Журнал - Проблемы криобиологии 2009 №4

Подождите немного. Документ загружается.

431

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:

ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38

057) 373-57-91, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта:

cryo@online.kharkov.ua

* To whom correspondence should be addressed: 23,

Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373

5791, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-

tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine

Институт проблем криобиологии и криомедицины

НАН Украины, г. Харьков

УДК 615.361.018.5.013.8.014.41:611.013.395.085.23

М.В. ОСТАНКОВ, Д.В. ЛЕБЕДИНЕЦ, Е.А. ПОРОЖАН, А.Н. ГОЛЬЦЕВ*

Влияние факторов криоконсервирования на цитоморфологические

и структурные характеристики фетальных нервных клеток

UDC 615.361.018.5.013.8.014.41:611.013.395.085.23

M.V. OSTANKOV, D.B. LEBEDINETS, E.A. POROZHAN, A.N. GOLTSEV*

Effect of Cryopreservation Factors on Cytomorphologic

and Structural Characteristics of Fetal Nerve Cells

Представлены экспериментальные данные, полученные при сравнительной оценке влияния факторов криоконсервирования

на сохранность и фенотипические характеристики фетальных нервных клеток (ФНК) 11 суток гестации. Показано, что

криоконсервирование ФНК по разработанной программе обеспечивало высокую сохранность структурно-фенотипических

характеристик ФНК. Более криоустойчивыми оказались нейро- и глиобласты с большим процентом сохранности при

замораживании с 10% ДМСО. Эти данные коррелировали с показателями экспрессии в клетках нейроспецифических белков:

нестина и глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), а также одного из белков нейрофиламентов – β-тубулина. Так как

нестин преимущественно является иммуноморфологическим маркером нейральных стволовых/прогениторных клеток, а GFAP

“маркерным” белком клеток глии, можно считать, что выбранные режимы криоконсервирования могут быть использованы

как “естественный” сортер, способствующий селекции нейральных стволовых/прогениторных или глиальных клеток.

Ключевые слова: криоконсервирование, криопротектор ДМСО, фетальные нервные клетки, нестин, GFAP, β-тубулин,

пропидий йодид, МАТ, проточный цитофлуориметр.

Представлено експериментальні дані, одержані при порівняльній оцінці впливу факторів кріоконсервування на схоронність

і фенотипові характеристики фетальних нервових клітин (ФНК) 11 діб гестації. Показано, що кріоконсервування ФНК за

розробленою програмою забезпечувало високу схоронність структурних і фенотипових характеристик ФНК. Більш

кріостійкими виявилися нейро- і гліобласти з великим відсотком схоронності при заморожуванні з 10% ДМСО. Ці дані

корелювали з показниками експресії в клітинах нейроспецифічних білків: нестину та гліально фібрилярного кислого білка

(GFAP), а також одного з білків нейрофіламентів – β-тубуліну. Враховуючи, що нестин є імуноморфологічним маркером

нейральних стовбурових/прогеніторних клітин, а GFAP “маркерним” білком клітин глії, можна вважати, що обрані режими

кріоконсервування можуть бути використані як “природний” сортер, який сприяє селекції нейральних стовбурових/

прогеніторних або гліальних клітин.

Ключові слова: кріоконсервування, кріопротектор ДМСО, фетальні нервові клітини, нестин, GFAP, β-тубулін, пропідій

йодид, МАТ, проточний цитофлуориметр.

The experimental data, obtained under comparative evaluation of the effect of cryopreservation factors on integrity and phenotypic

characteristics of fetal nerve cells (FNCs) of 11 gestation days have been presented. It has been shown that FNC cryopreservation

according to developed program provided the high integrity of structural-phenotypic characteristics of FNCs. Neuro- and glioblasts

with higher percentage of integrity were more cryoresistant under freezing with 10% DMSO. These data correlated with the expression

indices in cells of neurospecific proteins such as: nestin and glial fibrillar acid protein (GFAP) and also one of proteins of neurofilaments,

β-tubulin. Whereas nestin is mainly immuno-morphological marker of neural stem/progenitor cells and GFAP is the “marker” protein

of glial cells it is supposed that selected cryopreservation protocols may be used as a “natural” sorter, enabling the selection of

neuronal stem/progenitor or glial cells.

Key words: cryopreservation, DMSO cryoprotectant, fetal nerve cells, nestin, GFAP, β-tubulin, propidium iodide, MAB, flow

cytofluorimeter.

В настоящее время продукты фетоплацентар-

ного комплекса применяются для лечения многих

заболеваний и открыли новое направление в меди-

цине, получившее название клеточная и тканевая

терапия [2, 6, 8, 10, 20].

Применение трансплантации фетальных нерв-

ных клеток (ФНК) предусматривает низкотемпе-

ратурное их консервирование и длительное хра-

нение, обеспечивающее сохранность морфофунк-

Nowadays the products of fetoplacental complex

have been used for the treatment of many diseases

and proposed a new medical area called as cell and

tissue therapy [2, 6, 8, 10, 20].

The application of transplantation of fetal nerve cells

(FNCs) foresees their low temperature preservation

and a long-term storage, providing the integrity of

morpho-functional characteristics [3, 4, 17, 20]. The

most important stage of preparing and successful FNC

432

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

циональных характеристик [3, 4, 17, 20]. Наиболее

важный этап подготовки и успешного криоконсер-

вирования ФНК, как и любого биологического

объекта – выбор криопротектора, его концентрации

и режима замораживания-оттаивания [18, 19, 21].

Успешное криоконсервирование и обеспечение

сохранности морфофункциональных характеристик

ФНК обусловливают перспективу и эффективность

их использования в клинической практике и

экспериментальных исследованиях [2, 7, 8, 10, 14,

20, 24].

Цель работы – исследовать влияние условий

криоконсервирования на цитоморфологические и

структурные характеристики ФНК.

Материалы и методы

Работа выполнена на 6-месячных крысах линии

Вистар массой 160–180 г (n = 12) в соответствии

с правилами «Европейской Конвенции о защите

позвоночных животных, используемых для экспе-

риментальных и других научных целей» (Страс-

бург, 1985 г.).

Фетальные нервные клетки получали из мягких

тканей головного мозга плодов крыс 11 суток

гестации гомогенизацией в среде Хэнкса с добав-

лением цитрата натрия по методу [2]. После гомо-

генизации суспензию ФНК разливали по 2 мл в

пробирки, добавляли криопротектор диметилсуль-

фоксид (ДМСО) в 7 или 10%-й конечной концентра-

ции, экспонировали 10 мин. Замораживание ФНК

с 7 (Крио-1) или 10% (Крио-2) ДМСО осущест-

вляли по программе: охлаждение со скоростью

1°С/мин до температуры –5°С, стабилизация 5 мин,

охлаждение со скоростью 2°С/мин до –60°С с

последующим погружением в жидкий азот. Для

реализации данной программы использовали про-

граммный замораживатель УООП-6 производства

СКТБ с ОП ИПКиК НАН Украины [3]. Суспензию

клеток размораживали на водяной бане (41°С) в

течение 50–60 с до исчезновения твердой фазы.

Для удаления криопротектора клеточную суспен-

зию разводили равным объемом среды 199 с после-

дующим центрифугированием при 1500 об/мин в

течение 5 мин.

До и после криоконсервирования оценивали

следующие показатели ФНК-11: сохранность опре-

деляли с помощью 2%-го раствора витального кра-

сителя трипанового синего в световом микроскопе

ЛОМО и окрашивания пропидий йодидом методом

цитофлуориметрии (FACS Calibur, BD, США) с

использованием программы CellQuest 3.1; морфо-

логический состав исследовали на мазках, окра-

шенных азур-II эозином по Романовскому-Гимза

[15] в световом микроскопе. Для выявления вну-

триклеточных белков (специфических маркеров

промежуточных филаментов цитоскелета ФНК)

cryopreservation like any other biological object is the

selection of cryoprotective agent, its concentration and

freeze-thawing regimen [18, 19, 21]. Successful cryo-

preservation and providing the integrity of morpho-

functional characteristics of FNCs provide perspective

and efficiency of their using in clinical practice and

experimental researches [2, 7, 8, 10, 14, 20, 24].

The research aim was to study the effect of cryo-

preservation conditions on cytomorphological and

structural characteristics of FNCs.

Materials and methods

The research was carried out in 160–180 g Wistar

rats (n = 12) aged 6 months according to the rules of

“European convention about protection of vertebral

animals used for experimental and other scientific

purposes” (Strasbourg, 1985).

Fetal nerve cells were derived from brain soft

tissues of rat fetuses of 11 gestation days by homo-

genization in the Hanks’ medium with adding sodium

citrate according to the method [2]. After homogeni-

zation the FNC suspension was transfered into 2 ml

tubes, DMSO cryoprotectant of 7 and 10% final

concentration was added and exposed for 10 min. FNC

freezing with 7 (Cryo-1) and 10% (Cryo-2) DMSO

was carried out according to the following program:

cooling with 1°C/min rate down to –5°C, 5 min

stabilization, cooling with 2°C/min rate down to −60°C

with further plunging into liquid nitrogen. For performing

this program the UOP-6 programmed freezer (Special

Designing and Technical Bureau with Experimental

Unit at the Institute for Problems of Cryobiology and

Cryomedicine of the National Academy of Sciences

of Ukraine) was used [3]. Cell suspension was thawed

on water bath (41°C) for 50–60 sec to dissolve the

solid mass. For removal of cryoprotectant the cell

suspension was diluted with equal volume of medium

199 with further centrifugation at 1500 rpm for 5 min.

Prior to and after cryopreservation the FNC-11

integrity was assessed with 2% Trypan blue vital dye

using LOMO light microscope and with propidium

iodide staining by means of cytofluorimetry (FACS

Calibur, BD, USA) using the CellQuest 3.1 software;

morphological composition of FNC-11 was studied in

smears, stained with Azur-II – eosin by Romanovsky-

Giemsa [15] using light microscope. To reveal intracel-

lular proteins (specific markers of intermediate fila-

ments of FNC cytoskeleton) there was performed a

preliminary permeabilization of cells using the reagents

Cytofix/Cytoperm and Perm/Wash Duffer (BD Phar-

mingen). To reveal the expressed antigens the cells

were incubated with FITC-labeled monoclonal antibo-

dies (MAB) (BD, USA) for 30 min at 37°C according

to the method [9]. The amount of nestin

, GFAP

and

β-tubulin

cells was assessed by the method of flow

cytometry. Microphotos were obtained using digital

433

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

проводили предварительную пермеабилиза-цию

клеток с помощью реактивов Cytofix/Cytoperm и

Perm/Wash Duffer фирмы BD Pharmingen. Для

определения экспресс-антигенов клетки инкубиро-

вали с FITC-меченными моноклональными анти-

телами (МАТ) (ВD, США) в течение 30 мин при

37°С по методу [9]. Количество нестин

-, GFAP

и β-тубулин

– клеток оценивали методом проточ-

ной цитофлуориметрии. Микрофотографии получе-

ны цифровой фотокамерой Сanon Power Shot A640

в световом микроскопе Primo Star (Carl Zeiss, Гер-

мания).

Полученные результаты статистически обраба-

тывали по методу Стьюдента-Фишера с использо-

ванием программы Statistika 7.0.

Результаты и обсуждение

Исходное состояние биообъекта во многом

определяет его устойчивость к действию физико-

химических факторов криоконсервирования [12], в

частности гиперконцентрированных растворов

солей и внутриклеточной кристаллизации [22].

Ключевым фактором, определяющим сохран-

ность нервной ткани при криоконсервировании,

является изменение формы клеточной сомы в

процессе гистогенеза, а следовательно и исходного

уровня ФНК.

Анализ состояния нативных ФНК-11 (нФНК-11)

показал, что уже на этапе выделения нервные

клетки очень чувствительны к диссоциации. Их

сохранность составляла при окрашивании трипа-

новым синим 75,7 ± 8,0% и 71,0 ± 6,8% при исполь-

зовании пропидий йодида. После криоконсервиро-

вания с 10% ДМСО показатели сохранности и

количества ядросодержащих клеток были выше,

чем с 7% (рис. 1).

При цитологическом исследовании ФНК-11 до

и после криоконсервирования определяли морфоло-

гический состав клеток исходя из особенностей

их структуры: величины клеточного тела, наличия

ядрышка в ядре, количества и степени разветвлен-

ности отростков [2].

Установлено, что после диссоциации головного

мозга плодов крыс нейроэпителиальные клетки

составили 13,0 ± 1,0% от всех клеток в суспензии

ФНК (рис. 2).

Эти клетки были больших размеров (22–

24 мкм) с крупным округлым ядром, содержащим

гетерохроматин, с 1–3 компактными ядрышками

и узким ободком цитоплазмы (рис. 3, отм. 1). Око-

ло 50% составляли недифференцированные нейро-

бласты, клетки округлой формы несколько мень-

ших размеров (18–20 мкм), чем нейроэпителиаль-

ные клетки с узким ободком базофильной цито-

плазмы, гиперхромным ядром и светлой пери-

нуклеарной зоной (рис. 3, отм. 2). Недифференциро-

Рис. 1. Сохранность ФНК-11 после криоконсервирования:

сохранность 1 – сохранность по исключению трипаново-

го синего; сохранность 2 – сохранность по исключению

пропидий йодида; – консервирование с 7% ДМСО;

– с 10% ДМСО. За 100% были приняты показатели

нФНК-11.

Fig. 1. Integrity of FNC-11 after cryopreservation: – 7%

DMSO; – 10% DMSO; Integrity 1 – integrity by excluding

trypane blue; Integrity 2 – integrity by excluding propidium

iodide. nFNCs indices were assumed as 100%

100

Количество клеток, %

Cell part, %

Ядросодержащие

клетки

Nucleated cells

Сохранность 1

Integrity 1

Сохранность 2

Integrity 2

camera Canon Power Shot A 640 and light microscope

Primo Star (Carl Zeiss).

The results were statistically processed with Stu-

dent-Fisher’s test using the Statistika 7.0 software.

Results and discussion

Initial state of bioobject in many ways determines

its resistance to the effect of cryopreservation physical

and chemical factors [12] particularly of hypercon-

centrated salines and intracellular crystallization [22].

The key factor, determining integrity of nerve tissue

during cryopreservation is the change of cell soma sha-

pe during histogenesis and consequently initial level of

FNC.

The analysis of the state of native FNCs of 11 gesta-

tion day (nFNC-11) has shown that even at the isolation

stage nerve cells are very sensitive to dissociation.

Their preservation rate made 75.7 ± 8.0% according

to Trypan blue staining and 71.0 ± 6.8% when propi-

dium iodide was used. After cryopreservation with 10%

DMSO the integrity indices and those of nucleated cells

were higher versus the ones with 7% DMSO (Fig. 1).

During cytological study of FNC-11 prior to and

after cryopreservation the morphological composition

of cells as for their structure: value of cell body, pre-

sence of nucleolus in nucleus, amount and degree of

banishing rate of out-growings [2].

It has been established that after dissociation of

rat’s fetuses brain the neuroepithelial cells made

13.0 ± 1.0% of all the cells in FNC suspension (Fig. 2).

434

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

ванные глиобласты – мелкие клетки с гиперхром-

ным ядром без ядрышка и с темной базафильной

цитоплазмой (рис. 3, отм. 3) составляли 36,2 ± 2,0%

(рис. 2). Нейроны составляли 0,87 ± 0,02%. Это

клетки с округлым или овальным телом, окружен-

ным плотным нейропилем. В центре клеточного

тела располагалось ядро округлой формы с темным

ядрышком и одним коротким отростком (униполяр-

ный нейрон) [16] (рис. 3, отм. 4) .

При анализе состава ФНК-11 после криоконсер-

вирования было установлено, что наиболее лабиль-

ными оказались нейроэпителиальные клетки, ко-

личество которых при замораживании с 7% ДМСО

снизилось с 13,0 ± 1,0 до 2,0 ± 0,02% (Крио-1) и до

4,4 ± 1,0 – с 10% ДМСО (Крио-2) (см. рис. 2). Не-

многочисленное для этого срока гестации коли-

чество созревающих нейронов сократилось вдвое

(0,87 ± 0,02 и 0,42 ± 0,01% соответственно) при за-

мораживании с 10% и не обнаруживалось при

замораживании с 7% ДМСО. Наиболее криоустой-

чивыми оказались недифференцированные глио-

бласты, относительное количество которых с 7%

ДМСО увеличилось до 70,4 ± 5,8% и с 10% ДМСО

до 57,8 ± 2,0%. Такое перераспределение клеточ-

ных популяций в сторону значительного увеличения

глиальных клеток свидетельствует о высокой их

устойчивости к факторам криоконсервирования по

сравнению с нейрональными (рис. 2), что соответ-

ствует данным [24].

Проведенные иммунологические исследования

позволили получить качественные характеристики,

свидетельствующие о сохранности фенотипичес-

ких признаков криоконсервированных ФНК-11.

Установлена прямая связь между сохранностью

клеток (недифференцированные нейробласты и не-

зрелые глиобласты) и количеством специфических

белков промежуточных филаментов (нестин и

GFAP) в них.

Рис. 2. Клеточный состав ФНК-11 до и после криоконсер-

вирования: – нейроэпителиальные клетки; – недиф-

ференцированные нейробласты; – недифференци-

рованные глиобласты; – нейроны.

Fig. 2. Cell composition of FNC-11 prior to and after cryopre-

servation: – Neuroepithelial cells; – Non-differentiated

neuroblasts; – Non-differentiated glioblasts; – Neurons.

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Доля клеток

Cell part

нФНК

nFNC

Крио-1

Cryo-1

Крио-2

Cryo-2

Рис. 3. Морфологический состав ФНК (окраска азур-II эозином, ×900): a– нативные;б – криоконсервированные c

7% ДМСО; в – криоконсервированные c 10% ДМСО; 1 -нейроэпителиальная клетка; 2 – недифференцированный

нейробласт; 3 – незрелый глиобласт; 4 – созревающий нейрон.

Fig. 3. Morphological composition of FNCs ( azur-II eosin dye, ×900): a – native; b – cryopreserved with 7% DMSO; c –

cryopreserved with 10% DMSO; 1 – neuroepithelial cell; 2 – non-differentiated neuroblast; 3 – immature glioblast; 4 –

maturing neuron.

These cells were of large sizes (22–24 µm) with

big rounded nucleus, containing heterochromatin with

1–3 compact nucleoli and narrow cytoplasm limbus

(Fig. 3, label 1). Сlose to 50% made non-differentiated

neuroblasts being the rounded cells of sizes (18–20 µm)

smaller than neuroepithelial cells with narrow limbus

of basophilic cytoplasm, hyperchromic nucleus and light

perinuclear zone (Fig. 3, label 2). Non-differentiated

glioblasts (small cells with hyperchromic nucleus

without nucleolus and with dark basophilic cytoplasm)

made 36.2 ± 2.0% (Fig. 2). Neurons made 0.87 ±

0.02%. These was cells with rounded and oval body,

surrounded by solid neuropil, (Fig. 3, label 3). There

was rounded nucleus with dark nucleolus and one short

out-growing (unipolar neuron) in the center of cell body

[16] (Fig. 3, label 4).

а aб bв c

435

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

Известно [1, 11], что нестин является иммуно-

морфологическим маркером нейральных стволо-

вых/прогениторных клеток, который активно

экспрессируется в клетках головного мозга млеко-

питающих в эмбриональном онтогенезе и почти не

экспрессируется у взрослых особей. По мере

дифференцировки нервной ткани синтез нестина

подавляется, а в дифференцирующихся клетках

(астроцитах и нейронах) начинает экспресси-

роваться GFAP. Данный белок специфичен только

для клеток центральной нервной системы, а в

периферической нервной системе в физиологичес-

ких условиях он не обнаруживается [16]. Синтез

GFAP совпадает с периодом миелинизации и

дифференцировкой астроцитов [11]. Глиальная

локализация GFAP позволяет использовать его как

“маркерный” белок для клеток глии, хотя его функ-

ция окончательно не исследована.

Полученные данные показали, что после крио-

консервирования ФНК с 7% ДМСО (Крио-1) в сус-

пензии действительно повышалась в 2 раза по

сравнению с контролем концентрация клеток,

экспрессирующих GFAP, белок, характерный для

глиобластов [11]. В суспензии ФНК, криоконсерви-

рованных под защитой 10% ДМСО, концентрация

GFAP

-клеток существенно не изменялась по

сравнению с нативным контролем, однако отмеча-

лось повышение почти в 2 раза концентрации

нестин

-клеток (рис. 4). Было проведено исследо-

вание влияния факторов криоконсервирования на

белок β-тубулина, являющийся также кислым

Рис. 4. Содержание нейро- и неспецифических белков

ФНК-11 до и после криоконсервирования: – нестина;

– GFAP; – β-тубулина.

Fig. 4. Content of neuro- and nonspiscific proteins FNCs-

11 prior to and after cryopreservation: – Nestin; – GFAP;

– β-tubulin

Содержание белка, %

Protein content, %

нФНК

nFNC

Крио-1

Cryo-1

Крио-2

Cryo-2

During analysis of FNC-11 composition after cryo-

preservation it was established that the most labile

were the neuroepithelial cells, number of which during

freezing with 7% DMSO reduced from 13.0 ± 1.0 down

to 2.0 ± 0.02% (Cryo-1) and down to 4.4 ± 1.0 with

10% DMSO (Cryo-2) (see Fig. 2). The number of

maturing neurons not numerous for this gestation period

was reduced twice (0.87 ± 0.02 and 0.42 ± 0.01%

accordingly) during freezing with 10% and was not

revealed with 7% DMSO. The most cryoresistant were

the non-differentiated glioblasts, which relative number

with 7% DMSO increased up to 70.4 ± 5.8% and with

10% DMSO up to 57.8 ± 2.0%. This distribution of

cell populations to significant increase of glial cells testi-

fies to their high resistance to cryopreservation factors

if compared with neuronal ones (Fig. 2) that corres-

ponds to the published data [24].

The carried out immunological researches enabled

to obtain the qualitative characteristics testifying to the

integrity of phenotypic characters of cryopreserved

FNC-11. It has been established the direct relationship

between cell integrity (non-differentiated neuroblasts

and immature glioblasts) and the number of specific

proteins of intermediate filaments (nestin and GFAP)

in them.

Nestin is known as a immunological marker of neu-

ronal stem/progenitor cells, actively expressed in mam-

malian brain cells during embryonic ontogenesis and

negligibly expressed in adults. While differentiation of

nerve tissue the nestin synthesis is suppressed, but in

non-differentiated cells (astrocytes and neurons) GFAP

starts to be expressed. This protein is specific only for

central nervous system cells, but in peripheral nervous

system under physiological conditions is not found [16].

GFAP synthesis coincides with period of myelinization

and differentiation of astrocytes [11].

Glial localization of GFAP enables the use it as

“marker” protein for glia cells, though its function has

not been completely studied.

Our findings have shown that after cryopreservation

of FNCs with 7% DMSO (Cryo-1) there was actually

twice (versus the control) increased the concentration

of the cells expressing GFAP, protein characteristic

for glioblasts in the suspension [11]. In the suspension

of FNCs cryopreserved under protection of 10%

DMSO the concentration of GFAP

cells significantly

did not change if compared with the native control,

however there was found a duplication of the concen-

tration of nestin

cells (Fig. 4). There was studied the

effect of the cryopreservation factors on β-tubulin

protein, being also acid protein, comprising about 20%

glutamine and asparagine acids. Neurotubilin has

phosphokinase and protein kinase activity and along

with r-protein participates in the assembling of micro-

tubules of neuron cytoskeleton, forming cross-linking

[11]. Microtubules, built from α- and β-tubulins imple-

436

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

белком, в составе которого содержится около 20%

глутаминовой и аспарагиновой кислот. Нейротубу-

лин обладает фосфокиназной и протеинкиназной

активностью и вместе с r-белком участвует в

“сборке” микротрубочек цитоскелета нейронов,

образуя поперечные сшивки [11]. Построенные из

α- и β-тубулинов микротрубочки осуществляют

внутриклеточный аксонный транспорт. Показано,

что тубулины не обладают специфичностью и в

эволюционном плане они относительно стабильные

белки [11]. Тем не менее после криоконсервиро-

вания ФНК-11 с 10% ДМСО количество клеток, в

которых МАТ были способны его идентифици-

ровать с рецептором, повышалось в 1,5 раза по

сравнению с интактным контролем (рис. 4).

Выводы

Установлено, что криоконсервированные по вы-

бранным программам ФНК сохраняют структур-

ные и фенотипические характеристики. Вместе с

тем очевидно, что режимы Крио-1 и Крио-2 обла-

дают различной “тропностью” в отношении субпо-

пуляционного состава ФНК-11. Результаты морфо-

логического анализа показали, что Крио-1 (7%

ДМСО) в большей степени обеспечивает сохран-

ность незрелых глиобластов, тогда как при Крио-2

(10% ДМСО) более криоустойчивыми оказались

недифференцированные нейробласты. Эти данные

коррелировали с показателями экспрессии нейро-

специфических белков нестина и GFAP, а также

неспецифического белка нейрофиламентов – β-

тубулина. Поскольку нестин – иммуноморфологи-

ческий маркер нейральных стволовых/прогенитор-

ных клеток, а локализация GFAP в клетках микро-

глии также является маркерным белком астроци-

тов, можно считать выбранные режимы криокон-

сервирования “естественным сортером” – моди-

фикатором, селективно обеспечивающим преиму-

щество нейральных стволовых/прогениторных или

глиальных клеток.

Литература

Гиляров А.В. Нестин в клетках центральной нервной

системы // Морфология.– 2007.–Т. 131,№1.– С. 85–90.

Гольцев A.M., Бабенко Н.М., Останкова Л.В. и др. Засто-

сування кріоконсервованих продуктів ембріофетопла-

центарного комплексу (ПЕФПК) як коректорів аутоімунних

захворювань на моделі експериментального алергійного

енцефаломієліту (ЕАЕ) // Трансплантологія.– 2003.– Т. 4,

№1.– С. 207–209.

Гольцев А.М., Гурина Т.М., Бабенко Н.Н. Влияние различ-

ных режимов криоконсервирования на некоторые харак-

теристики эмбриональных нервных клеток // Пробл.

криобиологии.– 2003.– №1.– С. 46–50.

Гольцев А.Н., Дубрава Т.Г., Останкова Л.В. и др. Особен-

ности влияния криоконсервирования на функциональ-

ment intracellular axon transport. It has been shown

that tubilins have no specificity and evolutionally they

are quite stable proteins [11]. Nevertheless after

cryopreservation of FNCs-11 with 10% DMSO the

number of cells, wherein AMT were able to identify it

with the receptor, increased in 1.5 times if compared

with intact control (Fig. 4).

Conclusions

FNCs cryopreserved according to the selected

protocols have been established to preserve structural

and phenotypic characteristics. Along with this it is

evident that regimens Cryo-1 and Cryo-2 have diffe-

rent “tropicity” in respect of sub-populational compo-

sition of FNCs-11. The results of morphological analysis

have shown that Cryo-1 (7% DMSO) in a greater

extent provides the preservation of immature glioblasts,

meanwhile at Cryo-2 (10% DMSO) non-differentiated

neurobalsts occurred to be more cryoresistant. These

data correlated with the expression indices of neurospe-

cific proteins of nestin and GFAP, as well as nonspeci-

fic protein of neurofilaments, β-tubulin. Since nestin is

an immune morphological marker of neural/progenitor

cells, and GFAP localization in microglia cells is a mar-

ker protein of astrocytes, one may consider the chosen

cryopreservation protocols as “natural sorter”, i. e.

modifier, selectively providing the advantage of neural

stem/ progenitor or glial cells.

References

Gilyarov A.V. Nestin in cells of central nervous system//

Morphologiya.– 2007.– Vol. 131, N1.– P. 85–90.

Goltsev A.M., Babenko N.M., Ostankova L.V. et al. Application

of cryopreserved products of embryofetoplacental complex

(PEFPC) as the correcting agents of autoimmune diseases in

model of experimental allergic encephalomyelitis (EAE)//

Transplantologiya.– 2003.– Vol. 4, N1.– P. 207–209.

Goltsev A.N., Gurina T.M., Babenko N.N. Effect of different

cryopreservation regimens on some characteristics of

embryonic neuronal cells// Problems of Cryobiology.– 2003.–

N1.– P. 46–50.

Goltsev A.N., Dubrava T.G., Ostankova L.V. Peculiarities of

cryopreservation effect on functional potential of fetal liver

hemopoietic stem cells of various gestation terms// Problems

of Cryobiology.– 2009.– Vol. 19, N2.– P. 186–199.

Gosheva A.E., Buravlev V.M. Culturing of human and animal

nerve tissue and its use when studying some diseases of

central nervous system // Zhurn. Nevropatologii i Psikhiatrii

im. S.S. Korsakova.– 1972.– Vol. 72, Issue 7.– P. 1091–1097.

Grischenko V.I. The role of cryobiology in creation of bio-

technologies for cellular and tissue transplantation// Problems

of Cryobiology.– 2001.– N3.– P. 7–9.

Grischenko V.I., Goltsev A.M. Modification of lympho-hemo-

poietic state of organism when using the products of fetopla-

cental complex // Transplantologiya.– 2001.– Vol. 2, N1.– P. 32–

42.

Grischenko V.I., Sandomirsky B.P. Conception of cell thera-

py // Problems of Cryobiology.– 2000.– N1.– P. 3–7.

Immunology: Laboratory Manual/ E.U. Paster, V.V. Ovod, V.K.

Pozur, N.E. Vyhot.– Kiev: Vysscha shkola, 1989.– 304 p.

437

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

ный потенциал стволовых кроветворных клеток фе-

тальной печени разных сроков гестации // Пробл. крио-

биологии.– 2009.– Т. 19, №2.– С.186–199.

Гошева А.Е., Буравлев В.М. Культивирование нервной

ткани человека и животных и использование ее при

изучении некоторых заболеваний центральной нервной

системы // Журн. невропатологии и психиатрии им.

С.С. Корсакова.– 1972.– Т. 72, Вып. 7.– С. 1091–1097.

Грищенко В.И. Роль криобиологии в создании биотехноло-

гий клеточной и тканевой трансплантации // Пробл. крио-

биологии.– 2001.– №3.– С.7–9.

Грищенко В.І., Гольцев А.М. Модифікація стану лімфогемо-

поетичного комплексу організму в умовах застосування

продуктів фетоплацентарного комплексу // Транспланто-

логія.– 2001.– Т. 2, №1.– С. 32–42.

Грищенко В.И., Сандомирский Б.П. Концепция клеточной

терапии // Пробл. криобиологии.– 2000.– №1.– С. 3–7.

Иммунология. Практикум / Е.У. Пастер, В.В. Овод,

В.К. Позур, Н.Е. Вихоть.– Киев: Вища школа, 1989.– 304 с.

Кріоконсервування ембріональної нервової тканини для

клінічного використання: Методичні рекомендації /

В.І. Грищенко, О.С. Снурніков, О.Ю.Петренко.– Харків,

1999.– 21 с.

Коржевский Д.Э., Гиляров А.В, Кирик О.В. Белки промежу-

точных филаментов в клетках нервной ткани // Морфо-

логия.– 2008.–Т. 133, №2.– С. 66–70.

Криоконсервирование клеточных суспензий / Под ред.

А.А. Цуцаевой.– Киев: Наук, думка, 1983.– 240 с.

Лабораторные методы исследования в клинике: Спра-

вочник / Под ред. В.В. Меньшикова.– М.: Медицина, 1987.–

365 с.

Лебединец Д.В., Гольцев А.Н. Криоконсервированные

эмбриональные нервные клетки в терапии острого пе-

риода ишемического инсульта // Пробл. криобиологии.–

2008.– Т. 18, №1.– С. 27–33.

Меркулов Г.А. Курс патологоанатомической техники.–

Л.: Медгиз, 1980.– 340 с.

Улумбеков Э.Г., Челышев Ю.А. Гистология (введение в

патологию).– М.: ГЭОТАР, 2007.– 947 с.

Фуллер Б., Грин К., Грищенко В.И. Криоконсервирование

для создания банка клеток: современные концепции на

рубеже XXI столетия // Пробл. криобиологии.– 2003.– №2.–

С. 62–83.

Cai R.S., Xue D.L., Jiang X.H. Cryopreservation and culture

of the human fetal brain tissues // J. Tongji Med. Univ.– 1993.–

Vol.13, N3.– P. 138–142.

Collier T.J., Gallagher M.J., Sladek C.D. Cryopreservation

and storage of embryonic rat mesencephalic dopamine neu-

rons for one year: comparison to fresh tissue in culture and

neural grafts // Brain Res.– 1993.– Vol. 623, N2.– P. 249–256.

Goltsev A.N., Grischenko V.I., Sirous M.A. et al. Cryopreser-

vation: an optimizing factor for therapeutic potential of fetopla-

cental complex products // Biopreservation and Biobanking.–

2009.– Vol. 7, N1.– P. 29–38.

Fang J., Zhang Z.X. Cryopreservation of embryonic cerebral

tissue of rat // Cryobiology.– 1992.– Vol. 29, N2.– P. 267–273.

Mazur P. Freezing of living cells: mechanism and implication //

Am. J. Physiol.– 1984.– Vol. 247, N3, Pt. 1.– P. 125–142.

Nebe-von-Caron G., Stephens P.J., Hewitt C.J. et al. Analysis

of bacterial function by multi-colour fluorescence flow

cytometry and single cell sorting // J. Microbiol. Methods.–

2000.– Vol. 42, N4.– P. 97–114.

Redmond D.E.Jr., Naftolin F., Collier T.J. et al. Cryopreser-

vation, culture and transplantation of human fetal mesence-

phalic tissue into monkeys // Science.– 1988.– Vol. 242,

N4879.– P. 768–771.

Поступила 10.11.2009

Рецензент Н.А. Волкова

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

Cryopreservation of embryonic nerve tissue for clinical

using: Methodical recommendations/ V.I. Grischenko,

O.S. Snurnikov, O.Yu. Petrenko.– Kharkov, 1999.– 21 p.

Korzhevskiy D.E., Gilyarov A.V., Kirik O.V. Proteins of inter-

mediate filaments in nerve tissue cells // Morphologiya.– 2008.–

Vol. 133, N2.– P.66-70.

Cryopreservation of cell suspensions/ Ed. by A.A. Tsutsae-

va.– Kiev: Naukova Dumka, 1983.– 240 p.

Laboratory methods of investigations in clinic. Reference

book / Ed. by V.V. Menshikov.– Moscow: Meditsina, 1987.–

365 p.

Lebedinets D.V., Goltsev A.N. Cryopreserved embryonic

nerve cells in therapy of ischemic insult period// Problems of

Cryobiology.– 2008.– Vol. 18, N1.– P. 27–33.

Merkulov G.A. Course of pathoanatomical technique.– Lenin-

grad: Medgiz, 1980.– 340 p.

Ulumbekov E.G., Chelyshev Yu.A. Histology (introduction into

pathology).– Moscow: GEOTAR, 2007.– 947 p.

Fuller B., Green C., Grischenko V.I. Cryopreservation for

cell banking: current concepts at the turn of the 21

century //

Problems of Cryobiology.– 2003.– N2.– P. 62–83.

Cai R.S., Xue D.L., Jiang X.H. Cryopreservation and culture

of the human fetal brain tissues // J. Tongji Med. Univ.– 1993.–

Vol.13, N3.– P. 138–142.

Collier T.J., Gallagher M.J., Sladek C.D. Cryopreservation

and storage of embryonic rat mesencephalic dopamine neu-

rons for one year: comparison to fresh tissue in culture and

neural grafts // Brain Res.– 1993.– Vol. 623, N2.– P. 249–256.

Goltsev A.N., Grischenko V.I., Sirous M.A. et al. Cryopreser-

vation: an optimizing factor for therapeutic potential of fetopla-

cental complex products // Biopreservation and Biobanking.–

2009.– Vol. 7, N1.– P. 29–38.

Fang J., Zhang Z.X. Cryopreservation of embryonic cerebral

tissue of rat // Cryobiology.– 1992.– Vol. 29, N2.– P. 267–273.

Mazur P. Freezing of living cells: mechanism and implication //

Am. J. Physiol.– 1984.– Vol. 247, N3, Pt. 1.– P. 125–142.

Nebe-von-Caron G., Stephens P.J., Hewitt C.J. et al. Analysis

of bacterial function by multi-colour fluorescence flow

cytometry and single cell sorting // J. Microbiol. Methods.–

2000.– Vol. 42, N4.– P. 97–114.

Redmond D.E.Jr., Naftolin F., Collier T.J. et al. Cryopreser-

vation, culture and transplantation of human fetal mesence-

phalic tissue into monkeys // Science.– 1988.– Vol. 242,

N4879.– P. 768–771.

Accepted in 10.11.2009

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

438

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

* Адреса для листування: пр.Постишева, 2а, м.Харків,

Україна, 61039; тел.: (+38 057) 373-90-97, електронна пошта:

info@therapy.gov.ua

* Address for correspondence: 2A, Postysheva ave., Kharkov,

Ukraine 61039; tel.:+380 57 373 9097, e-mail: info@therapy.gov.ua

SD “Institute of Therapy of the L.T. Malaya name of Academy

Medical Sciences of Ukraine” , Kharkov

ДУ “Інститут терапії ім. Л.Т.Малої АМН України”, м. Харків

УДК 547.96:616-005.4:599.323.42

Л.М. САМОХІНА

Eластази за умов природної гібернації у хом‘яків

UDC 547.96:616-005.4:599.323.42

L.M. SAMOKHINA

Elastases Under Natural Hibernation in Hamsters

Природна гібернація у дорослих хом‘яків-самців приводить до зростання активності еластаз та еластазоінгібіторної

активності (ЕІА) α-1-інгібітору протеїназ (α-1-ІП) у більшості тканин. Ранній період відновлення (через 2 год після гібернації)

характеризується підвищенням рівня еластаз та зниженням ЕІА в мозочку та стовбурі мозку. Пізній етап відновлення (через

24 год) є відображенням прагнення організму до рівноваги в системі еластаза-α-1-ІП.

Ключові слова: еластаза, ендотеліальна еластаза, металоеластаза, α-1-інгібітор протеїназ, зимова сплячка.

Природная гибернация у взрослых хомяков-самцов приводит к повышению активности эластаз и эластазоингибиторной

активности (ЭИА) α-1-ингибитора протеиназ (α-1-ИП) в большинстве тканей. Ранний период восстановления (через 2 ч после

гиберанции) характеризуется повышением уровня эластаз и снижением ЭИА в мозжечке и стволе мозга. Поздний этап

восстановления (через 24 ч) является отображением стремления организма к равновесию в системе эластаза-α-1-ИП.

Ключевые слова: эластаза, эндотелиальная эластаза, металлоэластаза, α-1-ингибитор протеиназ, зимняя спячка.

Natural hibernation in mature male hamsters results in an increased elastase activity and elastase-inhibitory activity (EIA) of

α-

1-inhibitor of proteinases (α-1-IP) in the most samples of the studied tissues. An early period of organism recovery (2 hrs after

hibernation) is characterised by an increased elastase level and EIA decrease in cerebellum and brain stem, within a later one (24 hrs after

hibernation) a balance in the elastase α-1-IP system is established.

Key words: elastase, endothelial elastase, metalloelastase, α-1-proteinase inhibitor, torpor.

Процес адаптації організму до факторів зовніш-

нього середовища, які змінюються, тісно пов’яза-

ний з перебудовою певних показників гомеостазу

(рівнів функціонування систем і органів).

Для багатьох ссавців низька температура та

дефіцит джерел харчування на початку зими є сиг-

налами до занурення у стан гібернації (зимова

сплячка) [24], який забезпечує виживаність певних

видів тварин і уникання впливу негативних факторів

навколишнього середовища. Одним з прикладів

адаптивних реакцій організму гібернаторів є суттєве

зниження активності метаболічних процесів [13, 19,

24]. При цьому зменшується потреба в кисні, упо-

вільнюється серцевий ритм [13]. Транскрипція,

трансляція, мітоз, мітохондріальне дихання цілком

пригнічуються під час торпору [24], знижується ін-

тенсивність процесів синтезу і розпаду білків [18].

Активність протеолітичних процесів відзначають

на вхідній фазі торпору, коли білкові порушення

компенсуються синтезом протеїнів, які мають

менш кластеризовану організацію [22]. Відомо, що

регіональний розподіл кровотока, транспортування

та утилізації субстратів є тканиноспецифічними

процесами [25].

Однією з особливостей механізмів адаптації до

низьких температур є залучення реактивних форм

кисню, які можуть викликати розвиток оксида-

The process of organism adaptation to changing

environmental factors are tightly related to the re-

arrangements of certain indices of homeostasis (levels

of system and organ functioning).

For many mammals a low temperature and

deficiency in nutrient sources at early winter are the

signals to go into hibernation state (winter hibernation)

[24], providing the survival for certain mammalian

species and protection against negative environmental

factors. One of the examples of adaptive responses

of hibernators’ organism is a significant decrease in

metabolic process activity [13, 19, 24]. Herewith there

are a decrease in oxygen need and the deceleration of

a cardiac rhythm [13]. Transcription, translation,

mitosis, mitochondrial respiration are completely sup-

pressed during torpor [24], the intensity of synthesis

and protein decay processes reduces [18]. The activity

of proteolytic processes is determined in a pre-torpor

phase, when the protein disorders are compensated

with protein synthesis, having less clustered structure

[22]. Regional distribution of blood flow, substrate

transport and utilisation are known to be the tissue-

specific processes [25].

One of the peculiarities of adaptive mechanisms to

low temperatures is the involvement of oxygen reactive

forms, capable to cause the development of oxidative

stress and cell damaging [13]. The activation of

439

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

тивного стресу та пошкодження клітин [13]. При

оксидативному стресі відбувається активація нейт-

рофілів, які здатні вивільняти вільні радикали разом

з серіновою еластазою та іншими ферментами [10].

Активація еластази (Ел) може призводити до

деструктивних змін тканин. Цей фермент гідролізує

еластин, протеоглікани, білки (гемоглобін, фібрино-

ген, неспіральні ланцюги колагену), розщеплює

поперечні зв’язки між ними та інш. Однак відомо,

що рівень оксидативного стресу мінімальний за

умов нормальної зимової сплячки [14]. Автори

вказують на можливість міграції та часткове пош-

кодження нейтрофілів, внаслідок чого зменшується

їх кількість [16]. Крім того, мінімальний рівень окси-

дативного стресу може бути забезпечений за раху-

нок зростання активності металоеластази (МЕл)

або матричної металопротеази 12, яка вивіль-

няється макрофагами [14]. Вважають, що актива-

ція МЕл, яка пов’язана з продукцією макрофагами

кисневих радикалів, є проявом природженого імуні-

тету [11].

Відомо, що Ел вивільняють не тільки нейтрофіли,

макрофаги, але і клітини гладких м’язів (серінова

Ел), ендотеліоцити (тіолова Ел) [2]. Роль різних за

походженням еластаз у формуванні адаптивної від-

повіді організму за умов зимової сплячки не

досліджена.

Регуляція активності еластаз в організмі відбу-

вається за участю α-1-інгібітору протеїназ (α-1-

ІП), роль якого в контролі активності еластаз в

умовах зимової сплячки не визначена, але відомо,

що сезонні коливання його концентрації в плазмі

крові бурих ведмедів пов’язані з незначним

вкладом у протизапальний ефект [21].

Мета роботи – дослідити активність еластаз та

α-1-ІП за умов природної гібернації.

Матеріали і методи

Експерименти проводили на статевозрілих (6-

10 місяців) самцях золотавих хом’яків Mesocre-

chetus auratus, які є факультативними гібернатора-

ми. Тварин утримували в умовах віварію на стан-

дартному раціоні з додаванням пшениці та насіння

соняшнику. За умов перебування при 4–7°С у

неосвітленій камері з нормальним постачанням

кисню хом’яки впадали в зимову сплячку, знаходи-

лись у торпідному стані протягом 3–3,5 діб, потім

пробуджувались і знову впадали в сплячку. На 2–

4-му бауті (епізод сплячки) тварин декапітували.

Експеримент виконували на 4-х групах тварин: 1 –

стан зимової сплячки; 2 – ранній (через 2 год) та

3 – пізній (через 24 год) етапи відновлення орга-

нізму після виходу зі сплячки; 4 – контроль.

Дослідження проводили відповідно до “Загаль-

них етичних принципів експериментів на тваринах”,

схвалених II Національним конгресом з біоетики

neutrophils, capable for free radical release together

with serine elastase and other enzymes, occurs under

oxidative stress [10]. The elastase (El) activation may

result in destructive changes in tissues. This enzyme

hydrolyses elastin, proteoglycans, proteins (hemoglobin,

fibrinogen, non-spiral collagen chains), splits the cross

bonds between them etc. However, the oxidative stress

level is known to be the minimum under normal winter

hibernation [14]. The migration and a partial damage

of neutrophils are possible, resulting in their number

reduction [16]. In addition, the minimum level of

oxidative stress may be stipulated by an increase in

activity of metalloelastase (MEl) or matrix metallo-

protease 12, released by macrophages [14]. The MEl

activation, relating to oxygen radical production by

macrophages, is considered to be the manifestation of

congenital immunity [11].

The El is known to release not only by neutrophils,

macrophages, but smooth muscle cells (serine El),

endotheliocytes (thiol El) as well [2]. The role of

differently originated elastases in an organism’s adap-

tive response formation during winter hibernation has

not been investigated.

The regulation of elastase activity in an organism

occurs with the participation of α-1-inhibitor of

proteinases (α-1-IP), the role of which in controlling

the elastase activity under winter hibernation has not

been determined yet, but seasonal fluctuations of its

concentration in brown bear’s blood plasm are known

to be associated with a slight contribution into an anti-

inflammatory effect [21].

The research aim is to investigate the elastase and

α-1-IP activities under natural hibernation.

Materials and methods

Experiments were performed in mature (6–10

months) males of golden hamsters Mesocrechetus

auratus, being the optional hibernators. Animals were

maintained under vivarium conditions, received the

standard diet with adding wheat and sunflower seeds.

When staying at 4–7°C in an unlighted chamber with

normal oxygen supply the hamsters went into winter

hibernation, being in a torpid state within 3-3.5 days,

then aroused and went again into hibernation. To the

–4

bout (hibernation episode) animals were deca-

pitated. The experiment was carried-out in 4 animal

groups: 1 – winter hibernation state; 2 – early (in 2 hrs)

and 3 – late (in 24 hrs) stages of organism recovery

after arousal; 4 – control.

The research was performed according to the

“General ethical principles of experiments in animals”,

approved by the 2

National Congress on Bioethics

(Kiev, 2004) and agreed with the statements of the

“European Convention for the Protection of Vertebrate

Animals Used for Experimental and Other Scientific

Purposes” (Strasbourg, 1985).

440

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

(Київ, 2004) та узгоджених з положеннями «Євро-

пейської Конвенції про захист хребетних тварин, які

використовуються для експериментальних та інших

наукових цілей» (Страсбург, 1985).

У без’ядерних фракціях гомогенатів тканин кори

мозку (КМ), гіпоталамуса, мозочка, стовбура моз-

ку (СМ), легень, серця, печінки і нирок визначали

активність Ел (загальну активність), активність

ендотеліальної Ел (ЕЕл), МЕл та еластазоінгі-

біторну активність (ЕІА) α-1-ІП високочутливим

(10

-10

–10

-12

од/мг білка) ферментативним методом

[9]. Рівень активності еластаз та ЕІА α-1-ІП вира-

жали в од/мг білка. Концентрацію білка в без’ядер-

них фракціях гомогенатів тканин визначали за

методом Бредфорда.

Активність еластаз досліджували при темпера-

турі 37°С, що значно перевищує таку за умов зимо-

вої сплячки, тому мова йде про активність Ел (як і

МЕл, ЕЕл, ЕІА) в тканинах гібернуючих тварин,

які отримані при температурі тіла 5–9°С.

У дослідженнях використовували пероксидазу

хрону, фенілметилсульфонілфлюорид, монойодаце-

тат (“ICN”, США), Ala-Ala (“Fluka”, Німеччина),

еластазу, ЕДТА, альбумін сироватки бика, полі-

стиролові плашки стріпові (Росія) та фотометр-

аналізатор імуноферментний Humanreader №2106-

1709 (“Human”, Німеччина).

Статистичну обробку отриманих даних прово-

дили за методом Стьюдента-Фішера з викорис-

танням програмного забезпечення MS Exсel.

Результати та обговорення

Аналіз результатів експериментів показав, що

у хом’яків в період зимової сплячки (1 група)

спостерігається зростання активності Ел в біль-

шості досліджених тканин, крім серця (зміни від-

сутні) та нирок (зниження показника), порівняно з

контролем (рис. 1). Найбільшу активність виявлено

у тканині СМ.

Зростання активності Ел можливе за участю

нейтрофілів, які вивільняють серінову еластазу

разом з іншими протеолітичними ферментами та

реактивними формами кисню, катіонними пепти-

дами, ейкозаноїдами [10]. Цей факт, як відзнача-

лося раніше, є характеристикою оксидативного

стресу, рівень якого мінімальний за умов нормаль-

ної зимової сплячки [14]. Відомо [10], що при

оксидативному стресі активність нейтрофілів обу-

мовлена дією різних цитокінів і хемоатрактантів:

фактору некрозу пухлин – α (ФНП-α), інтерлейкі-

ну-8 (ІЛ-8) та інш. Відсутність змін у серці, де саме

цитокіни (ФНП-α, ІЛ-1, ІЛ-6) ініціюють відповідь

міокарда на екологічний тиск [20], може свідчити

про наявність іншого механізму активації Ел.

В умовах зимової спляч-ки вивільнення Ел в тка-

In non-nucleated fractions of tissue homogenates

of cerebral cortex (CC), hypothalamus, cerebellum,

brain stem (BS), lung, heart, liver and kidneys there

were determined the activities of El (total activity),

endothelial El (EEl), MEl and elastase-inhibitor activity

(EIA) of α-1-IP using the high-sensitive (10

-10

–10

-12

Units/mg of protein) enzyme method [9]. The level of

elastase and EIA α-1-IP activities was expressed in

Units/mg of protein. Protein concentration in non-

nucleated fractions of tissue homogenates as deter-

mined using the Bradford method.

The elastase activity was studied at 37°C, that

significantly exceeds it under winter hibernation,

therefore the matter in the El activity (as well as MEl,

EEl and EIA) in hibernating animals’ tissues, obtained

at 5–9°C body temperature.

In the experiments we used the horseradish pero-

xidase, phenylmethylsulfonyl fluoride, monoiodoacetate

(ICN, USA), Ala-Ala (Fluka, Germany), elastase,

EDTA, bovine serum albumin, polystyrene strip plates

(Russia) and immune-enzyme photometer-analyser

Humanreader N2106-1709 (Human, Germany).

The results were statistically processed with the

Student-Fisher test using Excel software.

Results and discussion

Analysis of experimental results demonstrated, that

in hamsters during winter hibernation (1

group) there

was observed an increase in El activity in the most

studied tissues, excepting heart (no changes) and

kidneys (reduced index), compared to the control

(Fig. 1). The highest activity was revealed in BS tissue.

An increase in El activity is possible with the parti-

cipation of neutrophils, releasing a serine elastase

together with other proteolytic enzymes and reactive

oxygen forms, cation peptides, eicosanoids [10]. As it

was mentioned previously, this fact was a feature of

oxidative stress, the level of which was the minimum

under normal winter hibernation [4]. Under oxidative

stress the neutrophil activity is known [10]as stipulated

by the effect of different cytokines and chemoattrac-

tants: tumour necrosis factor-α (TNF-α), interleukine-

8 (IL-8) etc. No changes in heart, where namely

cytokines (TNF-α, IL-1, IL-6) initiate the myocardium

response to ecological pressure [20], may testify to

the presence of other mechanism of El activation.

Under winter hibernation the El release in animal

tissues, especially in brain, is possible because of

migration and a partial damage of neutrophils, due to

that their number reduces [16]. The authors [16]

indicate to the absence of pathological changes, coin-

ciding to the results of our research. It is likely stipulated

by the fact, that an enzyme activity is usually measured

at 37°C and during winter hibernation the presence of

elastase active forms does not result in pathological