
216
Рис. 4-49. ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле.
Индивидуальные белки образуют комплекс с молекулами
додецилсульфата натрия, несущими отрицательный заряд, и мигрируют
через пористый гель полиакриламида в виде отрицательно заряженного
комплекса ДСН-белок. Поскольку скорость передвижения в этих
условиях тем выше, чем меньше размеры полипептида, этот метод может
быть использован для определения приблизительной молекулярной
массы полипептидной цепи, а также для изучения субъединичного
состава белка.
Рис. 4-50. Анализ образцов белка методом электрофореза в ДСН-
полиакриламидном геле. На фотографии показан гель, использованный
для выявления белков, присутствующих на последующих стадиях
очистки фермента. Самая левая дорожка (дорожка 1) содержит сложную
смесь белков исходного клеточного экстракта, каждая из последующих
дорожек содержит белки, полученные после хроматографического
фракционирования белковых образцов, анализированных на предыдущей
дорожке (см. рис. 4-47). В лунку каждой дорожки на гель наносили
одинаковое количество белка (10 мкг). Отдельные белки в норме
проявляются в виде узких окрашенных полос; полосы расширяются, если
в них присутствует слишком много белка. (С любезного разрешения Tim
Formosa.)
количество белка, выявляемое в полосе, составляет в последнем
случае 10 нг. С помощью таких гелей можно идентифицировать
специфический белок, если пометить его антителами, связанными с
радиоактивными изотопами, ферментами или флуоресцирующими
красителями. Идентификацию часто выполняют после переноса
белков из геля на лист нитроцеллюлозы (посредством «блоттинга»).
Ниже этот метод описан более подробно применительно к изучению
нуклеиновых кислот (см. разд. 4.6.8). Описанный метод выявления
белка назван вестерн-блоттингом.
Метод ДСН-электрофореза белков в полиакриламидном
геле значительно мощнее любого другого метода фракционирования
белков из известных ранее хотя бы потому, что может быть
использован для выявления любого белка независимо от его
растворимости в воде. С помощью этого метода можно разделить на
отдельные фракции белки мембран, белковые компоненты
цитоскелета и белки, входящие в состав крупных макромолекулярных
агрегатов. При использовании этого метода полипептиды разделяются
строго по размеру, поэтому с его помощью можно получить
информацию о субъединичном составе любого комплекса и о
молекулярной массе белков, образующих этот комплекс (рис. 4-49).
Фотография геля, который был использован для анализа
последовательных этапов очистки белка, представлена на рис. 4-50.
4.4.5. Методом двумерного гель-электрофореза
можно разделить в одном геле более 1000 белков [28]
Известно, что близко расположенные полосы в геле могут
перекрываться. Этот эффект препятствует выявлению большого
количества белков (не больше 50) с помощью одномерных методов их
разделения, Метод двумерного гель-электрофореза, в котором
объединены две различные процедуры разделения, позволяет
идентифицировать более 1000 белков. Результаты при этом получают
в виде «двумерной» белковой карты.
При работе данным методом на первом этапе белки
разделяют по их заряду. Для этого образец помещают в небольшой
объем раствора, содержащего неионный (незаряженный) детергент -
меркаптоэтанол, и в качестве денатурирующего агента - мочевину. В
этом растворе происходит солюбилизация, денатурация и диссоциация
всех без исключения