Белясова Н.А. Биохимия и молекулярная биология

Подождите немного. Документ загружается.

110

лисахаридом покровов тела насекомых.

Маннаны являются полимерами маннозы (рис. 5.8). В них от главной a-

1,6-цепи отходят короткие ветви (из 1—3 маннозных звена), присоединенные

через a(1®2)- и a(1®3)-гликозидные связи. Маннаны и глюканы — это ос-

новные полисахариды клеточных стенок дрожжей (составляют в них 60—

80% сухого вещества).

Кроме гемицеллюлоз, в состав клеточных стенок грибов входят белки

(6—13%), липиды (2—9%) и неорганические полифосфаты. Белки богаты

серусодержащими аминокислотами и присутствуют в виде комплексов с по-

лисахаридами. Наиболее часто среди таких комплексов встречаются манна-

нопротеины. Кроме структурной функции, маннанопротеинам принадлежит

рецепторная: они воспринимают сигналы из внешней среды и участвуют в

осуществлении клеточных контактов. Структура маннанопротеинов опреде-

ляет иммунологические свойства дрожжей.

Анализ наиболее распространенных клеточных полисахаридов, охаракте-

ризованных в этой главе, позволяет заключить, что их структура и функции

тесно связаны: полисахариды с рыхлой, разветвленной, легко доступной

ферментам структурой выполняют в клетках резервную функцию. Наоборот,

полисахариды, призванные служить механической опорой и защитой для кле-

ток, имеют сложную, компактную структуру, которая упрочняется при взаи-

модействии полисахаридов с веществами других классов: белками, липида-

ми, тейхоевыми кислотами и др. В этих комплексах практически всегда при-

сутствуют межмолекулярные связи, что делает клеточные стенки жесткими,

прочными, трудно доступными ферментативному расщеплению.

Рис. 5.8. Структура фрагмента главной маннановой цепи

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

111

Глава 6. БЕЛКИ. ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗАЦИИ И ФУНКЦИИ

ФЕРМЕНТОВ

Белки представляют собой один из основных классов клеточных макро-

молекул, составляя, например, в микробной клетке до 50% сухого вещества.

Этим удивительным по разнообразию полимерам присущи одни из наиболее

важных и разносторонних клеточных функций.

Мономерными единицами белков служат аминокислоты. Природные

аминокислоты являются 2-аминокарбоновыми кислотами, или a-

аминокислотами. В их молекулах при атоме С-2 (С

) имеются 4 различных

заместителя (рис. 6.1). Таким образом, все a-аминокислоты, кроме глицина,

имеют асимметрический (хиральный) a-углеродный атом (рис. 6.1) и сущест-

вуют в виде двух энантиомеров — L- и D-аминокислот. В большинстве при-

родных пептидов содержатся L-аминокислоты.

Аминокислоты различаются структурой боковых цепей и степенью их по-

лярности. На рис. 6.2 изображено строение боковых групп 20-ти протеино-

генных (положение которых в полипептидах кодируется генетическим ко-

дом) аминокислот. Из них выраженными неполярными (гидрофобными)

свойствами характеризуются боковые группы аланина, валина, лейцина, изо-

лейцина, метионина, цистеина, фенилаланина. Заряженные боковые цепи

содержатся в составе кислых аминокислот (аспарагиновой, глутминовой) и

основных аминокислот (лизина, аргинина, гистидина).

Аминогруппа

Карбоксильная

группа

Боковая

цепь

a-Углеродный

атом

COO

L-аминокислота

(реальное изображение)

Проекционная формула Фишера

Рис. 6.1. Особенности строения L-аминокислот

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

112

H CH

C H

Глицин Аланин Валин

Лейцин Изолейцин

Алифатические

Серосодержащие

Цистеин Метионин

(Gly, G) (Ala, A) (Val, V)

(Leu, L) (Ile, I)

(Cys, C) (Met, M)

Ароматические

Фенилаланин Тирозин Триптофан

(Phe, F)

(Tyr, Y) (Trp, W)

CONH

СеринТреонин Аспарагин Глутамин

Нейтральные

COO

Аспара-

гиновая

кислота

Глута-

миновая

кислота

(Asp, D)

(Glu, E)

Кислые

C N

H H

(Thr, T) (Asn, N) (Gln, Q) (Ser, S

)

Гистидин

Лизин

Аргинин

Основные

Иминокислота

C CH

COO

Пролин

(His, H) (Lys, K) (Arg, R) (Pro, P)

Рис. 6.2. Строение боковых цепей протеиногенных аминокислот

a-Аминокислоты в водных растворах при нейтральных рН существуют пре-

имущественно в виде диполярных ионов (цвиттер-ионов), у которых аминогруппы

протонированы, а карбоксильные группы диссоциированы (рис. 6.1).

Остатки аминокислот в пептидах соединяются друг с другом пептидной

(карбоксамидной) связью, в формировании которой принимают участие a-

карбоксильная группа одной и a-аминогруппа другой аминокислоты. В ходе

этой реакции выделяется вода (рис.6.3).

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

113

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

114

Первичная структура белков характеризует их аминокислотную после-

довательность, которая определяет другие уровни организации этих полиме-

ров — вторичную, третичную и четвертичную структуру. Под вторичной

структурой обычно подразумевают структуру участков полипептидной цепи

с упорядоченной конформацией, стабилизированной водородными связями

между СО- и NH-группами. Подобные участки называют элементами вто-

ричной структуры и различают несколько их типов: правую a-спираль

(наиболее распространенный элемент), левую a-спираль, антипараллельный

и параллельный b-складчатый лист, b-петлю. В фибриллярных белках, кото-

рые обычно выполняют структурную функцию, регулярные вторичные струк-

туры распространяются на достаточно протяженные фрагменты молекулы и

представлены чаще каким-либо одним типом. К тому же для этих белков ха-

рактерно формирование ансамблей взаимодействующих между собой вто-

ричных структур, что обусловливает особую прочность формируемых воло-

кон. Например, коллаген — белок соединительной и костной тканей, сухо-

жилий, хрящей — представляет собой правую тройную спираль, скрученную

из трех первичных левых спиралей.

В глобулярных белках (растворимые, с формой, близкой к сферической),

которые выполняют в клетках специфические функции, в том числе обладают

каталитической активностью, обычно присутствуют одновременно и a-

спирали, и b-складчатые листы. Кроме этого имеются участки с неупорядо-

ченной структурой. В молекуле инсулина (см. разд. 21.3), например, на долю

участков, представленных a-спиралью, приходится 57%, b-складчатой струк-

турой — 6%, b-петлей — 10%. Остальная часть молекулы (27%) не имеет

упорядоченной структуры.

Под третичной структурой понимают расположение в пространстве

атомов и формируемых ими элементов вторичной структуры полипептида,

иными словами, трехмерную функционально активную конформацию бел-

ка. Каждый белок характеризуется своей уникальной пространственной

структурой. Стабилизация конформации белковых молекул обеспечивается

водородными связями, дисульфидными мостиками, электростатическим

взаимодействием, комплексообразованием с ионами металлов, гидрофобны-

ми эффектами.

Многие белковые молекулы образуют симметрично построенные ком-

плексы, стабилизированные за счет нековалентных взаимодействий. Взаим-

ное расположение составных единиц комплексов (субъединиц) определяет

четвертичную структуру белка.

Обычно в белковых молекулах насчитывается несколько десятков амино-

кислотных остатков, однако встречаются полипептиды, содержащие сотни и

даже тысячи мономерных звеньев. При этом число типов мономерных еди-

ниц (различающихся своей боковой цепью аминокислот) в большинстве при-

родных белков составляет 20. Поистине огромная вариабельность структуры

разных белков определяется последовательностью аминокислот, число раз-

личных вариантов которой описывается величиной 20

, где n — количество

аминокислотных остатков в белке. Последовательность аминокислот в поли-

пептиде определена генетически. Белковая молекула может состоять из одной

или нескольких полипептидных цепей.

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

115

Кроме простых белков, в состав которых входят только аминокислоты,

существуют сложные белки, которые могут содержать ионы металлов (ме-

таллопротеины), молекулы пигментов (хромопротеины), образовывать

комплексы с другими молекулами (липопротеины, нуклеопротеины, гли-

копротеины), ковалентно связывать неорганический фосфат (фосфопротеи-

ны).

Химические свойства белков обусловлены набором и соотношением ами-

нокислот с гидрофильными и гидрофобными боковыми группами. К биоло-

гическим свойствам белков относятся, в первую очередь, каталитическая

(ферментативная), транспортная (транспортировка веществ в организме и

перенос их через биомембраны), структурная (в составе хромосом, цитоске-

лета, соединительных, мышечных, опорных тканей), регуляторная (способ-

ность регулировать скорость химических реакций в клетке и уровень мета-

болизма в целом организме) и рецепторная функции. Кроме этого, белкам

присущи защитные, запасные, токсические, сократительные и некоторые дру-

гие функции. Большинство перечисленных биологических свойств белков уже

охарактеризованы в предыдущих главах. Здесь внимание будет уделено био-

каталитической активности белковых молекул.

6.1. Особенности структуры ферментных молекул

Ферменты (энзимы) представляют собой специфические высокоэффек-

тивные катализаторы химических реакций. Подавляющее большинство кле-

точных реакций осуществляется с участием ферментов, одна клетка может

содержать до 1000 различных ферментов. В настоящее время известны функ-

ции более двух тысяч ферментов, из которых несколько сотен изучены наи-

более полно, для них определена аминокислотная последовательность и про-

странственная структура.

Ферментативный катализ ускоряет протекание химических реакций в

—10

раз! Будучи выделенными из клетки без повреждения нативной

структуры, ферменты сохраняют активность, что делает возможным их ис-

пользование в бесклеточных реакциях.

Молекулы ферментов характеризуются различными молекулярными мас-

сами — от 10 000 до 1 000 000 дальтон (Да) и выше, однако большинство

ферментов представлено глобулярными белками с молекулярной массой в

несколько сотен тысяч дальтон, построенными из субъединиц (протомеров).

Упаковка субъединиц в мультимерном (состоящем из нескольких субъеди-

ниц) белке осуществляется благодаря взаимодействиям того же типа, что и

при образовании третичной структуры белка. Среди ферментов-мультимеров

преобладают димеры и тетрамеры, в меньшей мере распространены гексаме-

ры и октамеры и очень редко встречаются тримеры и пентамеры.

Мультимерные ферментные белки могут содержать протомеры несколь-

ких типов, различающихся некоторыми особенностями первичной и третич-

ной структуры. От соотношения протомеров разного типа в мультимере зави-

сят некоторые его химические и физические свойства, и такие различающие-

ся формы мультимерного фермента называют изоферментами (изозимами).

Например, лактатдегидрогеназа, катализирующая в мышцах обратимую ре-

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

116

акцию окисления молочной кислоты, состоит из четырех субъединиц двух

типов (Н и М) и представлена пятью изоферментами (НННН, НННМ,

ННММ, НМММ, ММММ). Эти изоферменты отличаются друг от друга ак-

тивностью, молекулярной массой, электрофоретической подвижностью, ло-

кализацией в органах и тканях, а также чувствительностью к регуляторным

веществам. Существование изоферментов позволяет организму изменять их

соотношение и регулировать, таким образом, метаболическую активность.

Изучение структуры молекул ферментов позволило выявить ряд законо-

мерностей в их организации. Полипептидная цепь, образующая белковую

глобулу, свернута довольно сложным образом. Одни участки этой цепи явля-

ются a-спиралями или же b-структурами, другие принимают нерегулярные,

но вполне определенные конформации. Эти структуры, тесно прилегая друг к

другу и чередуясь, упаковываются в блоки, обладающие функциональной

активностью. На поверхности белковой глобулы сосредоточены в основном

полярные группы и заряженные атомы, причем между противоположно заря-

женными группами (например, между боковыми цепями Glu

и Lys

) иногда

образуются ионные связи (солевые мостики). Внутренняя часть белковой гло-

булы представляет собой неполярную среду, гидрофобное ядро образовано

неполярными группами, входящими главным образом в состав алифатиче-

ских и ароматических боковых цепей аланина, валина, изолейцина, лейцина,

метионина, фенилаланина и триптофана. Полярные радикалы аминокислот,

имеющие функциональное значение, ориентированы также внутрь глобулы,

при этом они ассоциированы друг с другом.

Важнейшей частью ферментной молекулы является активный центр, ко-

торый обычно имеет форму щели или впадины в глобуле фермента. В актив-

ном центре происходит связывание субстрата и превращение его в продукт.

Активный центр почти всегда построен из небольшого количества аминокис-

лотных остатков, которые, как правило, значительно удалены друг от друга в

полипептидной молекуле. В активном центре можно условно выделить два

участка: связывающий и каталитический.

Остатки аминокислот, образующие связывающий участок, обеспечивают

удержание субстрата в актином центре. Именно «архитектура» связывающего

участка активного центра фермента определяет его комплементарность

структуре субстрата, т. е. специфичность связывания фермента. Часто при-

крепление субстрата осуществляется за счет взаимодействия с e-

аминогруппой радикала лизина, расположенного в субстратном участке. Эту

же роль может выполнять карбоксильная группа глутаминовой кислоты, а

также сульфгидрильная группа цистеина. Однако чаще формирование суб-

страт-ферментного комплекса происходит без образования ковалентных свя-

зей, за счет более слабых сил, таких, как водородные и электростатические

связи, гидрофобные и ван-дер-Ваальсовы взаимодействия.

В каталитический участок фермента входят остатки аминокислот, непо-

средственно участвующие в катализе. Их называют каталитическими груп-

пами, и они чаще всего представлены остатками серина, гистидина, трипто-

фана, аргинина, цистеина, аспарагиновой и глутаминовой кислоты, тирозина.

Окончательное формирование каталитического участка у многих ферментов

может происходить в момент присоединения субстрата.

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

117

Кроме активного центра, большинство ферментов содержат аллостери-

ческий центр. Этот участок молекулы предназначен для связывания с регу-

ляторными веществами, в результате чего изменяется третичная структура

белка. Это искажение затрагивает и конфигурацию активного центра, что

сопровождается увеличением или снижением каталитической активности

фермента. Данное явление лежит в основе аллостерической регуляции актив-

ности ферментов.

Некоторые ферменты проявляют полифункциональность —способность

осуществлять несколько энзиматических активностей. Данное явление объяс-

няется тем, что при формировании третичной структуры полипептидные цепи

подобных ферментов образуют несколько функционально и стерически обо-

собленных глобулярных участков — доменов, каждый из которых характе-

ризуется собственной каталитической активностью.

6.2. Специфичность ферментов

Одним из удивительных свойств ферментов является их высокая специ-

фичность. Различают субстратную специфичность (способность связываться с

определенным субстратом или их группой) и специфичность действия, или

реакционную специфичность (способность катализировать реакции опреде-

ленного типа).

Специфичность связывания субстрата у разных ферментов значительно

варьирует — некоторые ферменты могут катализировать реакцию с участием

только одного субстрата, тогда как другие — с несколькими химически род-

ственными веществами. Например, формамидаза гидролизует только фор-

мамид, в то время как амидаза гидролизует любой алифатический амид. В

таком случае говорят соответственно об узкой и широкой специфичности

ферментов.

Ранее было принято объяснять субстратную специфичность ферментов

теорией замка и ключа: к ферменту (замку) подходит лишь свой субстрат

(ключ). Однако в настоящее время эта теория получила развитие в гипотезе

Кошланда об индуцированном соответствии субстрата и фермента, кото-

рая считается общепринятой. Согласно этой гипотезе, пространственное со-

ответствие между структурами активного центра фермента и субстрата созда-

ется в момент их взаимодействия друг с другом. При этом в молекуле фер-

мента индуцируются небольшие конформационные изменения, в результате

чего в каталитическом участке функционально активные группы ориентиру-

ются наиболее благоприятным для протекания соответствующей реакции об-

разом. В субстрате также возникают конформационные превращения (гово-

рят о возникновении напряжения в субстрате), что делает его более реакци-

онноспособным. Данная гипотеза объясняет тот факт, что молекулы, очень

похожие по форме на истинный субстрат, могут связываться с ферментом, но

не превращаются в продукт, т. е. действуют как ингибиторы.

Субстратная специфичность ферментов настолько выражена, что боль-

шинство из них способно распознавать положение заместителей у аномерного

атома углерода, связывая и катализируя превращения лишь одной из групп

аномеров. Например, почечная оксидаза D-аминокислот катализирует окис-

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

118

ление целого ряда D-аминокислот, но не действует на L-аминокислоты. Од-

нако это правило не абсолютно, и существуют ферменты, катализирующие

превращения обоих энантиомеров. Так, субстратами глутаминсинтетазы из

мозга овцы служит как D-, так и L-глутаминовая кислота.

Специфичность действия ферментов также проявляется в высокой степе-

ни и характеризует способность ферментов катализировать одну-

единственную химическую реакцию или несколько реакций одного типа. Час-

то превращения субстрата могут идти по нескольким путям, и в ходе неката-

лизируемой реакции либо при участии неорганического катализатора пре-

вращения органического вещества сопровождаются образованием множества

побочных продуктов. Этого не происходит при ферментативном катализе, и

продукт ферментативной реакции не содержит примесей.

Более того, некоторые ферменты обладают стереохимической специ-

фичностью, т. е. способны различать в субстрате правую и левую стороны, а

также распознавать пространственное положение атомов. Например, фермен-

ты, расщепляющие a- и b-метилглюкозиды, узнают эти пространственные

изомеры и характеризуются специфичностью по отношению к ним. Алко-

гольдегидрогеназа, катализирующая окисление этанола, распознает и отщеп-

ляет один из пары атомов в СН

-группе этанола, а именно тот, который нахо-

дится в положении про-R относительно прохирального центра:

C C

Этанол

Ацетальдегид

[H]

Алкогольдегидрогеназа

6.3. Механизм ферментативного катализа

Последовательность событий в ферментативном катализе можно описать

следующей схемой. Вначале формируется субстрат-ферментный комплекс.

При этом происходит изменение конформаций ферментной молекулы и мо-

лекулы субстрата, последняя фиксируется в активном центре в напряженной

конфигурации. Так формируется активированный комплекс, или переходное

состояние, — высокоэнергетическая промежуточная структура, которая

энергетически менее устойчива, чем исходные соединения и продукты. Важ-

нейший вклад в суммарный каталитический эффект вносит процесс стабили-

зации переходного состояния —взаимодействия между аминокислотными

остатками белка и субстратом, находящимся в напряженной конфигурации.

Разность значений свободной энергии для исходных реагентов и переходного

состояния соответствует свободной энергии активации (DG

). Скорость реак-

ции зависит от величины DG

: чем она меньше, тем больше скорость реак-

ции, и наоборот. По сути DG

представляет собой «энергетический барьер»,

который требуется преодолеть для осуществления реакции. Стабилизация

переходного состояния понижает этот «барьер» или энергию активации. На

следующем этапе происходит сама химическая реакция, после чего образо-

вавшиеся продукты освобождаются из фермент-продуктного комплекса.

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

119

Можно выделить несколько причин высокой каталитической активности

ферментов, которые обеспечивают снижение энергетического барьера реак-

ции.

1. Фермент может связывать молекулы реагирующих субстратов таким

образом, что их реакционноспособные группы будут располагаться поблизо-

сти друг от друга и от каталитических групп фермента (эффект сближения).

2. При образовании субстрат-ферментного комплекса достигаются фик-

сация субстрата и его оптимальная для разрыва и образования химических

связей ориентация (эффект ориентации).

3. Связывание субстрата приводит к удалению его гидратной оболочки

(существует на растворенных в воде веществах).

4. Эффект индуцированного соответствия субстрата и фермента.

5. Стабилизация переходного состояния.

6. Определенные группы в молекуле фермента могут обеспечивать ки-

слотно-основный катализ (перенос протонов в субстрате) и нуклеофиль-

ный катализ (формирование ковалентных связей с субстратом, что приводит

к образованию более реакционноспособных структур, чем субстрат).

Одним из примеров кислотно-основного катализа является гидролиз гли-

козидных связей в молекуле муреина с помощью лизоцима. Лизоцим пред-

ставляет собой фермент, присутствующий в клетках различных животных и

растений: в слезной жидкости, слюне, курином белке, молоке. Лизоцим из

куриных яиц имеет молекулярную массу 14 600 Да, состоит из одной поли-

пептидной цепи (129 аминокислотных остатков) и имеет 4 дисульфидных

мостика, что обеспечивает высокую стабильность фермента. Рентгенострук-

турный анализ молекулы лизоцима показал, что она состоит из двух доменов,

образующих «щель», в которой находится активный центр. Вдоль этой «ще-

ли» связывается гексосахарид, причем для связывания каждого из шести са-

харных колец муреина на ферменте имеется свой участок (А, В, С, D, E и F)

(рис. 6.4).

субстрат

фермент

C участок

участок

участок участок

участок В

участок А

NAMNAG

NAM

NAG

NAM

NAG

Glu-35

Asp-52

Рис. 6.4. Расположение гексосахаридного звена муреина в активном цен-

тре молекулы лизоцима: NAG — остаток N-ацетилглюкозамина; NAM —

остаток N-ацетилмурамовой кислоты; заштрихованная часть

рисунка — область активного центра лизоцима

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)