Белясова Н.А. Биохимия и молекулярная биология

Подождите немного. Документ загружается.

ВВЕДЕНИЕ

1. Краткий исторический очерк развития биохимии

и молекулярной биологии

Как самостоятельная наука биохимия сложилась к середине XIX ст., од-

нако предпосылки для ее развития появились почти на век ранее. К их числу

можно отнести открытие Дж. Пристли (1770—1780 гг.) явления поглощения

кислорода животными и выделения растениями; выделение из природных

источников первых органических молекул — глицерина, яблочной, лимон-

ной, молочной и мочевой кислот (Шееле, Руэль, 1770—1786 гг.); расшифров-

ку состава белков как веществ, содержащих азот (Дальтон, 1803 гг.); выделе-

ние первой аминокислоты из сока спаржи (Asparagus) — аспарагина (Воклен,

1806 г.); вывод уравнения спиртового брожения (Гей-Люссак, 1810 г.); выде-

ление при кислотной обработке мыла кристаллического препарата жирной

кислоты и открытие холестерина (Шеврёль, 1811, 1812 г.).

Наконец, Ф. Вёлер в 1828 г. синтезировал из неорганических веществ

первое органическое соединение — мочевину, нанеся тем самым сокруши-

тельный удар по витализму. Многими это достижение считается основной

вехой в становлении биохимии как самостоятельной науки. В 1833 г. Пайен и

Персо очистили и изучили свойства первой ферментной молекулы —

амилазы пшеницы, постулировав центральную роль ферментов в биологии.

В 1854—1864 гг. Пастер доказал, что брожение является функцией живых

клеток (дрожжей) и привел решающие аргументы против гипотезы о самоза-

рождении. В это же время, начиная с открытия Ф. Мишером ДНК (1869 г.),

зарождается химия нуклеиновых кислот.

К концу XIX ст. между Луи Пастером и Ю. Либихом разгорелся спор от-

носительно природы брожения. Пастер отстаивал взгляд на брожение как на

явление, способное осуществиться лишь в клетках микроорганизмов, а Либих

придерживался иной точки зрения — касательно химической природы этого

процесса, в котором, однако, принимают участие вещества, подобные уже

известной в то время амилазе. Спор помогли разрешить братья Бухнеры, ко-

торые в 1897 г. показали, что брожение может осуществляться в бесклеточ-

ных дрожжевых экстрактах. Таким образом, стало понятно, что брожение —

химический процесс, способный происходить как в клетках, так и вне их, но

с участием ферментов —продуктов жизнедеятельности организмов. По сло-

вам историков: «…появление пузырьков газа в опыте Бухнеров означало ро-

ждение современной биохимии и энзимологии».

После этого открытия биохимия получила мощный толчок в развитии: в

1901—1902 гг. Эмиль Фишер показал, что белки представляют собой поли-

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

пептиды, и установил природу пептидной связи; в 1905 г. Кнооп открыл b-

окисление жирных кислот; в 1911 г. Функ выделил в кристаллическом виде

тиамин и предложил термин «витамин»; в 1913 г. Михаэлис и Ментен разра-

ботали теоретические основы кинетики ферментативных реакций; в 1926 г.

Самнер выделил в кристаллическом виде фермент уреазу и доказал, что он

является белком; в 1933 г. Кребс и Гензелейт открыли и изучили химизм

цикла мочевины, а Эмбден и Мейергоф выявили наиболее важные особенно-

сти процессов гликолиза и брожения. Даже этот небольшой перечень самых

важных достижений биохимии первой половины XX ст. показывает, что ин-

терес ученых сместился в область расшифровки процессов, протекающих в

живой клетке.

В результате к середине XX ст. оказались изученными основные превра-

щения веществ в клетках. Открыт фотосинтез (К.А. Тимирязев), цикл три-

карбоновых кислот (Г. Кребс), процесс окислительного фосфорилирования,

закономерности превращения энергии в клетке.

В этот период биохимики все еще не могли ответить на один из главных

вопросов, волновавших человека: какое клеточное вещество является носите-

лем наследственной информации. Лучше других макромолекул оказались

изученными белки, и было показано их удивительное многообразие. Логично

было предположить, что именно белковые молекулы, столь вариабельные в

своем составе, должны осуществлять функции вещества, кодирующего столь

же вариабельные свойства живых существ. Однако уже в 1928 г. в экспери-

ментах Гриффита были получены первые сведения об участии в данном про-

цессе нуклеиновых кислот. А в 1944 г. американские ученые Эвери, Мак-

Леод и Мак-Карти доказали, что веществом, ответственным за хранение и

передачу наследственной информации у клеточных организмов, является

ДНК.

Для исследования структуры нуклеиновых кислот были привлечены са-

мые совершенные методы, имеющиеся в распоряжении исследователей из

разных областей науки. В частности, рентгеноструктурный анализ, основы

которого были разработаны в 1934 г. Берналом и Крауфутом, позволил при-

близиться к изучению трехмерной структуры ДНК. В это время выделяется в

самостоятельную науку молекулярная биология. О ее зарождении впервые

упомянул Уоррен Уивер — руководитель отдела естественных наук Рокфел-

леровского фонда. В своем отчете за 1938 г. он отметил, что «в тех погранич-

ных областях, где физика и химия пересекаются с биологией, постепенно

возникает новый раздел науки — молекулярная биология, начинающая при-

открывать завесы над многими тайнами, окутывающими основные элементы

живой клетки».

Современная биохимия отличается внедрением в анализ веществ и про-

цессов скоростных автоматизированных методов. В настоящее время авто-

матическому контролю подвластны аминокислотный анализ белка, количест-

венное определение моно- и дисахаридов в биологических жидкостях, секве-

нирование нуклеиновых кислот, синтез пептидов и олигонуклеотидов, хрома-

тографическое и гельфильтрационное разделение природных соединений

и др.

При завершении обзора достижений биохимической науки можно заклю-

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

чить, что биохимия изучает химический состав и строение живой материи, а

также химические процессы, протекающие в живых организмах.

Датой «рождения» молекулярной биологии считается 1953 г., когда физик

Фрэнсис Крик и биолог Джеймс Уотсон расшифровали структуру ДНК —

двойную спираль. Это замечательное открытие стало основой большинства

молекулярно-биологических исследований, а его предпосылками считаются

уже упоминавшиеся достижения «фаговой школы» (Эвери и соавт.) и физи-

ков (Бернал, Крауфут). Кроме этого, перемещению интересов биохимиков в

область изучения нуклеиновых кислот способствовало постулирование в

1941 г. Дж. Бидлом и Э. Тейтумом принципа «один ген — один фермент»,

который они сформулировали при изучении биохимических мутаций у хлеб-

ной плесени Neurospora crassa.

Особенностью молекулярной биологии является исследование структуры

макромолекул и ее связи с функцией. Наиболее наглядно это продемонстри-

ровано на ДНК. Однако молекулярная биология исследует и другие молеку-

лы, в чем можно убедиться, познакомившись с основными достижениями

данной науки: расшифрована структура некоторых белков и установлена

взаимосвязь ее с функциями этих молекул (М. Перутц, Дж. Кендрью,

Ф. Сенгер, К. Анфинсен и др.); определена структура и выявлены механизмы

биологических функций нуклеиновых кислот и рибосом (Дж. Уотсон,

Ф. Крик, Т. Касперсон, Ж. Браше, С. Вейсс и др.); расшифрован генетиче-

ский код (М. Ниренберг, Г. Корана, С. Очоа); разработан метод специфиче-

ского расщепления ДНК с помощью рестрикционных эндонуклеаз — основа

современной генетической инженерии (Х. Смит, В. Арбер, Д. Натанс); откры-

то явление обратной транскрипции (Г. Темин, Д. Балтимор, С.М. Гершензон);

открыты механизмы и определены этапы биосинтеза белковых молекул

(Ф. Жакоб, Ж. Моно, Ф. Крик) и нуклеиновых кислот (А. Корнберг, С. Очоа);

установлена структура вирусов и механизмов их репродукции, разработаны

методы генетической инженерии (П. Берг, В. Арбер, Х. Смит); разработаны

методы введения чужеродной ДНК в различные клетки с помощью векторов

(Г. Бойер, С. Коэн, Д. Хелинский); осуществлен синтез гена (Г. Корана);

предложена вирусогенетическая теория возникновения рака (Л.А. Зильбер);

установлена последовательность нуклеотидов в тРНК (А.А. Баев); разработан

метод секвенирования ДНК (А. Максам, У. Гилберт, Ф. Сенгер).

Таким образом, можно сформулировать определение молекулярной био-

логии как науки, изучающей функционирование живых организмов сквозь

призму химической структуры формирующих их молекул и атомов.

2. Объекты исследования биохимии и молекулярной биологии

Зачастую предметами исследования обеих наук служат одни и те же объ-

екты, поэтому логично охарактеризовать их в общем составе.

1. Атомы. Средний диаметр — менее 0,4 нм. Наибольшее распростране-

ние в живой материи имеют атомы углерода, кислорода, азота и водорода.

Поведение малых молекул определяется свойствами тех атомов, которые их

формируют.

2. Малые молекулы. Величина — 0,5—1,0 нм. Особое значение для жи-

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

вых систем имеют малые молекулы следующих классов: аминокислоты, мо-

носахариды, азотистые основания, неорганический фосфат, глицерин. Из этих

молекул, как из строительных блоков, формируются макромолекулы.

3. Гены. Это участки нуклеиновых кислот, определяющие структуру по-

липептидов, тРНК, рРНК, а также играющие роль в регуляции метаболизма.

Одна молекула ДНК (РНК) может содержать от нескольких единиц до не-

скольких тысяч генов. Размер генов определяется числом пар нуклеотидов и

может содержать их в количестве от нескольких десятков до десятков тысяч.

4. Макромолекулы. Имеют размер 3—300 нм. Наибольшее распростране-

ние и значение для организмов имеют белки, нуклеиновые кислоты, полиса-

хариды и липиды. Они участвуют в формировании вирусных частиц и кле-

точных органелл.

5. Органеллы — клеточные структуры, выполняющие специфические

функции. Характеризуются размером 20 нм—10 мкм. Наиболее крупные и

высокоорганизованные органеллы (имеются только в клетках эукариот) —

ядра, митохондрии, хлоропласты.

6. Вирусы — существа, имеющие неклеточное строение. Диаметр вирус-

ных частиц составляет 20—300 нм. Не имеют собственного метаболизма,

облигатные ультрапаразиты, не способны к самовоспроизведению без содей-

ствия соответствующих клеточных систем.

7. Клетки — минимальные единицы жизни, способные к самовоспроизве-

дению. Существуют двух типов — прокариотические и эукариотические.

Имеют размер 0,1—100 мкм.

8. Организмы: одно- и многоклеточные; про- и эукариотические. От раз-

меров одной клетки до гигантских форм.

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

Часть первая. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ

И МЕХАНИЗМЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ

Глава 1. ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА КЛЕТКИ

Развитие представлений о ДНК как о веществе, в котором зашифрована

наследственная информация клетки, осуществлялось в истории биохимии на

протяжении примерно двадцати лет в ходе нескольких этапов. Причиной та-

кого длительного спора между исследователями в отношении одного из глав-

ных вопросов естествознания послужила, с одной стороны, консервативность

взглядов на структуру нуклеиновых кислот как на «просто организованные

молекулы». При недостаточной их изученности полагалось, что ДНК и РНК

представляют собой полимеры, в которых многократно повторяются тетра-

нуклеотиды. В то же время белковые молекулы стали исследоваться раньше

других клеточных макромолекул, и к 1928 г. в изучении их организации уда-

лось достичь определенного прогресса: было известно, что в их составе при-

сутствует, как минимум, 20 аминокислот, которые чередуются в произволь-

ном порядке, определяя огромное количество вариантов строения полипепти-

дов.

История становления постулата «ДНК — носитель наследственной ин-

формации» показательна с точки зрения изящества человеческой мысли, а

также проливает свет на многие закономерности процессов наследования

признаков организмами и достойна изучения.

1.1. Становление постулата «ДНК — носитель

генетической информации»

Первым прямым доказательством генетической роли ДНК послужили

эксперименты Ф. Гриффита (1928 г.) по трансформации пневмококков.

Гриффит работал с двумя типами штаммов Diplococcus pneumoniae: S-

формами, образующими на агаризованных средах гладкие, блестящие (от

англ. smooth — гладкий) колонии, и R-формами, характеризующимися шеро-

ховатой (от англ. rough — шероховатый) поверхностью колоний. S-формы

были высоковирулентными для мышей и вызывали у них пневмонию. Однако

убитые нагреванием до 65°

С, пневмококки S-формы не приводили к болезни

и гибели мышей. R-формы были низковирулентными и редко вызывали забо-

левание мышей.

Гриффит обнаружил, что если мышей заразить смесью живых R-форм и

убитых нагреванием (до 65°

С) S-форм, то животные заболевают, а из их кро-

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

ви можно выделить жизнеспособные S-формы пневмококков, причем того же

серотипа, что и убитые нагреванием S-формы. Это наблюдение позволило

Гриффиту сделать вывод о явлении «трансформации» в организме мыши

бактерий одного типа (R) в бактерии другого типа (S), а трансформирующим

фактором в этом случае должно было выступать вещество, определяющее

наследственные свойства и содержащееся в убитых нагреванием клетках.

Поскольку при используемой температуре (60—65 °С) белок подвергается

денатурации, Гриффит предположил, что трансформирующим фактором,

очевидно, является не белок, а ДНК.

Со времен экспериментов Гриффита данный метод переноса генетической

информации называется трансформацией. Позже стало известно, что харак-

тер клеточной поверхности пневмококков определяется двумя аллелями гена:

аллель S контролирует способность клетки формировать полисахаридную

капсулу, придающую гладкую поверхность колониям и защищающую пнев-

мококков от иммунной системы мыши; если в клетке присутствует аллель R,

то капсула не образуется, и клетки легко распознаются и уничтожаются им-

мунной системой хозяина.

В свое время результаты экспериментов и выводы Гриффита, как выхо-

дящие за рамки традиционных представлений об этих процессах, не были

приняты научной общественностью. Понадобилось воспроизведение похожих

манипуляций in vitro, которое осуществили в 1944 г. американские исследо-

ватели Эвери, Мак-Леод и Мак-Карти. Эти ученые трансформировали расту-

щую культуру пневмококков R-типа выделенной из клеток S-штамма ДНК.

Оказалось, что некоторые бактерии приобретали способность синтезировать

полисахаридную капсулу и, соответственно, патогенность для мышей. При

этом единственным фактором, способным сообщить R-клеткам данное свой-

ство, была очищенная ДНК. Кроме того, в данных экспериментах было выяв-

лено, что на трансформацию не оказывают влияния протеолитические фер-

менты, и наоборот, обработка трансформирующего фактора нуклеазами при-

водила к предотвращению процесса трансформации. Наконец, из экспери-

ментов следовало, что возникающие в результате трансформации бактерии S-

типа обладают способностью передавать приобретенное свойство (синтез

капсульных полисахаридов) дочерним клеткам. Полученные американскими

учеными доказательства роли ДНК в хранении и передаче наследственной

информации носили фундаментальный характер и вошли в историю, однако и

они не были оценены сразу по указанным выше причинам. Кроме того, изу-

чение основ наследственности в 1944 г. только начиналось и еще не было

точно установлено, что бактерии обладают генами, во всех отношениях сход-

ными с генами высших организмов.

Решающим доказательством в пользу генетической роли ДНК стали экс-

перименты, осуществленные Альфредом Херши и Маргарет Чейз в 1952 г.

Им удалось доказать, что носителем наследственной информации у бакте-

риофага Т2 является ДНК. Суть экспериментов сводилась к следующему.

Одну культуру клеток кишечной палочки выращивали на среде, содержащей

радиоактивные изотопы фосфора (

Р), а другую — в присутствии изотопов

серы (

S), в результате чего эти изотопы включались в содержимое клеток.

Затем каждую из меченых бактериальных культур использовали для получе-

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

ния лизата Т2. Получали разные лизаты меченных изотопами фагов: в одном

из них содержались частицы Т2, у которых

S включался в состав белка

(капсида), а в другом – Т2 с

Р в составе ДНК. Радиоактивные метки позво-

ляли проследить пути белка и ДНК фага при его репродукции.

Литический цикл начинается с прикрепления фаговой частицы к клеточ-

ной поверхности, и через определенное время фаговая ДНК инъецируется в

клетку. Это подтверждалось результатами центрифугирования суспензий на

отмеченных стадиях: вначале вместе с бактериями осаждались и фаги (

S и

Р регистрировался в осадке). Однако через определенное время бульшая

часть меченного изотопом серы белка может быть отделена от клеток при

встряхивании суспензии, при этом бульшая часть меченной изотопом фосфо-

ра ДНК не отделяется от бактерий и обнаруживается в осадке. Это дает осно-

вание предполагать, что ДНК оказывается уже внутри клеток.

Удаление из культуры пустых фаговых оболочек («теней») не оказывает

влияния на дальнейшие события: бактерии лизируются, и из них выходит

фаговое потомство точно так же, как и в случае, если «тени» остаются на по-

верхности клеток. Оказалось, что удаление «теней» сопровождается удалени-

ем не менее 80 %

S, а основная масса

Р остается в клетках и в дальнейшем

(при репродукции фага) передается потомству. Таким образом, очевиден вы-

вод, что именно ДНК, а не белок определяет процесс репродукции фага в

клетках.

Эксперимент Херши и Чейз послужил решающим доказательством гене-

тической роли ДНК и привлек внимание к работам, выполненным на пневмо-

кокках несколькими годами ранее. Этому способствовало несколько причин:

к 1952 г. исследование структуры нуклеиновых кислот достигло больших ус-

пехов и было опровергнуто представление об этих молекулах как о консерва-

тивных; данный эксперимент был осуществлен на бактериофаге, относитель-

но характера наследования признаков которого было хорошо известно, что он

аналогичен таковому для высших организмов; наконец, для фага Т2 было

продемонстрировано существование мутаций и так же, как у высших орга-

низмов, описана рекомбинация мутантных генов.

Дополнительным доказательством генетической роли ДНК явилось обна-

ружение инфекционных свойств у очищенного препарата ДНК вируса табач-

ной мозаики.

1.2. Типы нуклеиновых кислот и их функции

Из двух типов нуклеиновых кислот — ДНК и РНК — дезоксирибо-

нуклеиновая кислота выполняет роль вещества, в котором закодирована вся

основная наследственная информация клетки, и которое способно к самовос-

произведению, а рибонуклеиновые кислоты выполняют роль посредников

между ДНК и белком. Такие функции нуклеиновых кислот тесно связаны с

особенностями их индивидуальной структуры.

ДНК и РНК — это полимерные макромолекулы, мономерами которых

служат нуклеотиды. Каждый нуклеотид сформирован из трех частей —

моносахарида, остатка фосфорной кислоты и азотистого основания. Азоти-

стое основание соединено с сахаром b-N-гликозидной связью (рис. 1.1).

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

Сахар, входящий в состав нуклеотида (пентоза), может присутствовать в

одной из двух форм: b-D-рибозы и b-D-2-дезоксирибозы. Различие между

ними состоит в том, что гидроксил рибозы при 2ў-углеродном атоме пентозы

замещен в дезоксирибозе на атом водорода. Нуклеотиды, содержащие рибозу,

называются рибонуклеотидами и являются мономерами РНК, а нуклеотиды,

содержащие дезоксирибозу, носят название дезоксирибонуклеотиды и фор-

мируют ДНК.

Азотистые основания являются производными одного из двух соедине-

ний — пурина или пиримидина. В нуклеиновых кислотах преобладают два

пуриновых основания — аденин (А) и гуанин (G) и три пиримидиновых —

цитозин (С), тимин (Т) и урацил (U). В рибонуклеотидах и соответственно в

РНК присутствуют основания А, G, С, U, а в дезоксирибонуклеотидах и в

ДНК — А, G, С, Т.

Фосфат

Азотистое

основание

Нуклеозид (дезоксиаденозин)

2'3'

(аденин)

Сахар

(дезоксирибоза)

Нуклеотид (дезоксиаденозин-5'-фосфат)

Рис. 1.1. Структура нуклеозида и нуклеотида: цифрами обозначено по-

ложение атомов в остатке пентозы

Номенклатура нуклеозидов и нуклеотидов широко используется в биохи-

мии и молекулярной биологии и представлена в табл. 1.1.

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

Таблица 1.1. Номенклатура нуклеотидов и нуклеозидов

Основание Нуклеозид Нуклеотид

Аденин

Гуанин

NО

Цитозин

Урацил

NО

Тимин

Аденозин

Гуанозин

Цитидин

Уридин

Дезокси-

тимидин

Аденилат, аденозин-

фосфат (АМР, ADP,

ATP)

Гуанилат, гуанозин-

фосфат (GМР, GDP,

GTP)

Цитидилат, цитидин-

фосфат (СМР, CDP,

CTP)

Уридилат, уридинфос-

фат (UМР, UDP, UTP)

Дезокситимидилат,

дезокситимидин-

фосфат (dТМР, dTDP,

dTTP)

Длинные полинуклеотидные цепочки ДНК и РНК образуются при соеди-

нении нуклеотидов между собой с помощью фосфодиэфирных мостиков. Ка-

ждый фосфат соединяет гидроксил при 3ў-углеродном атоме пентозы одного

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

нуклеотида с ОН-группой при 5ў-углеродном атоме пентозы соседнего нук-

леотида (рис. 1.2).

При кислотном гидролизе нуклеиновых кислот образуются отдельные

компоненты нуклеотидов, а при ферментативном гидролизе с помощью нук-

леаз расщепляются определенные связи в составе фосфодиэфирного мостика

и при этом обнажаются 3ў- и 5ў-концы молекулы (рис. 1.2).

Рис. 1.2. Вторичная структура ДНК. Ферментативный гидролиз цепочки ДНК с

обнажением 3ў- и 5ў- свободных концов молекулы

Это дает основание считать цепочку нуклеиновой кислоты полярной, и появ-

ляется возможность определять направление чтения последовательности нук-

леотидов в ней. Следует отметить, что большинство ферментов, участвующих

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)