
209
Рис. 4-42. Схематически показано фракционирование субклеточных компонентов из экстрактов клеток путем повторного центрифугирования при
постепенно возрастающих скоростях. В общем случае чем меньше по размерам субклеточный компонент, тем более высокая центробежная сила
требуется для его осаждения. Обычно на различных этапах центрифугирования требуются следующие условия: низкая скорость - 1000 g - 10 мин,
средняя скорость - 20 000 g - 20 мин, высокая скорость - 80000 g - 1 ч, очень высокая скорость - 150000 g - 3 ч.
сомы). Таким образом, суспензия клеток превращается в растворимый экстракт, содержащий довольно грубую суспензию связанных с мембранами
частиц, обладающих характерными размерами, зарядом и плотностью. Было показано, что при правильном выборе среды для гомогенизации (а это
требует тщательного анализа методом проб и ошибок в отношении каждой из органелл) частицы экстракта сохраняют большую часть
биохимических свойств, присущих интактным органеллам в клетке.
После того как в начале 40-х годов начали широко использовать препаративную центрифугу, разделение различных компонентов
гомогената стало вполне реальным. Экстракты разрушенных клеток фракционируют, подвергая их высокоскоростному центрифугированию (рис. 4-
41). Такая обработка делит клеточные компоненты по их размеру: более крупные частицы при центрифугировании движутся быстрее. Крупные
компоненты экстракта, в том числе ядра или неразрушенные клетки, быстро оседают (седиментируют) при относительно низких скоростях и
образуют осадок на дне центрифужной пробирки. При более высокой скорости выпадают в осадок митохондрии, а при еще более высоких
скоростях и длительных периодах центрифугирования осаждаются мелкие замкнутые пузырьки (микросомы), а затем рибосомы (рис. 4-42). Все эти
фракции загрязнены, но если процедуру ресуспендирования осадка и центрифугирования повторить несколько раз, то многие примеси исчезнут.
Центрифугирование является, как правило, первым этапом фракционирования, с его помощью разделяются только значительно
отличающиеся по размеру компоненты. Чтобы достигнуть более высокой степени разделения фракций, необходимо гомогенат наслоить тонким
слоем поверх солевого раствора. При центрифугировании различные фракции седиментируют с различной скоростью и образуют отдельные
полосы, которые можно выделить (рис. 4-43). Во избежание перемешивания осажденных компонентов солевой раствор должен содержать
инертный и хорошо растворимый материал (например, сахарозу), плотность которого постепенно увеличивается сверху вниз, формируя градиент
плотности.
При седиментации сквозь такие градиенты сахарозы различные компоненты клетки собираются в отдельные полосы, которые можно
выделить (см. рис. 4-43). Скорость седиментации каждого из компонентов определяется его размерами и формой и обычно выражается с помощью
коэффициента седиментации, обозначаемого S (см. табл. 4-7). Ротор в современных центрифугах вращается со скоростью до 80000 об/мин, так что
на разделяемые частицы действуют силы, превосходящие силу тяготения более чем в 500000 раз. Под действием столь больших сил даже
сравнительно небольшие макромолекулы, такие, как тРНК или простейшие ферменты, разделяются и распределяются в строгом соответствии со
своими размерами. Измерение коэффициента седиментации макромолекулярных комплексов обычно используют для определения их общей массы
и количества входящих в их состав субъединиц.
Ультрацентрифуга разделяет клеточные компоненты не только по массе, но и по
плавучей плотности. В этом случае образец
седиментирует в крутом градиенте, образованном высококонцентрированным раствором сахарозы или хлористого цезия. Компоненты клеток
опускаются по градиенту до тех пор, пока не достигнут участка, плотность раствора в котором равна собственной плотности компонентов.
Дальнейшей седиментации компонентов не происходит и они «застревают» на этом уровне. Таким образом в центрифужной пробирке возникает
набор различных полос, причем полосы прилежащие к дну пробирки, содержат