Белясова Н.А. Биохимия и молекулярная биология

Подождите немного. Документ загружается.

Рис. 1.12. Репликация двухцепочечной ДНК по типу катящегося кольца.

Сплошной линией обозначены цепи исходной ДНК; пунктиром —вновь

синтезированные в ходе репликации цепочки. Позиция 1 —исходная

кольцевая ДНК; 2 — формирование надреза в одной из цепей с обна-

жением 3ў- и 5ў-концов; 3, 4 — репликация кольцевой цепи в репли-

кативной вилке; 5 — начало репликации

5ў-хвоста; 6, 7 —продукты репликации

на поздних стадиях инфекционного процесса, после того, как инфицирующая

ДНК превращается в двухцепочечную кольцевую форму. В данном случае не

осуществляется репликация 5ў-концевых участков, в отличие от репликации

геномов фага l (рис. 1.12, поз. 5), поэтому продуктом репликации являются

длинные одиночные цепи ДНК, постоянно отделяющиеся от «катящегося ру-

лона» Эти цепи надрезаются в каждой точке начала репликации и замыкают-

ся с образованием зрелых кольцевых форм, упаковываемых в капсиды.

Репликация РНК. Образование РНК-содержащих вирусов происходит

путем репликации их РНК, тогда как все клеточные РНК образуются в ре-

зультате транскрипции ДНК. За исключением ретровирусов репликация РНК

в основном повторяет процесс репликации ДНК. Как и при репликации ДНК,

порядок расположения нуклеотидов определяется комплементарным копиро-

ванием матрицы, в данном случае обязательно цепи РНК. Ферменты, осуще-

ствляющие этот процесс, называются РНК-зависимыми репликазами. РНК

бактериальных вирусов R17 и MS2, а также полиовирусов и вируса Синдбис,

инфицирующих животных, всегда обозначается знаком (+), поскольку после-

довательность их РНК-геномов идентична последовательности мРНК. Таким

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

образом, геном инфицирующего вируса может служить в качестве мРНК и

содержит информацию о синтезе некоторых, если не всех, вирусных белков.

Специфическая репликаза, кодируемая геномом вируса и образующаяся

вскоре после инфекции, связывается с одним или несколькими белками клет-

ки-хозяина и инициирует процесс копирования (+)-цепи с ее 3ў-конца с обра-

зованием полной (-)-цепи, ассоциированной с (+)-цепью-матрицей. Затем та

же репликаза синтезирует множество копий (+)-цепи РНК, используя ново-

синтезированную (-)-цепь в качестве матрицы. Геномы некоторых вирусов

(вирус везикулярного стоматита, гриппа) представлены одной или несколь-

кими (-)-цепями. В этом случае они служат матрицами для синтеза (+)-цепей,

которые играют роль мРНК и используются при синтезе дочерних (-)-цепей.

Отличительной особенностью репликации геномов ретровирусов являет-

ся то, что после проникновения их РНК в клетку хозяина вирусный геном

подвергается обратной транскрипции. При этом сначала образуется дуплекс

РНК-ДНК, а затем — двухцепочечная ДНК. Фермент, катализирующий ком-

плементарное копирование РНК с образованием ДНК, называется обратной

траскриптазой (ревертазой). Он содержится в ретровирусных частицах (ви-

рионах) и активируется после попадания в клетку. Появляется все больше

данных о том, что обратная транскрипция происходит в самых разных эука-

риотических клетках, а обратная транскриптаза играет важную роль в про-

цессах перестройки генома. Репликация двухцепочечной формы ретровирус-

ной ДНК не начинается до тех пор, пока она не встроится в клеточную ДНК.

Механизм рекомбинационного встраивания пока полностью не установлен.

После интеграции ретровирусная ДНК реплицируется как часть клеточной

ДНК. РНК дочерних вирионов образуется в результате транскрипции интег-

рированных копий вирусной ДНК.

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

Глава 2. СОХРАНЕНИЕ ПОСТОЯНСТВА И ИЗМЕНЧИВОСТЬ

ГЕНОМОВ

Сохранение постоянства наследственной информации, с одной стороны, и

изменчивость геномов — с другой, представляют собой две противодейст-

вующие силы, между которыми происходит постоянное соперничество. Сама

организация ДНК, являющихся молекулами, в которых зашифрована генети-

ческая информация всех клеточных организмов, способствует надежному

хранению этой информации, поскольку содержит две комплементарные це-

почки. В случае каких-либо нарушений в одной из них вторая может служить

матрицей для исправления этих искажений, что действительно имеет место в

многочисленных репарационных процессах. Кроме того, двойная спираль

обусловливает возможность воспроизведения себе подобных молекул, и про-

цессы репликации ДНК осуществляются с высокой точностью (глава 1). На-

конец, многие (если не все) клетки имеют систему защиты от проникновения

в них чужеродной ДНК — это, в первую очередь, набор нуклеаз —

ферментов, способных деградировать нуклеиновые кислоты. Среди таких

нуклеаз особое значение имеют рестрикционные ферменты (рестриктазы).

Однако эволюция была бы не возможной, если бы отсутствовали процес-

сы генетической изменчивости: несмотря на все усилия организмов сохранить

неизменным свой геном, он все же поддается изменениям. Основной вклад в

процесс изменчивости геномов вносят следующие процессы: мутагенез, ге-

нетический обмен и рекомбинационные события, а также деятельность мо-

бильных генетических элементов.

Перечисленные процессы, направленные на сохранение постоянства и из-

менение наследственной информации, рассмотрены в данной теме.

2.1. Явление рестрикции—модификации ДНК

В систему рестрикции—модификации входят ферменты, относящиеся к

двум классам: одни из них модифицируют молекулы ДНК, находящиеся в

клетке, а другие расщепляют чужеродные молекулы ДНК (или свои, не мо-

дифицированные) в этих же сайтах.

Впервые явление рестрикции—модификации обнаружено С. Лурия в 50-х

гг. прошлого столетия в экспериментах по инфицированию бактерий E coli

бактериофагом l. Оказалось, что бактериофаги, размноженные на бактериях

одного штамма кишечной палочки, инфицировали клетки некоторых других

штаммов с низкой эффективностью. Наблюдалось и обратное явление: полу-

ченные в ходе этого низкопродуктивного литического цикла фаги инфициро-

вали клетки исходного штамма также плохо. Было высказано предположение,

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

которое впоследствии подтвердилось, что фаговая ДНК подвергается в бакте-

риях E. coli модификации, которая защищает ее от хозяйских ферментов ре-

стрикции, но не от подобных ферментов в других штаммах.

В настоящее время известно, что модификацией, защищающей геном

клетки и некоторые инфицирующие фаговые ДНК, является штамм-

специфичное метилирование определенных азотистых оснований в ДНК.

Причем ферментативное присоединение заместителей к азотистым основани-

ям происходит уже после включения соответствующих нуклеотидов в цепи

ДНК, начиная с этапа образования фрагментов Оказаки. Метилируются нук-

леотиды, занимающие строго определенное положение в молекуле, а фермен-

ты, осуществляющие эти реакции, относятся к единой системе рестрик-

ции—модификации. Ферменты рестрикции, входящие в такую систему, уз-

нают в ДНК те же последовательности нуклеотидов и осуществляют специ-

фическое расщепление ДНК в этих (либо прилегающих) последовательно-

стях, если они не модифицированы.

Структура сайтов рестрикции—модификации расшифрована для более

чем 200 рестрикционных ферментов.

Различают три типа эндонуклеаз рестрикции (I, II, III). Ферменты I и III

типов обладают как нуклеазной, так и метилирующей активностями. При

этом эндонуклеазы I типа узнают в ДНК определенную последовательность и

разрезают двухцепочечную ДНК на разном (не фиксированном) расстоянии

от сайтов узнавания. Эндонуклеазы типа III осуществляют двухцепочечные

разрезы ДНК на расстоянии ~25 п. н. от своих сайтов узнавания. Только эн-

донуклеазы типа II производят двухцепочечные разрезы ДНК по специфиче-

ским фосфодиэфирным связям либо в пределах самого сайта узнавания, либо

на небольшом, но вполне определенном удалении от него. Ферменты этого

типа не обладают метилирующей активностью. Некоторые из эндонуклеаз II

типа узнают специфические группы из четырех нуклеотидов, другие —

гексануклеотидные последовательности, причем их общей особенностью яв-

ляется палиндромная структура (рис. 2.1). В этом случае одна и та же по-

следовательность располагается в двух цепях в противоположных направле-

ниях симметрично, относительно оси симметрии в середине палиндрома.

Рис. 2.1. Расщепление ДНК с помощью рестриктазы Eco R1 из

Escherichia coli RY13. Слева показана структура сайта рестрикции фер-

мента Eco R1: пунктиром изображена ось симметрии палиндрома; верти-

кальными стрелками — ковалентные связи между нуклеотидами, которые

подвергаются расщеплению. Справа показаны фрагменты

ДНК, образованные в результате рестрикции

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

Как показано на рис. 2.1, результатом действия многих рестриктаз на мо-

лекулы ДНК, является разрезание их «уступом» в немодифицированных сай-

тах. При таком способе расщепления двухцепочечных ДНК образуются

фрагменты, у которых имеется концевая избыточность, или так называемые

«липкие» концы. В составе «липких» концов, образованных под действием

одной рестриктазы, последовательности нуклеотидов комплементарны

(рис. 2.1). Указанные особенности функционирования рестриктаз II типа де-

лают их незаменимыми инструментами в генетической инженерии: это моле-

кулярные ножницы, с помощью которых in vitro осуществляется фрагменти-

рование ДНК.

В настоящее время рестрикционные ферменты выделены из более чем

400 штаммов бактерий, и для большей их части определена структура сай-

тов рестрикции. Система рестрикции—модификации может рассматривать-

ся как своеобразный барьер, охраняющий клетку от включения в нее чуже-

родного генетического материала. Возникновение мутантов, лишенных спо-

собности к рестрикции, открывает дополнительные возможности для измен-

чивости у этих штаммов.

Недавно обнаружена способность некоторых конъюгативных плазмид и

фагов преодолевать барьеры рестрикции клеток-хозяев, куда они попадают

при конъюгации или инфекционном процессе. Это явление получило назва-

ние антирестрикция. В геномах плазмид и фагов обнаружены гены ard, де-

терминирующие структуру белков-антирестриктаз. Эти белки ингибируют

ферменты, принадлежащие к системе рестрикции—модификации типа I.

2.2. Репарация ДНК

Несмотря на высокую точность работы ферментов, осуществляющих реп-

ликацию ДНК, а также на существование механизма корректорской правки,

при синтезе новых цепей ДНК все же происходят ошибки, связанные с вклю-

чением в их состав некомплементарных нуклеотидов. Кроме того, молекулы

ДНК подвергаются в клетках воздействию разнообразных физических и хи-

мических факторов, нарушающих их структуру. К числу наиболее часто воз-

никающих повреждений ДНК можно отнести следующие:

— разрыв (b-N)-гликозидных связей между пурином и дезоксирибозой

(депуринизация), который чаще всего является следствием повышения тем-

пературы. За сутки в клетке человека совершается от 5000 до 10 000 актов

депуринизации;

— спонтанное дезаминирование остатков цитозина и аденина с образова-

нием, соответственно, остатков урацила и гипоксантина (примерно

100 событий на геном в сутки);

— алкилирование азотистых оснований под действием химических ве-

ществ особого класса (алкилирующих агентов);

— интеркаляция (встраивание) некоторых соединений между соседними

парами нуклеотидов;

— образование ковалентных сшивок между цепями ДНК под действием

бифункциональных агентов;

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

— образование, возникающих при поглощении ультрафиолетового света

(УФ) циклобутановых димеров (рис. 2.2) между соседними пиримидинами в

цепи.

Большинство перечисленных повреждений нарушает процессы реплика-

ции и экспрессии генов, например, каждый тиминовый димер в ДНК E. coli

задерживает репликацию на 10 с. Кроме того, эти повреждения являются ис-

точником мутаций, если их исправление не осуществится до начала реплика-

ции ДНК.

Чаще всего подобные нарушения происходят лишь в одной из нитей ДНК,

при этом во второй нити напротив повреждения в большинстве случаев со-

держится «правильная» последовательность, которая может служить матри-

цей для исправления ошибок. Таким образом, двойная спираль ДНК, а также

то, что в ней закодирована информация о структуре репарационных фермен-

тов, делает возможным уникальный механизм исправления ошибок —

репарацию, характерный только для одного класса молекул — ДНК.

Репарационных систем и механизмов, существующих у разных организ-

мов, очень много, среди них есть такие, которые специфичны лишь для ис-

правления повреждений одного рода, а есть и менее специфичные. Для удоб-

ства все известные к настоящему времени репарационные процессы можно

разделить на две категории: 1) те, что не требуют участия репликации и пред-

ставляют собой непосредственное исправление нарушений в ДНК; 2) более

сложные процессы, в ходе которых происходит репарационная репликация.

Лучше всего репарационные механизмы изучены по отношению к исправле-

нию повреждений, вызванных УФ-облучением, — пиримидиновых димеров

(рис. 2.2).

УФ

Рис. 2.2. Образование тиминовых димеров в одной из цепей ДНК включает фор-

мирование циклобутанового кольца (состоит из четырех углеродных атомов)

при взаимодействии атомов соседних пиримидиновых оснований

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

Поскольку в наиболее известных процессах репарации последствий УФ-

облучения принимают участие зависимые от УФ-света ферменты, репараци-

онные механизмы делят также на световую (способную осуществиться лишь

на видимом свету) и темновую (не требующую участия видимого света) репа-

рацию.

К репарационным механизмам прямого исправления повреждений можно

отнести дезалкилирование остатков гуанина и мономеризацию циклобутано-

вых димеров между соседними пиримидиновыми основаниями. Дезалкили-

рование метилгуаниновых остатков относится к темновой репарации и проис-

ходит при участии ферментов, присутствующих в клетках бактерий и млеко-

питающих. О

-метилгуанин-ДНК-алкил-трансфераза катализирует перенос

алкильных групп на сульфгидрильные группы цистеиновых остатков фермен-

та (рис. 2.3).

Расщепление димеров между пиримидиновыми нуклеотидами происходит

в процессе фотореактивации — восстановления структуры молекул ДНК,

поврежденных УФ-излучением в результате последующего воздействия ви-

димого света (световая репарация). Известна неферментативная коротковол-

новая фотореактивация, которая заключается в мономеризации димеров при

действии ультрафиолетового излучения с длиной волны 240 нм, а также фер-

ментативная фотореактивация. Последнюю обычно и подразумевают под

собственно фотореактивацией. Этот процесс требует участия видимого света

с длиной волны 300—600 нм и осуществляется под действием специфических

фотореактивирующих ферментов (дезоксирибопиримидинфотолиазы). Суб-

стратом фотолиазы служат димеры пиримидиновых оснований, с которыми

она образует комплекс (с неповрежденной ДНК фермент не связывается).

Используя энергию поглощенного света, фермент разрушает димер без раз-

рыва цепей ДНК (рис. 2.4).

H2C

OCH

Фермент- SH

H2C

Фермент

-SH

Рис. 2.3. Дезалкилирование О

-метилгуаниновых остатков катализируется

специфической ДНК-алкилтрансферазой

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

Рис. 2.4. Образование тиминовых димеров под действием УФ-света и их раз-

рушение на свету при помощи фотореактивирующего фермента

Явление фотореактивации широко распространено в природе и обнаруже-

но даже у таких примитивных микроорганизмов, как микоплазмы. Фотореак-

тивирующие ферменты найдены у некоторых высших растений и животных,

а также у всех изученных бактерий, за исключением Deinococcus radiodurans,

который, тем не менее, чрезвычайно устойчив к действию УФ-света: эти бак-

терии выдерживают дозы в 1000 раз более высокие, чем те, которые убивают

E. coli. При полном отсутствии способности к фотореактивации

D. radiodurans обладает мощной системой эксцизионной репарации.

Репарационные события, связанные с заменой искаженных участков, не

требуют участия видимого света и в них, кроме других ферментов, важную

роль играют нуклеазы двух типов: экзо- и эндонуклеазы. Экзонуклеазы осу-

ществляют расщепление ДНК, начиная с концов цепей, а эндонуклеазы ата-

куют цепи во внутренних частях, формируя в ДНК однонитевые разрывы.

Среди многообразия разных видов репарации, связанной с репаративным

синтезом ДНК, можно выделить два основных: эксцизионную и пострепли-

кативную репарацию.

Эксцизионная репарация. Отличительной особенностью эксцизионной

репарации является удаление поврежденного участка ДНК. Этот вид репара-

ции не столь специфичен в отношении повреждений ДНК, как фотореактива-

ция, и с его помощью могут исправляться не только пиримидиновые димеры,

но и многие другие изменения структуры ДНК. Эксцизионная репарация

(рис. 2.5, А) представляет собой многоэтапный процесс и включает следую-

щие события: 1) узнавание повреждения в ДНК, которое осуществляется спе-

цифическими эндонуклеазами, выполняющими и следующую стадию;

2) надрезание одной цепи ДНК вблизи повреждения — инцизия (осуществ-

ляют эндонуклеазы); 3) удаление группы нуклеотидов вместе с повреждени-

ем — эксцизия (осуществляют экзонуклеазы); 4) ресинтез ДНК —

заполнение образовавшейся бреши (ДНК-полимеразная активность);

5) восстановление непрерывности репарируемой цепи за счет образования

ковалентных связей сахарофосфатного остова молекулы.

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

Рис. 2.5. Два типа темновой репарации: А — эксцизионная репарация, Б —

пострепликативная репарация. Светлые линии — исходные цепи ДНК; тем-

ные линии — цепи ДНК, синтезированные в ходе репарацион-

ных событий

Лучше всего механизм эксцизионной репарации изучен на примере тем-

нового удаления пиримидиновых димеров из ДНК E. coli, облученных ульт-

рафиолетом. В клетках кишечной палочки за данный процесс отвечают гены

uvrA-D (кодируют структуру ферментов, вырезающих участок цепи ДНК с

димером), а также polА (определяет структуру ДНК-полимеразы I, осуществ-

ляющую репартивный синтез ДНК). Особенностью такого способа эксцизи-

онной репарации является образование одноцепочечных надрезов по обе сто-

роны тиминового димера.

Некоторые организмы используют для репарации повреждений, в том

числе связанных с образованием тиминовых димеров, еще одну разновид-

ность эксцизионной репарации, предусматривающую участие в процессе

особого фермента — N-гликозилазы. В данном случае первым репаративным

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

событием является расщепление гликозидной связи между поврежденным

основанием (например, одним из тиминов в димере, N-алкилированным пу-

рином и др.) и дезоксирибозой. Таким образом, имеет место локальная апу-

ринизация, или апиримидинизация; возникает так называемый АР-сайт,

узнаваемый АР-специфической эндонуклеазой, которая расщепляет фосфоди-

эфирную связь рядом с АР-сайтом. Затем брешь заполняется с помощью

обычного репаративного синтеза.

В бактериальных и эукариотических клетках обнаружен целый ряд раз-

личных N-гликозилаз. Например, урацил-ДНК-гликозилаза узнает непра-

вильную пару dG/dU, возникшую в результате спонтанного дезаминирования

остатка дезоксицитозина из пары dG/dC. Дезаминирование цитозина может

привести при репликации к возникновению мутантной нуклеотидной пары

dA/dT, поскольку с точки зрения образования водородных связей урацил ве-

дет себя аналогично тимину. Другой, широко распространенный фермент

подобного типа, представляет собой пиримидиновый димер-N-гликозилазу,

которая создает апиримидиновый сайт при репарации повреждений, связан-

ных с образованием пиримидиновых димеров.

Сайты, в которых произошла депуринизация или депиримидинизация,

выщепляются ферментами АР (апуриновые и апиримидиновые)-

эндонуклеазами. В клетках про- и эукариот имеется много разнообразных

АР-эндонуклеаз. Некоторые из них надрезают цепь с 3ў-стороны АР-сайта, а

другие расщепляют диэфирную связь с 5ў-стороны; в любом случае образу-

ются 3ў-гидроксильный и 5ў-фосфорильный концы. Это позволяет экзонук-

леазе удалить прилегающие остатки по обе стороны надреза вместе с повреж-

дением.

Различные варианты эксцизионной репарации широко распространены у

про- и эукариотических организмов, в том числе у млекопитающих. Наруше-

ния процессов эксцизионной репарации могут приводить к драматическим

последствиям. Так, у людей известно наследственное заболевание —

пигментная ксеродерма, основными симптомами которого является повы-

шенная чувствительность к солнечному свету, приводящая к развитию рака

кожи. У этих больных обнаружены различные дефекты эксцизионной репа-

рации.

Пострепликативная репарация. Этот тип репарации требует участия

продуктов генов, задействованных также в рекомбинационных событиях (rec-

гены), и не осуществляется в клетках rec-мутантов, поэтому его называют

еще и рекомбинационной репарацией. Рекомбинционная пострепликативная

репарация основана на процессах репликации и рекомбинации поврежденной

ДНК, она наименее специфична из всех рассмотренных типов репарации,

поскольку в ней отсутствует этап узнавания повреждения. Это довольно бы-

стрый способ восстановления нативной структуры ДНК в дочерних (вновь

синтезированных) цепях: показано, что репарация происходит уже в первые

минуты после облучения. Особенностью данного процесса является сохране-

ние повреждения в исходных (материнских) цепочках (рис. 2.5, Б).

Наряду с быстрой существует и медленная пострепликативная репарация,

для которой требуется несколько часов. Ее производит система ферментов,

которая отсутствует в необлученных клетках и которую индуцирует облуче-

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)