Диссертация на соискание ученой степени кандидата
медицинских наук. Специальность: 14.03.06 – фармакология,
клиническая фармакология. РНИМУ им НИ Пирогова. Москва. 2015. — 122
с. Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Н.Л.
Шимановский.
Целью данной работы является поиск кандидатов для
фармакотерапии нейрофиброматоза второго типа при помощи химического
скрининга.
Научная новизна работы. Работа содержит новые данные о селективных в отношении Nf2- отрицательных клеток ЛВ. Показана селективность ингибитора 3- гидроксиметилглутарил-коА редуктазы ловастатина и ингибитора синтазы жирных кислот церуленина в отношении Nf2-отрицательных клеток и описан механизм селективности действия данных соединений.
Практическая значимость диссертации. При отсутствии терапевтических средств для лечения НФ II в настоящее время активно ведется поиск и изучение ферментных каскадов, которые могут быть нарушены в результате утраты мерлина. Оглавление.
Список сокращений.
Введение. Обзор литературы.
Общие представления о нейрофиброматозе II типа.
Причины развития НФ II. NF2 – «нетипичный» онкосупрессор.
Продукт гена NF2 – белок мерлин.
Мерлин, или шванномин, – новый представитель семейства Эзрин/Радиксин/Моэзин.
Регуляция активности белка мерлин.
Функции и локализация белка мерлин, взаимодействия с другими белками.
Роль белка мерлин в контактном торможении клеточного роста.
Сигнальные пути с участием мерлина и его онкосупрессорная функция.
Современные подходы к поиску терапии для нейрофиброматоза II.
Злокачественная трансформация и изменения клеточного метаболизма. Материалы и методы исследования.
Культивирование клеточных линий.
Получение фибробластов, нокаутных по гену Nf.
Геномное типирование.
Определение уровня пролиферации и выживаемости клеток.
Скрининг коллекции низкомолекулярных биоактивных веществ.
Трансфекции.
Реэкспрессия белка мерлин в клетках Nf2-отрицательной мышиной шванномы.
Иммуноблоттинг.
Количественная ПЦР (кПЦР).
Измерение внутриклеточных уровней ацетил- и малонил-КоА.
Измерение флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET).
Исследования противоопухолевой активности препаратов на ксенографтной модели НФ II.
Определение половинной ингибиторной концентрации (IC50).
Статистический анализ. Результаты и обсуждение.
Получение фибробластов, нокаутных по гену Nf.
Влияние утраты белка мерлин на функциональные свойства клеток MEF Nf2-/.
Скрининг коллекции низкомолекулярных биоактивных веществ.
Первичная валидация результатов скрининга.
Изучение зависимости цитотоксического эффекта исследуемых соединений от их концентрации и тестирование соединений-кандидатов на клетках Nf2-отрицательных линий.
Тестирование фармакологических аналогов соединений, отобранных.
по результатам скрининга.
Реэкспрессия белка мерлин в клетках линии Nf2-отрицательной шванномы.
Исследование механизма действия ловастатина в отношении Nf2- отрицательных клеток.
Эксперименты по снижению цитотоксичности статинов.
Истощение внутриклеточного пула геранилгераниола – ключевого звена селективной токсичности статинов.
Аактивация Rac1, сопровождающаяся нарушением её геранилирования и клеточной гибелью.
Транслокация Rac1 в ядро под действием статинов.
Ингибиторы синтазы жирных кислот (FASN) как потенциальные препараты для фармакотерапии НФ II.
Сходство эффектов от нокдауна гена Fasn и действия церуленина на Nf2-отрицательные клетки.
Эксперименты по снижению цитотоксического действия церуленина.
Различия внутриклеточных уровней ацетил-коА и малонил-коА в клетках линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2flox/flox.
Повышенный уровень синтеза жирных кислот в Nf2-отрицательных клетках.
Эксперименты по изучению противоопухолевой активности ловастатина, золендроновой кислоты и церуленина в ксенографтной модели НФII на мышах. Заключение.
Выводы.
Практические рекомендации.
Благодарности.
Список литературы.
Научная новизна работы. Работа содержит новые данные о селективных в отношении Nf2- отрицательных клеток ЛВ. Показана селективность ингибитора 3- гидроксиметилглутарил-коА редуктазы ловастатина и ингибитора синтазы жирных кислот церуленина в отношении Nf2-отрицательных клеток и описан механизм селективности действия данных соединений.
Практическая значимость диссертации. При отсутствии терапевтических средств для лечения НФ II в настоящее время активно ведется поиск и изучение ферментных каскадов, которые могут быть нарушены в результате утраты мерлина. Оглавление.
Список сокращений.
Введение. Обзор литературы.
Общие представления о нейрофиброматозе II типа.
Причины развития НФ II. NF2 – «нетипичный» онкосупрессор.
Продукт гена NF2 – белок мерлин.
Мерлин, или шванномин, – новый представитель семейства Эзрин/Радиксин/Моэзин.
Регуляция активности белка мерлин.
Функции и локализация белка мерлин, взаимодействия с другими белками.
Роль белка мерлин в контактном торможении клеточного роста.
Сигнальные пути с участием мерлина и его онкосупрессорная функция.
Современные подходы к поиску терапии для нейрофиброматоза II.
Злокачественная трансформация и изменения клеточного метаболизма. Материалы и методы исследования.
Культивирование клеточных линий.
Получение фибробластов, нокаутных по гену Nf.
Геномное типирование.
Определение уровня пролиферации и выживаемости клеток.
Скрининг коллекции низкомолекулярных биоактивных веществ.
Трансфекции.
Реэкспрессия белка мерлин в клетках Nf2-отрицательной мышиной шванномы.
Иммуноблоттинг.
Количественная ПЦР (кПЦР).
Измерение внутриклеточных уровней ацетил- и малонил-КоА.
Измерение флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET).
Исследования противоопухолевой активности препаратов на ксенографтной модели НФ II.
Определение половинной ингибиторной концентрации (IC50).
Статистический анализ. Результаты и обсуждение.
Получение фибробластов, нокаутных по гену Nf.
Влияние утраты белка мерлин на функциональные свойства клеток MEF Nf2-/.
Скрининг коллекции низкомолекулярных биоактивных веществ.
Первичная валидация результатов скрининга.
Изучение зависимости цитотоксического эффекта исследуемых соединений от их концентрации и тестирование соединений-кандидатов на клетках Nf2-отрицательных линий.
Тестирование фармакологических аналогов соединений, отобранных.
по результатам скрининга.
Реэкспрессия белка мерлин в клетках линии Nf2-отрицательной шванномы.
Исследование механизма действия ловастатина в отношении Nf2- отрицательных клеток.
Эксперименты по снижению цитотоксичности статинов.
Истощение внутриклеточного пула геранилгераниола – ключевого звена селективной токсичности статинов.
Аактивация Rac1, сопровождающаяся нарушением её геранилирования и клеточной гибелью.
Транслокация Rac1 в ядро под действием статинов.
Ингибиторы синтазы жирных кислот (FASN) как потенциальные препараты для фармакотерапии НФ II.
Сходство эффектов от нокдауна гена Fasn и действия церуленина на Nf2-отрицательные клетки.
Эксперименты по снижению цитотоксического действия церуленина.
Различия внутриклеточных уровней ацетил-коА и малонил-коА в клетках линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2flox/flox.
Повышенный уровень синтеза жирных кислот в Nf2-отрицательных клетках.
Эксперименты по изучению противоопухолевой активности ловастатина, золендроновой кислоты и церуленина в ксенографтной модели НФII на мышах. Заключение.
Выводы.
Практические рекомендации.
Благодарности.
Список литературы.