначити, що сукупність таких рео

логічних властивостей не характерна для жод

ного з відомих мікробних полісахаридів.

Мікробні екзополісахариди (ЕПС) вик

ликають великий інтерес у дослідників зав

дяки унікальним фізикохімічним власти

востям цих полімерів, що визначають їх

використання у нафтодобувній, харчовій,

хімічній промисловості, сільському госпо

дарстві, медицині.

Acinetobacter sp. В7005 є продуцентом

комплексного екзополісахариду, названого

нами етаполаном [1]. На основі етаполану

розроблено спосіб ізоляції припливу пласто

вих вод, який дає змогу в разі застосування

1 т етаполану видобути додатково близько

240 т нафти та знизити її обводнення з 84 до

15%. З використанням етаполану як голов

ної складової частини розроблено технології

виготовлення косметичних кремів під за

гальною назвою «Екол», технічного мийно

го засобу БІМС1. Встановлено можливість

і доцільність застосування етаполану під

час виробництва хліба та хлібопродуктів.

Завдяки спроможності етаполану адсорбу

вати та виводити з організму солі важких

металів його рекомендовано для профілак

тичного харчування [1].

Етаполан складається з нейтрального

(мінорний компонент) і двох кислих поліса

харидів, один з яких є ацильованим. Ацильо

ваний і неацильований полісахариди іден

тичні за молярним співвідношенням

Dглюкози, Dманози, D/галактози, L/рам

УДК 579.841:577.15

УДОСКОНАЛЕННЯ БІОТЕХНОЛОГІЇ

МІКРОБНОГО ЕКЗОПОЛІСАХАРИДУ

ЕТАПОЛАНУ НА ЕТАНОЛІ

Визначено особливості енергетичного й конструктивного метаболізму С

субстратів у Acinetobacter sp.

В7005 — продуцента екзополісахариду етаполану, виявлено сайти метаболічного лімітування і розроблено

підходи до їх усунення.

Показано, що «вузьким» місцем метаболізму етанолу в Acinetobacter sp. В7005 є асиміляція ацетату: ре

акція, що каталізується ацетилКоАсинтетазою, є швидкістьлімітувальною. Встановлено умови культивуван

ня бактерій, що дають змогу усунути лімітування С

метаболізму і підвищити у три рази активність ацетил

КоАсинтетази.

За таких умов синтезується високоацильований етаполан зі ступенем ацилювання 3–15%. Середня молеку

лярна маса полісахариду становить 1,5 млн. і не змінюється у процесі виділення й очищення препарату. Підви

щений вміст жирних кислот і висока молекулярна маса етаполану зумовлюють поліпшення реологічних влас

тивостей його розчинів, що визначають практичну значущість цього полісахариду.

Ключові слова: екзополісахариди, біосинтез, метаболізм етанолу, регуляція С

метаболізму, фізико

хімічні властивості.

Т. П. Пирог Інститут мікробіології і вірусології НАН України, Київ

Ю. В. Корж E/mail: tapirog@usuft.kiev.ua

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

— 0,3; MgSO

⋅ 7H

O — 0,4; CaCl

O — 0,1; FeSO

·7H

O — 0,01; середовиK

ще 4: KH

— 3,4; КOH — 0,9; КCl — 4,4;

— 0,6; MgSO

·7H

O — 0,4; CaCl

⋅

O — 0,1; FeSO

·7H

O — 0,01; середовиK

ще 5: KH

— 1,7; КOH — 0,45; NH

—

0,3; MgSO

·7H

O — 0,4; CaCl

·2H

O — 0,1;

FeSO

·7H

O — 0,01; середовище 6: KH

—

2,0; КOH — 0,55; КCl — 5,6; NH

— 0,6;

MgSO

·7H

O — 0,4; CaCl

·2H

O — 0,1;

FeSO

·7H

O — 0,01. Середовища різнилися

між собою молярністю фосфатного буфера,

загальною кількістю солей, наявністю Nа

концентрацією одновалентних катіонів.

Так, молярність буфера становила (М): сере

довища 1 і 2 — 0,05; 3 і 4 — 0,025; 5 і 6 —

0,0125. У середовища додатково вносили

0,5% (об’ємна частка) дріжджового автолі

зату та 0,006−0,009 % пантотенату кальцію

(вітамін В

). Штами В7005 і В7005 (1НГ)

є ауксотрофами за цим вітаміном [2,3],

який є попередником коензиму А. Джерелом

вуглецю та енергії слугував етанол у концент

рації 1% (об’ємна частка).

Як посівний матеріал використовували

культуру з експоненційної фази росту (16−

24 год), вирощену на мінеральних середови

щах 1÷6 із різними джерелами вуглецю.

Джерелом вуглецю та енергії у процесі одер

жання посівного матеріалу і біосинтезу ЕПС

були: а) 0,5 % етанолу (об’ємна частка); б)

1% етанолу (об’ємна частка) за наявності

або відсутності ацетату калію (0,1% або

0,01%); в) 1,6% ацетату калію. Кількість по

сівного матеріалу становила 5% від об’єму

середовища.

Ензиматичні аналізи. Визначення ак

тивності ферментів здійснювали в безклі

тинних екстрактах. Одержання безклітин

них екстрактів проводили як описано

в роботі [4].

Ключові ферменти С

/метаболізму та

гліоксилатного циклу. Активність алко

гольдегідрогенази (КФ 1.1.1.1), ацетальде

гіддегідрогенази (КФ 1.2.1.3 і КФ 1.2.1.4),

ацетилКоАсинтетази (КФ 6.2.1.1), ізоцит

ратліази (КФ 4.1.3.1) та малатсинтази (КФ

4.1.3.2) визначали як описано в роботі [4].

Ферменти циклу трикарбонових кис/

лот. Активність цитратсинтази (КФ 4.1.3.7)

аналізували за зниженням концентрації

ацетилфосфату у присутності коензиму А та

оксалоацетату, як описано в роботі [5]. Ак

тивність аконітатгідратази (КФ 4.2.1.3) [6]

встановлювали в присутності цисаконітату

за відновленням НАДФ

при 340 нм. Актив

ність ізоцитратдегідрогенази (КФ 1.1.1.41)

[7], малатдегідрогенази (КФ 1.1.1.37) [8]

Окрім того, для синтезу етаполану може бу

ти використаний широкий набір вуглецевих

субстратів (у тому числі й невуглеводних),

тимчасом як інші відомі полісахариди одер

жують тільки на основі вуглеводної сировини.

Здатність до синтезу ЕПС виявлено у ба

гатьох мікроорганізмів, проте рівень синте

зу цих полімерів коливається в широких ме

жах як для різних продуцентів ЕПС, так

і для одного продуцента в різних умовах його

культивування. Створення високоефектив

них технологій одержання практично важ

ливих метаболітів базується на цілеспрямо

ваній регуляції процесу біосинтезу, що у свою

чергу потребує глибоких знань фізіології,

біохімії та генетики продуцентів.

Відомо, що в послідовності метаболічних

реакцій, пов’язаних з утворенням ключо

вих інтермедіатів, існують лімітувальні ре

акції, швидкість яких нижча від інших або

які супроводжуються великою витратою

енергії чи втратою вуглецю субстрату. Вияв

лення таких сайтів метаболічного ліміту

вання та розроблення на основі знань прин

ципів регуляції метаболізму дасть змогу

реалізувати біотехнологічні процеси з най

вищою ефективністю.

Мета роботи полягала у визначенні шля

хів регуляції різних ланок метаболізму

у процесі вирощування штамів Acinetobac/

ter sp. В7005 і В7005 (1НГ) на С

субстра

тах для вдосконалення процесу біосинтезу

ЕПС етаполану.

Матеріали і методи

Об’єкти досліджень. О’єктом дослі

джень був штам Acinetobacter sp. — проду

цент комплексного екзополісахаридного

препарату етаполану [2], депонований у Де

позитарії Інституту мікробіології і вірусо

логії НАН України під номером В7005, а та

кож мутантний штам Acinetobacter sp.

В7005 (1НГ), що не утворює ЕПС, який бу

ло одержано з вихідного за допомогою нітро

зогуанідинового мутагенезу [3].

Культивування Acinetobacter sp. ВF7005.

Культивування бактерій здійснювали в кол

бах на качалці (220 об/хв) при 30 °С, рН

6,8−7,0, упродовж 16−120 год на рідких мі

неральних середовищах такого складу (г/л):

середовище 1: KH

— 6,8; NaOH — 0,9;

NaCl — 1,05; NH

— 0,6; MgSO

·7H

O —

0,4; CaCl

·2H

O — 0,1; FeSO

·7H

O — 0,01;

середовище 2: KH

— 6,8; КOH — 1,8;

КCl — 1,4; NH

— 0,6; MgSO

·7H

O —

0,4; CaCl

·2H

O — 0,1; FeSO

⋅7H

O — 0,01;

середовище 3: KH

— 3,4; КOH — 0,9;

Експериментальні статті

лот — ваговим методом після дезацилюван

ня розчинів ЕПС [16]. Встановлення вмісту

мінеральних компонентів у складі етаполану

здійснювали, обробляючи його катіонітом

КУ28 (Н

). Вміст нейтральних моносаха

ридів визначали за допомогою вуглеводного

аналізатора Biotronik LC2000 [1], а молеку

лярномасовий склад ЕПС — методом

аналітичного градієнтного центрифугуван

ня в розчині хлористого натрію [20]. Як

стандарти молекулярних мас використову

вали декстрани фірми Fluka із молекуляр

ною масою 13,5; 20; 40; 70; 110; 500 тис.

і 2 млн. Вміст вуглеводнів в отриманих

після центрифугування фракціях (об’єм

1 мл) встановлювали за реакцією з фенолом

і сірчаною кислотою.

Вміст компонентів певної молекулярної

маси обчислювали, визначаючи кількість

вуглеводів у відповідних фракціях, і вира

жали в процентах до вихідної (загальної)

кількості вуглеводів. Знаючи процентний

вміст у складі ЕПС компонентів різної моле

кулярної маси, розраховували середню мо

лекулярну масу.

Властивості розчинів етаполану оціню

вали за відносною зміною їхньої в’язкості у

присутності 0,1 М КCl, рН 4−4,5 (за умови

переведення ЕПС в Н

форму), у системі

гліцин. Відносну зміну в’язкості визна

чали за формулою:

де

— в’язкість розчину ЕПС у досліджува

них умовах;

— в’язкість розчину ЕПС

у дистильованій воді.

Результати та обговорення

Вивчення особливостей С

метаболізму

під час росту штамів Acinetobacter sp. В7005

та В7005 (1НГ) на етанолі показало, що

окиснення етанолу до ацетальдегіду каталі

зується НАД

залежною алкогольдегідроге

назою. Акцепторами електронів в ацетальде

гіддегідрогеназній реакції є НАД

і НАДФ

З’ясовано, що в Acinetobacter sp. ацетат

залучається до метаболізму за участю аце

тилКоАсинтетази; анаплеротичною послідов

ністю реакцій, що поповнюють пул С

дикарбо

нових кислот, є гліоксилатний цикл [21].

Подальші дослідження було спрямовано

на визначення активності ферментів циклу

трикарбонових кислот (ЦТК) та деяких

біосинтетичних шляхів [22]. У безклітинно

му екстракті Acinetobacter sp. В7005 і В7005

(1НГ) виявлено високу активність усіх

визначали за відновленням НАД

, а ізоцит

ратдегідрогенази (КФ 1.1.1.42) [5], малат

дегідрогенази (КФ 1.1.1.82) [9] — за віднов

ленням НАДФ

при 340 нм у присутності

ізоцитрату чи малату, відповідно. Актив

ність 2оксоглутаратдегідрогенази (КФ 1.2.4.2)

[10] встановлювали за відновленням НАД

при 340 нм у присутності 2оксоглутарату та

коензиму А, сукцинатдегідрогенази (КФ

1.3.99.1) [6] − за відновленням дихлорфе

ноліндофенолу в присутності феназинмета

сульфату при 600 нм, фумарази (КФ

4.2.1.2) — за утворенням фумарату з малату

при 250 нм [5].

Активність ключових ферментів глю/

конеогенезу та деяких біосинтетичних

шляхів. Активність фосфоенолпіруватсин

тетази (КФ 2.7.9.2) [11] аналізували колори

метрично за зниженням концентрації пірувату

в реакційній суміші (реакція з динітрофе

нілгідразином) при 445 нм [11], фосфо

енолпіруваткарбоксикінази (КФ 4.1.1.49)

[12], оксалоацетатдекарбоксилази (КФ

4.1.1.3) [6] — за утворенням фосфоенолпіру

вату (ФЕП) та пірувату при окисненні

НАДН, а глутаматдегідрогенази (КФ 1.4.1.4)

[13] — за утворенням глутамату при окис

ненні НАДФН і 340 нм. Активність глута

матдегідрогенази (КФ 1.4.1.2) [14] встанов

лювали за відновленням НАД

при 340 нм

у присутності 2оксоглутарату.

Активність ферментів у безклітинних

екстрактах визначали при температурі 28−

С, що є оптимальною для росту даних

бактерій, та виражали у нмоль

хв

–1

мг

–1

білка. Вміст білка в безклітинних екстрак

тах установлювали за Bradford [15].

Визначення швидкості окиснення суб

стратів (етанолу, ацетальдегіду й ацетату)

інтактними клітинами Acinetobacter sp. В7005

та В7005 (1НГ) проводили як описано в ро

боті [4].

Встановлення складу і фізикоFхімічF

них властивостей етаполану. Комплексний

полісахаридний препарат етаполан виділяли

з культуральної рідини осадженням ізопро

панолом після попереднього відокремлення

клітин продуцента та діалізу [1]. Розділення

етаполану на ацильований і неацильований

компоненти здійснювали за розробленим

раніше методом [16]. Для дезацилювання

проводили оброблення ЕПС NаОН у присут

ності NаВН

. Вміст вуглеводів в ЕПС визна

чали колориметричним методом за реакцією

з фенолом і сірчаною кислотою [17], пірови

ноградної кислоти — за реакцією з 2,4диніт

рофенілгідразином [18], уронових кислот —

за реакцією з карбазолом [19], жирних кис

−

⋅

100%,

ηη

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

Аналіз активності ключових ферментів

метаболізму етанолу у процесі культивуван

ня Acinetobacter sp. В7005 на середовищах

1 і 2 показав, що активність ацетилКоА

синтетази в безклітинному екстракті була

в 2,7−5 разів нижчою, ніж активність алко

голь і ацетальдегіддегідрогеназ (табл. 2).

Досліджуючи швидкість окиснення С

суб

стратів інтактними клітинами Acinetobacter

sp. В7005 (1НГ), вирощеними на середови

щах 1 та 2, встановили, що після голодування

клітин упродовж 20 год швидкість дихання

за присутності етанолу й ацетальдегіду не

змінювалась і становила 152,6−157,8 та

153,5−159,4 нмоль О

·хв

–1

·мг

–1

клітин відпо

відно, а за присутності ацетату знижувалась

у 2 і 4 рази на середовищі 2 і середовищі 1,

відповідно, порівняно зі швидкістю окис

нення ацетату клітинами, що не голодували.

Отже, під час росту на етанолі в клітинах

Acinetobacter sp. В7005 і В7005 (1НГ) аце

тат утворюється з вищою швидкістю, ніж

залучається до метаболізму. Тому наші нас

тупні дослідження були спрямовані на по

шук чинників, що забезпечують однакову

швидкість утворення і подальшого мета

болізму ацетату в клітинах бактерій у про

цесі культивування на етанолі.

У результаті ензиматичних і полярогра

фічних досліджень встановлено, що інгібі

ферментів цього циклу (табл. 1). На нашу

думку, наявність обох ключових ферментів

гліоксилатного циклу, а також висока ак

тивність ізоцитратдегідрогенази, глутамат

дегідрогенази і низька активність 2оксо

глутаратдегідрогенази є підтвердженням

того, що ЦТК в Acinetobacter sp. В7005

і В7005 (1НГ) під час росту на етанолі вико

нує переважно біосинтетичну роль.

У процесі асиміляції мікроорганізмами

дво або тривуглецевих субстратів або суб

стратів, катаболізм яких здійснюється через

ацетилКоА чи інтермедіати ЦТК, виникає

необхідність синтезу молекул вуглеводів. Ці

перетворення відбуваються шляхом глюко

неогенезу. Ензиматичні дослідження пока

зали, що під час росту на етанолі в Acineto/

bacter sp. В7005 і В7005 (1НГ) піруват

утворюється з оксалоацетату в оксалоаце

татдекарбоксилазній реакції, а в утворенні

фосфоенолпірувату беруть участь обидва

ключові ферменти глюконеогенезу — ФЕП

карбоксикіназа і ФЕПсинтаза (табл. 1).

Таблиця 1. Активність ферментів

циклу трикарбонових кислот

та деяких біосинтетичних шляхів у

Acinetobacter sp. ВK7005 та ВK7005 (1НГ)

Фермент

Активність,

нмоль

хв

–1

мг

–1

білка

В7005

(1НГ)

Цитратсинтаза 421,3±25,1 405,6±21,6

Аконітаза 340,8±18,0 349,0±19,4

НАД

залежна ізоцит

ратдегідрогеназа

0 0

НАДФ

залежна ізоцит

ратдегідрогеназа

729,7±38,5 717,8±33,8

2Оксоглутаратдегідро

геназа

96,2±4,8 93,4±5,3

Сукцинатдегідрогеназа 183,4±13,9 197,5±15,8

Фумараза 192,1±9,6 186,8±9,9

НАД

залежна малат

дегідрогеназа

654,2±32,7 643,1±32,1

НАДФ

залежна малат

дегідрогеназа

81,9±5,1 79,8±4,3

НАД

залежна глута

матдегідрогеназа

653,9±33,5 642,6±31,8

НАДФ

залежна глута

матдегідрогеназа

247,3±15,6 257,2±16,3

Оксалоацетатдекар

боксилаза

457,3±28,6 446,6±23,3

Фосфоенолпіруваткар

боксикіназа

58,5±2,9 48,7±3,5

Фосфоенолпіруватсин

тетаза

584,4±32,9 487,0±35,4

Таблиця 2. Активність ключових ферментів

метаболізму етанолу в процесі культивування

Acinetobacter sp. ВK7005

Примітки: 1. Культивування бактерій здійсню

вали на середовищі 1 з 0,0006% В

2. Для визначення активності ацетилКоАсин

тетази, ізоцитратліази і малатсинтази бактерії

вирощували на середовищі 2 з 0,0009 % В

. У дуж

ках наведено дані культивування штаму на сере

довищі 1 з 0,0006 % В

Ферменти

Активність

(нмоль

хв

–1

мг

–1

білка)

під час культивування

бактерій

24 год 48 год

НАД

залежна алко

гольдегідрогеназа

365,7±19,6 289,5±17,5

НАД

залежна ацет

альдегіддегідрогеназа

119,5±7,6 93,7±6,5

НАДФ

залежна ацет

альдегіддегідрогеназа

253,7±15,7 197,3±11,3

АцетилКоАсинте

таза

135,7±8,7

(74,5±5,2)

134,1±8,7

Ізоцитратліаза

130,0±7,8

(50,5±2,9)

144,9±9,4

(7,4±0,4)

Малатсинтаза 58,2±3,7 67,4±3,7