Журнал - Проблемы криобиологии 2009 №4

Подождите немного. Документ загружается.

401

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

ному окрашиванию и даже по количеству прикре-

пившихся к подложке клеток.

Исследование общего количества распластан-

ных клеток в культуре ФЧ после криоконсервиро-

вания (рис. 2) при добавлении ФКК в среду, содер-

жащую 10% ЭС, выявило, что через 1,5 ч после

посева этот показатель составил 54 ± 1%, что на

8,8% выше, чем в контроле. Действие “Актовегина”

достоверно не отличалось от действия ФКК. Через

3 ч после посева общее количество распластанных

клеток в среде, содержащей 10% ЭС, с добавле-

нием ФКК и “Актовегина” составило 81 ± 1,4 и

78,4 ± 2,2% соответственно, что достоверно отли-

чалось от контроля. К 24 ч культивирования досто-

верных отличий от контроля в общем количестве

распластанных клеток при добавлении ФКК и

“Актовегина” в среду, содержащую 10% ЭС, обна-

ружено не было.

При добавлении ФКК в среду, содержащую 2%

ЭС, через 1,5 ч после посева общее количество

распластанных клеток составило 67,4 ± 1,4%, что

на 10,8% больше, чем в контроле, и на 13,4%, чем

в среде с 10% ЭС. При добавлении “Актовегина”

этот показатель достоверно превышал контроль,

но был достоверно ниже, чем в среде с ФКК. Че-

рез 3 ч после посева общее количество расплас-

танных клеток при добавлении в среду культи-

вирования, содержащую 2% ЭС, как ФКК, так и

“Актовегина”, также достоверно превышало конт-

роль и достоверно не отличалось от этого пока-

зателя в среде, содержащей 10% ЭС. Во всех

образцах через 5 и 24 ч культивирования ФЧ в среде

с 2% ЭС не было обнаружено достоверных отли-

чий в общем количестве распластанных клеток.

Изучение степени распластанности ФЧ под

влиянием ФКК показало (рис. 2), что количество

веретенообразных клеток при его добавлении в

среду, содержащую 10% ЭС, увеличивалось через

1,5; 3 и 5 ч в 2,8; 5,9 и 6,5 раз соответственно по

сравнению с контролем. Через 24 ч количество

веретенообразных клеток при добавлении ФКК в

среду, содержащую 10% ЭС, составило 68 ± 2,4%

и достоверно не отличалось от контроля. Действие

“Актовегина” было аналогичным.

Добавление ФКК в среду культивирования,

содержащую 2% ЭС, показало, что уже через 1,5 ч

количество веретенообразных клеток составило

36,0 ± 2%, что в 2,7 и 2,0 раза больше, чем в конт-

роле и при добавлении “Актовегина” соответст-

венно. Через 3 и 5 ч количество веретенообразных

клеток при добавлении ФКК в среду культивиро-

вания было достоверно выше в 1,6 и 1,2 раза соот-

ветственно, чем в контроле, и превышало действие

“Актовегина” в 1,1 и 1,3 раза. К 24 ч количество

веретенообразных клеток при добавлении ФКК и

“Актовегина” в среду культивирования с 2% ЭС

and significantly higher, than in the one with 10% ES:

within the first 1.5 hrs after inoculation it made 13.4 ±

1.1%, but to the 5 hrs increased to 37.4 ± 0.5%. To

24 hrs of culturing the situation changed: the number

of spindle-shaped cells in the media, containing 10 and

2% ES achieved 71.2 ± 1.5 and 56.8 ± 0.9%, corres-

pondingly.

The obtained results of HFs flattening dynamics

on a substrate testify to the fact, that the blood serum

in culturing medium is important for reparative process

proceeding in cells after cryopreservation. In spite of

a high rate of HFs flattening at initial stages of culturing

in the 2%-containing medium, there was finally obtained

a less degree of cell flattening, compared to the cul-

turing in the medium with 10% ES, testifying to a lack

in adhesive serum factors.

Obviously, the absence of flattening features within

the first days after inoculation reflects the functional

damages of cells, obtained under cryopreservation, not

revealed during supravital staining and even by the

number of cells, attached to a substrate.

Studying the total number of flattened cells in HFs

culture after cryopreservation (Fig. 2), when adding

FCB into the medium, containing 10%ES, demon-

strated, that 1.5 hrs after inoculation this index was

54 ± 1%, that was by 8.8% times higher, than in the

control. Actovegin effect remained statistically and

significantly unchanged, compared to FCB one. In 3

hrs after inoculation the total number of flattened cells

in the medium, containing 10% ES, with adding FCB

and Actovegin was 81 ± 1.4 and 78.4 ± 2.2%, corres-

pondingly, that statistically and significantly differed

from the control. To the 24 hrs of culturing no statis-

tically significant differences from the control in a total

number of flattened cells under FCB and Actovegin

adding into the 10% ES-containing medium, were

revealed.

When adding FCB into the medium with 2% ES, in

1.5 hrs after inoculation the total number of flattened

cells was 67.4 ± 1.4%, that was by 10.8 and 13.4%

higher, compared to the control and the medium with

10% ES, correspondingly. Under Actovegin adding this

index statistically and significantly exceeded the control,

but remained statistically and significantly lower, than

in the medium with FCB. In 3 hrs after inoculation the

total number of flattened cells under the adding into

2% ES-containing culturing medium of both FCB and

Actovegin statistically and significantly exceeded the

control as well and remained statistically and signifi-

cantly unchanged from this index in the medium with

10% ES. In all the samples in 5 and 24 hrs after HFs

culturing with 2% ES no statistically significant

differences were found out in the total number of flat-

tened cells.

Studying the HFs flattening rate under FCB effect

demonstrated (Fig. 2) a number of spindle-shaped cells

402

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

составило соответственно 59,8 ± 0,9 и 60,6 ± 0,8%,

что достоверно выше, чем в контроле.

Следует отметить, что в первые 5 ч роста куль-

туры количество веретенообразных клеток при

добавлении ФКК в среду, содержащую 2% ЭС,

было выше, чем при добавлении в среду с 10%

ЭС. Однако через 24 ч количество веретенооб-

разных клеток в среде с 2% ЭС было достоверно

ниже по сравнению с показателями степени рас-

пластанности клеток в среде, содержащей 10% ЭС,

как в контроле, так и при добавлении ФКК и “Акто-

вегина”.

Таким образом, установлено, что при культиви-

ровании диплоидной культуры ФЧ после криокон-

сервирования ФКК оказывает действие, стимули-

рующее процессы клеточной адгезии, которое вы-

ражено на начальном этапе роста культуры в

первые 5 ч. Отсутствие влияния ФКК при его до-

бавлении в среду, содержащую 10% ЭС, на адге-

зию клеток через 24 ч роста культуры может

свидетельствовать о завершении процесса рас-

пластывания сохранившихся после криоконсер-

вирования клеток.

После изучения адгезии диплоидной культуры

ФЧ мы исследовали дальнейший ее рост в средах

с различным содержанием ЭС до и после криокон-

сервирования.

Известно, что после максимального распласты-

вания клетки и формирования характерной морфо-

логии на подложке она становится чувствительной

к действию митогенов. Следовательно, увеличение

скорости распластывания культуры приводит к

более раннему запуску в клетках механизмов

подготовки к делению и вступлению в митоти-

ческий цикл. Также ранее мы установили, что ФКК

и “Актовегин” стимулируют митотическую актив-

ность клеток [5, 16]. Таким образом, эти факторы

приводят к увеличению пролиферации культуры.

Показано, что количество клеток на 4-е сутки

роста нативной культуры ФЧ при культивировании

в среде, содержащей 2% ЭС, составило 63,3%

относительно этого показателя при культивиро-

вании в среде с 10% ЭС (рис. 3). Добавление ФКК

в среду культивирования, содержащую 10% ЭС,

приводило к увеличению количества клеток в

исследуемые сроки относительно контрольных

значений на 78%, что превышает данный показа-

тель при добавлении “Актовегина”.

Добавление ФКК в ростовую среду, содержа-

щую 2% ЭС, стимулировало прирост клеток отно-

сительно контроля на 72,8%, а добавление “Акто-

вегина” в аналогичной концентрации оказалось

менее эффективным и стимулировало прирост кле-

ток относительно контроля на 45,2%.

По сравнению с ростом нативной культуры ко-

личество ФЧ после криоконсервирования во всех

under its adding into the medium, containing 10% ES,

as increasing after 1.5, 3, and 5 hrs in 2.8, 5.9 and 6.5

times, correspondingly, compared to the control. After

24 hrs a number of spindle-like cells under FCB adding

into the medium with 10% ES was 68 ± 2.4% and did

not statistically and significantly differ from the control.

Actovegin effect was similar.

FCB adding into the culturing medium, containing

2% ES, showed a number of spindle-like cells even in

1.5 hrs to make 36.0 ± 2%, being in 2.7 and 2.0 times

higher, than in the control and under Actovegin adding,

correspondingly. In 3 and 5 hrs the number of spindle-

shaped cells under FCB adding into culturing medium

was statistically and significantly higher in 1.6 and 1.2

times, correspondingly, if comparing to the control and

exceeded the Actovegin effect in 1.1 and 1.3 times.

To the 24 hrs the number of spindle-shaped cells under

FCB and Actovegin adding into the culturing medium

with 2% ES was 59.8 ± 0.9 and 60.6 ± 0.8%, corres-

pondingly, being statistically and significantly higher,

than in the control.

Of note is the fact, that within the first 5 hrs of cul-

ture growth the number of spindle-like cells under FCB

adding into the medium with 2% ES, was higher, com-

pared to adding in 10% one. However in 24 hrs the

number of spindle-like cells in the medium with 2%

ES was statistically and significantly lower, compared

to the indices of cell flattening degree in that with 10%

ES, both in the control and under FCB and Actovegin

adding.

Thus, there was established, that under HFs diploid

culture culturing after cryopreservation, the FCB cau-

sed the effect, stimulating the cell adhesion processes,

manifested at an initial stage of culture growth within

the first 5 hrs. No FCB effect under its adding into the

medium with 10% ES on cell adhesion in 24 hrs of cul-

ture growth may testify to the completion of flattening

process of the cells, preserved after cryopreservation.

After studying the adhesion of HFs diploid culture

we investigated its further growth in the media with

different ES content prior to and after cryopreserva-

tion.

It is known, that after maximum cell flattening and

typical morphology formation on a substrate, it becomes

sensitive to mitogen effect. Consequently, an increased

rate in culture flattening results in earlier triggering in

cells of preparative mechanisms for fission and entry

into mitotic cycle. Previously we also established the

FCB and Actovegin as stimulating the cell mitotic

activity [5, 15]. Thus, these factors result in an in-

creased cell proliferation.

Cell number to the 4

day of HFs native culture

growth under culturing in the medium with 2% ES was

shown to make 63.3% in respect to this index under

culturing in that with 10% ES (Fig. 3). FCB adding

into culturing medium with 10% ES resulted in an

403

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

соответствующих вариантах снижено в 2–2,5 раза

(рис. 4). При добавлении ФКК и “Актовегина” в

среду культивирования деконсервированной культу-

ры ФЧ, содержащую 10% ЭС, достоверно увеличи-

валось количество клеток в исследуемые сроки

роста культуры по сравнению с контролем. Коли-

чество клеток при добавлении ФКК превысило

контроль на 43,4%, а при добавлении “Актовеги-

на” – на 29%. При культивировании ФЧ в среде,

содержащей 2% ЭС, ФКК и “Актовегин” достовер-

но не влияли на рост культуры.

Выявленные отличия в действии ФКК на про-

лиферацию нативной и деконсервированной культур

при их культивировании в среде с пониженной кон-

центрацией ЭС требуют дальнейшего исследо-

вания. Эти данные, вероятно, указывают на повы-

шенную потребность клеток после криоконсер-

вирования в сывороточных факторах для восста-

новления полученных повреждений. При их недос-

татке стимулирующее действие ФКК и “Актове-

гина” не может быть реализовано.

Выводы

Установлено стимулирующее действие ФКК на

адгезивные и пролиферативные свойства диплоид-

ной культуры ФЧ.

Полученные данные свидетельствуют о том,

что при культивировании ФЧ ФКК оказывает более

increase of cell number within the studied terms in

respect to the control values by 78%, that exceeded

this index for Actovegin.

FCB adding into the growth medium, containing 2%

ES, stimulated the cell surplus in respect to the control

by 72.8%, but Actovegin adding in the same concen-

tration occurred to be less efficient and stimulated the

cell surplus in respect to the control by 45.2%.

Comparing to the native culture growth, the HFs

number after cryopreservation in all corresponding

variants reduced in 2–2.5 times (Fig. 4). When adding

FCB and Actovegin in culturing medium of frozen-

thawed culture of HFs, containing 10% ES, there was

a statistically significant increase in cell number within

the studied terms of culture growth, compared to the

control. Cell number under FCB and Actovegin adding

exceeded the control by 43.4 and 29%, correspondingly.

During HFs culturing in the medium with 2% ES, the

FCB and Actovegin did not statistically and significantly

affect the culture growth.

The revealed differences in FCB action on the

proliferation of native and frozen-thawed cultures under

their culturing in the media with reduced ES

concentration need further investigations. These data

probably indicate to an increased cell need in serum

factors after cryopreservation to recover the obtained

damages. Under their lack a stimulating effect of FCB

and Actovegin can not be implemented.

Рис. 3. Прирост клеток на 4-е сутки роста нативной куль-

туры ФЧ при добавлении ФКК и “Актовегина” в росто-

вую среду с различной концентрацией ЭС; * – различия

статистически достоверны по сравнению с соответствую-

щим контролем (р < 0,05).

Fig. 3. Cell increase to the 4

day of HFs native culture

growth when adding FCB and Actovegin into the growth

medium with differently concentrated ES; * – differences

are statistically significant compared to the corresponding

control (p < 0.05).

0,5

1,5

2,5

Коэффициент пролиферации

Proliferation coefficient

Контроль

Control

ФКК

CBF

“Актовегин”

Actovegin

Контроль

Control

ФКК

CBF

“Актовегин”

Actovegin

10% ЭС

10% ES

2% ЭС

2% ES

0,5

1,5

2,5

Контроль

Control

ФКК

CBF

“Актовегин”

Actovegin

Контроль

Control

ФКК

CBF

“Актовегин”

Actovegin

10% ЭС

10% ES

2% ЭС

2% ES

Рис. 4. Прирост клеток на 4-е сутки роста культуры ФЧ

после криоконсервирования при добавлении ФКК и “Ак-

товегина” в ростовую среду с различной концентрацией

ЭС; * – различия статистически достоверны по сравне-

нию с соответствующим контролем (р < 0,05).

Fig. 4. Cell increase to the 4

day of HF culture after cryopre-

servation growth when adding FCB and Actovegin into

the growth medium with differently concentrated ES; * –

differences are statistically significant compared to the cor-

responding control (p < 0.05).

Коэффициент пролиферации

Proliferation coefficient

404

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

Conclusions

Stimulating effect of FCB on adhesive and prolifera-

tive properties of HFs diploid culture was established.

The data obtained testify to the fact, that under

HFs culturing the FCB causes a more pronounced sti-

mulating effect on cell flattening rate after cryopreser-

vation, compared to the native culture.

When comparing the data about FCB and Actovegin

effects on proliferation of native and frozen-thawed

HFs cultures, their stimulating effect after cryopreser-

vation was revealed to be less manifested, compared

to the native culture.

Revealed stimulating effect of FCB on cell functio-

nal metabolism contributes to their early recovery after

cryopreservation, making the application of cryopreser-

ved HFs more efficient from the point of view of cell

therapy.

The authors express gratitude to the senior research

fellow of the Institute for Problems of Cryobiology and

Cryomedicine of the National Academy of Sciences of

Ukraine Goncharuk E.I. for her assistance in experimental

planning and discussion of the results obtained.

выраженное стимулирующее действие на скорость

распластывания клеток после криоконсервиро-

вания, чем в нативной культуре.

При сопоставлении данных о влиянии ФКК и

“Актовегина” на пролиферацию нативной и декон-

сервированной культур ФЧ выявлено, что после

криоконсервирования их стимулирующий эффект

выражен менее, чем в нативной культуре.

Установленное стимулирующее действие ФКК

на функциональный метаболизм клеток способст-

вует их скорейшему восстановлению после крио-

консервирования, что делает применение культи-

вируемых ФЧ более эффективным с точки зрения

клеточной терапии.

Авторы выражают благодарность с.н.с. ИПК и К

НАН Украины Гончарук Е. И. за содействие в планиро-

вании экспериментов и обсуждении полученных резуль-

татов.

References

Biotechnology: characteristics of animal cells, cultured in vitro

[Electronic resource]// [web site] www.biotechnolog.ru

(30.04.2009)

Botsenovsky V.A., Baryshnikov A.Yu. Molecules of human

cell adhesion // Uspekhi Sovr. Biologii.– 1994.– Vol. 144, N6.–

P. 741–753.

Vinogradov V.L., Sukhanov Yu.S. Stabilisation of metabolism

and erythrocyte membranes for improving their cryopreser-

vation // Gematologiya i Trasfuziologiya.– 1988.– N6.– P. 44–51.

Gulevsky O.K., Grischneko V.I., Nikolchenko A.Yu., Moiseye-

va N.M. Properties and perspectiveness of cold blood

application in clinical practice // Ukr. Zhurn. Gematologii ta

Transfuziologii.– 2005.– Vol. 5, N1.– P.5–14.

Gulevsky A.K., Trifonova A.V., Lavrik A.A. Actovegin effect

on cell proliferation of recultured lines // Tsitologiya i Genetika.–

2008.– Vol. 42, N1.– P. 53–57.

Gulevsky A.K., Trifonova A.V., Petrenko T.F., Lavrik A.A. Effect

of fraction from cattle cord blood (below 5 kDa) on prolife-

rative activity of cells in vitro after cryopreservation //

Interdepartm. Thematic Scient. Coll. “Veterynarna medytsy-

na”.– 2008.– P. 147–153.

Erokhin A.I. Usage of human fibroblast culture at surgical

treatment of inflammatory diseases of parodontium: Author’s

abstract of thesis of candidate of medical sciences.–

Moscow, 2002.– P. 9–13.

Zhilina N.M., Ivanova V.B., Koren’ N.N. et al. Comparative

analysis of skin autoplate using the standard methods and

with cell culture of fibroblasts // Vestnik novykh meditsinskikh

tekhnologiy.– 1977.– Vol. 4, N1.– P. 2.

Kolosov N.G., Poveschenko O.V. Efremov A.V. et al. The

use of fetal cells and tissue in the therapy of superficial

wounds and trophic ulcers // Bull. eksperim. biologii i

meditsyny.– 1988.– Vol. 126, Suppl. 1.– P. 128–129.

Methodical recommendations on cryopreservation and cyto-

logical control of quality of cell cultures and tissue fragments.–

Kharkov, 1993.– 20 p.

Литература

Биотехнология: характеристика животных клеток,

культивируемых in vitro [Электронный ресурс]// [веб-

сайт] www.biotechnolog.ru (30.04.2009).

Боценовский В.А., Барышников А.Ю. Молекулы клеточной

адгезии человека // Успехи совр. биологии.– 1994.– Т. 144,

№6.– С. 741–753.

Виноградов В.Л., Суханов Ю.С. Стабилизация метаболиз-

ма и мембран эритроцитов в целях усовершенствования

их криоконсервирования // Гематология и трансфузио-

логия.– 1988.– №6.– С. 44–51.

Гулевський О.К., Гріщенко В.І., Нікольченко А.Ю., Моісєє-

ва Н.М. Властивості і перспективи використання кордо-

вої крові в клінічній практиці // Укр. журн. гематології та

трансфузіології.– 2005.– Т. 5, №1.– С. 5–14.

Гулевский А.К., Трифонова А.В., Лаврик А.А. Влияние ак-

товегина на пролиферацию клеток перевиваемых линий //

Цитология и генетика.– 2008.– Т. 42, №1.– С. 53–57.

Гулевский А.К., Трифонова А.В., Петренко Т.Ф., Лав-

рик А.А. Воздействие фракции из кордовой крови круп-

ного рогатого скота (до 5 кДа) на пролиферативную

активность клеток in vitro после криоконсервации // Меж-

відомчий тематичн. наук. збірник “Ветеринарна меди-

цина”.– 2008.– С. 147–153.

Ерохин А.И. Использование культуры фибробластов че-

ловека при хирургическом лечении воспалительных за-

болеваний пародонта: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. –

М., 2002. С.9–13.

Жилина Н.М., Иванова В.Б., Корень Н.Н. и др. Сравнитель-

ный анализ кожной автопластики традиционными

методами и с использованием клеточной культуры фиб-

робластов // Вестник новых медицинских технологий.–

1997.– Т. 4, №1.– С. 2.

Колосов Н.Г., Повещенко О.В., Ефремов А.В. и др. Ис-

пользование фетальных клеток и тканей в лечении по-

верхностных ран и трофических язв // Бюл. эксперим.

биологии и медицины.– 1998.– Т. 126, Прил. 1.– С. 128–129.

Методические рекомендации по криоконсервированию

и цитологическому контролю качества культур клеток и

фрагментов ткани.– Харьков, 1993.– 20 с.

Методы культивирования клеток: Сб. науч. тр. / Под

ред. Г.П. Пинаева.– Л.: Наука, 1988.– 319 с.

10.

11.

10.

405

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

Methods for cell culturing: Collection of scientific papers /

Ed. by G.P. Pinayev.– Leningrad: Nauka, 1988.– 319 p.

Mushkambarov N.N., Kuznetsov S.L. Molecular biology:

Manual for students of medical universities.– Moscow: Medical

Informational Agency, 2003.– 544 p.

Nordvik B. Actovegin. New aspects of clinical application.–

Moscow, 2002.– 280 p.

Practical course on cytology: Manual / Ed by Yu.S. Chentsov.–

Moscow: Publishing House of Moscow University, 1988.–

294 p.

Sarkisov D.S. Theoretical and practical aspects of using

cultured fibroblasts during skin integument recovery // Vestnik

of Russian Academy of Sciences.– 1994.– N6.– P. 6–11.

Trifonova G.V. Usage of low molecular fraction of cord blood

in cell culture biotechnology // Proc. of Conference of Young

Scientists “Actual Problems of Biochemistry and Biotechno-

logy”.– Kiev, 2007.– P. 43.

Patent N 6521, IPC7 A61K35/54 Ukraine, Preparation “Culture

of human diploid cells“ for cell therapy // O.I. Goncharuk,

T.P. Petrenko, N.O. Volkova, V.I. Grischenko, Applied 20.09.04,

Published 16.05.2005.– Bull. N5.

Basic Cell Culture. Practical approach. Second edition / Ed.

by J.M. Davis.– Oxford: University Press, 2001.– 381 p.

Dairkee Sh. H., Gilbert M.W. Production of factors required

for cell attachement and spreading is a constitutive property

in mouse A9 cells // J. Cell. Physiol.– 1979.– Vol. 99, N3.–

P. 319–326.

Folkman J., Moscona A. Role of cell shape in growth control //

Nature.– 1978.– Vol. 273, N5661.– P. 345–349.

Kane O., George E., Offner M. et al. Nine days post-thawing

red cell conservation in a synthetic medium. Biochemical

studies // Transfusion.– 1986.– Vol. 26, N5.– P. 437–440.

Liang Y., Besch-Williford C., Benakanakere I. et al. Re-acti-

vation of the p53 pathway inhibits in vivo and in vitro growth

of of hormone-dependent human breast cancer cells // Int. J.

Oncol.– 2007.– Vol. 31, N4.– P. 777–784.

Montgomery A.M.P., Reisfeld R.A., Cheresh D.A. Integrin α v

β3 rescues melanoma cells from apoptosis in a three-di-

mensional dermal collagen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.–

1994.– Vol. 91, N19.– P. 8856–8860.

Accepted in 26.05.2009

Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Молекулярная биоло-

гия: Учебное пособ. для студ. мед. вузов.– М.: Медицин-

ское информационное агентство, 2003.– 544 с.

Нордвик Б. Актовегин. Новые аспекты клинического при-

менения.– М., 2002.– 280 с.

Практикум по цитологии: Учеб. пособие / Под ред.

Ю.С. Ченцова.– М.: Изд-во Моск. ун-та, 1988.– 294 с.

Саркисов Д.С. Теоретические и практические аспекты

использования культивированных фибробластов при

восстановлении кожных покровов // Вестн. РАН.– 1994.–

№6.– С. 6–11.

Трифонова Г.В. Використання низькомолекулярної фрак-

ції кордової крові у біотехнології культур клітин // Конф.

молодих вчених“Актуальні проблеми біохімії та біотехно-

логії”.– Київ, 2007.– С. 43.

Пат. №6521, МПК

А61К35/54 Украина. Препарат “Куль-

тура диплоїдних клітин людини” для клітинної терапії //

О.І. Гончарук, Т.П. Петренко, Н.О. Волкова, В.І. Грищенко,

Заявл. 20.09.04, опубл. 16.05.2005.– Бюл. №5.

Basic Cell Culture. Practical approach. Second edition / Ed.

by J.M. Davis.– Oxford: University Press, 2001.– 381 p.

Dairkee Sh. H., Gilbert M.W. Production of factors required

for cell attachement and spreading is a constitutive property

in mouse A9 cells // J. Cell. Physiol.– 1979.– Vol. 99, N3.–

P. 319–326.

Folkman J., Moscona A. Role of cell shape in growth control //

Nature.– 1978.– Vol. 273, N5661.– P. 345–349.

Kane O., George E., Offner M. et al. Nine days post-thawing

red cell conservation in a synthetic medium. Biochemical

studies // Transfusion.– 1986.– Vol. 26, N5.– P. 437–440.

Liang Y., Besch-Williford C., Benakanakere I. et al. Re-acti-

vation of the p53 pathway inhibits in vivo and in vitro growth

of of hormone-dependent human breast cancer cells // Int. J.

Oncol.– 2007.– Vol. 31, N4.– P. 777–784.

Montgomery A.M.P., Reisfeld R.A., Cheresh D.A. Integrin α v

β3 rescues melanoma cells from apoptosis in a three-di-

mensional dermal collagen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.–

1994.– Vol. 91, N19.– P. 8856–8860.

Поступила 26.05.2009

Рецензент Е.И. Гончарук

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

406

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:

ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38

057) 373-41-35, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта:

cryo@online.kharkov.ua

* To whom correspondence should be addressed: 23,

Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373

4135, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-

tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine

Институт проблем криобиологии и криомедицины

НАН Украины, г. Харьков

УДК 57.043:547.422:612.111:577.352.462

Д.И. АЛЕКСАНДРОВА, Н.В. ОРЛОВА, Н.М. ШПАКОВА*

Исходное состояние эритроцитов – фактор, определяющий

их чувствительность к гипертоническому стрессу.

Роль ПЭО-1500 и температуры

UDC 57.043:547.422:612.111:577.352.462

D.I. ALEKSANDROVA, N.V. ORLOVA, N.M. SHPAKOVA*

Initial State of Erythrocytes as Factor, Determining

Their Sensibility to Hypertonic Stress.

Role of PEO-1500 and Temperature

Исследовали влияние ПЭО-1500 на устойчивость эритроцитов человека, быка и лошади к гипертоническому шоку (4,0 М

NaCl) при 37 и 0°С. Показали, что снижение объема эритроцитов млекопитающих при увеличении концентрации растворов

ПЭО-1500 сопровождается повышением устойчивости клеток к действию гипертонического шока при 37 и 0°С.

Ключевые слова: эритроциты млекопитающих, ПЭО-1500, гипертонический шок, гематокрит, осмолярность среды.

Досліджували вплив ПЕО-1500 на стійкість еритроцитів людини, бика і коня до гіпертонічного шоку (4,0 М NaСl) при 37

і 0°С. Показали, що зниження об’єму еритроцитів ссавців при збільшенні концентрації розчинів ПЕО-1500 супроводжується

підвищенням стійкості клітин до дії гіпертонічного шоку при 37 і 0°С.

Ключові слова: еритроцити ссавців, ПЕО-1500, гіпертонічний шок, гематокрит, осмолярність середовища.

The effect of PEO-1500 on resistance of human, bovine and equine erythrocytes to hypertonic shock (4.0 M NaCl) under 37 and

0°C was studied. It has been shown that decrease of mammalian erythrocyte volume with PEO-1500 concentration increase is

accompanied by rise in cell resistance to the activity of hypertonic shock under 37 and 0°C.

Key words: mammalian erythrocytes, PEO-1500, hypertonic shock, hematocrit, medium osmolarity.

Для криоконсервирования клеток, тканей и

органов используют непроникающие криопротек-

торы: полиэтиленоксиды (ПЭО), фиколл, сахарозу,

трегалозу, декстраны, оксиэтилированный крахмал

[13, 15]. Применение непроникающих криопро-

текторов связано с трудностями выбора условий

эквилибрации (температуры, скорости введения

криопротектора, его концентрации) [11, 14, 16].

Изучение процессов, происходящих при введении

и удалении криопротектора, имеет важное значение

для криоконсервирования клеток, органов и тканей.

Несмотря на многочисленные работы по криокон-

сервированию различных объектов [3, 5, 8], ус-

ловия для введения криопротекторов часто под-

бирают интуитивно. В [2, 4, 11] отмечены целе-

сообразность применения ПЭО-1500 в качестве

криоконсерванта для эритроцитов млекопитающих

и видовые различия их сохранности при замора-

живании в зависимости от условий предвари-

тельной эквилибрации клеток с криопротектором.

Цель работы – исследовать влияние непрони-

кающего криопротектора ПЭО-1500 на чувстви-

тельность эритроцитов разных видов млекопи-

For cryopreservation of cells, tissues and organs

the non-penetrating cryoprotectants such as: polyethy-

lene oxides (PEO), ficoll, sucrose, trehalose, dextrans

and hydroxyethyl starch [13, 15] have been used. Appli-

cation of non-penetrating cryoprotectant is associated

with the difficulties of equilibration conditions selection

as: temperature, cryoprotectant introduction rate and

its concentration [11, 14, 16]. Study of processes, taking

place during introduction and removal of cryoprotectant

has an important role for cell, organ and tissue cryopre-

servation. In spite of multiple works for cryopreser-

vation of different objects [3, 5, 8] the conditions for

cryoprotectant introduction are often tentatively selec-

ted. In the works [2, 4, 11] the applicability of PEO-

1500 as cryopreservative for mammalian erythrocytes

and species differences of their integrity during freezing

depending on the conditions of preliminary cell equilib-

ration with cryoprotectant were noted.

The research aim was to study the effect of PEO-

1500 non-penetrating cryoprotectant on erythrocyte

sensibility of different mammalian species (human,

bovine and equine) to the activity of 4.0 M NaCl under

37 and 0°C.

407

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

тающих (человека, быка и лошади) к действию

4,0 М NaCl при 37 и 0°С.

Материалы и методы

Эритроциты получали из донорской крови чело-

века, быка и лошади, заготовленной на глюгици-

ровом консерванте. После удаления плазмы эрит-

ромассу дважды отмывали центрифугированием

при 1500 g в течение 3 мин в 10-кратном объеме

физиологического раствора (0,15 М NaCl, 0,01 М

фосфатный буфер, pH 7,4) и хранили в виде плот-

ного осадка не более 2 ч при температуре 0°С. Все

используемые в работе среды готовили на 0,01 М

фосфатном буфере, pH 7,4. Концентрацию раст-

воров контролировали измерением осмолярности

на осмометре ОМКА 1Ц–01 (Украина).

Эритроциты млекопитающих инкубировали в 5–

20%-х растворах ПЭО-1500, приготовленных на

физиологическом растворе при 37 или 0°С (2 мин),

затем переносили на 5 мин в 4,0 М NaCl при соот-

ветствующих температурах (гематокрит 0,4 %).

Количество гемоглобина в супернатанте определя-

ли спектрофотометрически (λ = 543 нм) и выража-

ли в процентах по отношению к 100%-му гемолизу

эритроцитов в присутствии тритона Х-100 (0,1%).

Изменение объема эритроцитов в растворах

ПЭО-1500 определяли микрогематокритным мето-

дом. В работе использовали реактивы отечест-

венного производства квалификации “х. ч.” и

“ч. д. а”. Исследовали кровь 6 доноров в 2-х парал-

лельных пробах. Результаты анализировали с

помощью тестов Mann-Whitney и ANOVA.

Результаты и обсуждение

На рисунке (кривая 2) представлены результаты

исследования влияния разных концентраций ПЭО-

1500 на уровень гемолиза эритроцитов различных

видов млекопитающих в гипертоническом раство-

ре NaCl (4,0 М).

Следует отметить, что уровень гипертоничес-

кого повреждения в 4,0 М NaCl эритроцитов че-

ловека, лошади и быка при 37°С составляет 84, 48

и 75% соответственно. При низкой температуре

показатели гипертонического повреждения клеток

снижаются, что особенно выражено для эритро-

цитов лошади и быка, уровни гипертонического

гемолиза которых составляют около 20%.

Для эритроцитов человека (рисунок а, кривая 2)

при 37°С наблюдается ярко выраженная зави-

симость гипертонического гемолиза от концент-

рации ПЭО-1500. Минимальный уровень гемолиза

эритроцитов человека в среде, содержащей 4,0 М

NaCl, отмечается после обработки клеток 20%-м

ПЭО-1500. При 0°С характер концентрационной

зависимости гипертонического гемолиза эритро-

Materials and methods

Erythrocytes were derived from human, bovine and

equine donor blood, procured with glygicir preservative.

After plasma removal the erythromass was twice

washed out by centrifugation at 1500 g for 3 min in a

10-fold volume of physiological solution (0.15 M NaCl,

0.01 M phosphate buffer, pH 7.4) and stored as a dense

sediment for less than 2 hrs under 0°C. All the media

used in the work were prepared with 0.01 M phosphate

buffer, pH 7.4. Solution concentration was controlled

by osmolarity measuring with OMKA 1C-01 (Ukraine).

Mammalian erythrocytes were incubated in 5–20%

PEO-1500 solutions, prepared with physiological solu-

tion under 37 or 0°C (2 min), later removed for 5 min

into 4.0 M NaCl under corresponding temperatures

(0.4% hematocrit). Hemoglobin number in supernatant

was spectrophotometrically determined (λ = 543 nm)

and expressed in percentage relative to 100% hemolysis

of erythrocytes in the presence of X-100 triton (0.1%).

Changes of erythrocyte volume in PEO-1500

solutions were determined by microhematocrit method.

Nationally produced reagents of “chemically pure” and

“pure for analysis” grades were used in the work. Blood

of 6 donors in 2 parallel samples has been studied.

The results were processed with Mann-Whitney and

ANOVA tests.

Results and discussion

In the Figure (curve 2) the research results of

different PEO-1500 concentrations effect on erythro-

cyte hemolysis level of various species of mammals in

NaCl hypertonic solution (4.0 M) were shown.

It should be noted that the level of hypertonic

damage in 4.0 M NaCl of human, equine and bovine

erythrocytes under 37°C makes 84, 48 and 75%, accor-

dingly. Under low temperature the indices of hypertonic

damage decreased, that was especially expressed for

equine and bovine erythrocytes, which hypertonic

hemolysis levels made about to 20%.

For human erythrocytes (Fig. a, curve 2) under

37°C the strongly expressed dependence of hypertonic

hemolysis from PEO-1500 concentration is observed.

Minimal level of human erythrocyte hemolysis in the

medium, containing 4.0 M NaCl is observed after cell

treatment with 20% PEO-1500. At 0°C the character

of concentration dependence of human erythrocyte

hypertonic hemolysis changes. When using 5% PEO-

1500 there is observed a sharp reduction of cell damage,

achieving the minimal value under 10% PEO-1500 and

then does not practically change.

For bovine erythrocytes (Fig. c, curve 2) the depen-

dence of hypertonic hemolysis under 37 and 0°C is

similar to the ones, obtained for human erythrocytes

under corresponding temperatures. However under

maximally used PEO-1500 concentration the hyper-

408

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

100

0 5 10 15 20

100

0 5 10 15 20

100

0 5 10 15 20

100

0 5 10 15 20

100

0 5 10 15 20

100

0 5 10 15 20

100

Влияние ПЭО-1500 на изменение гематокрита (1) и гемолитическое повреждение (2) эритроцитов человека (а),

лошади (б) и быка (в) при последующем перенесении их в 4,0 М NaCl при температуре 37 и 0°C: * – достоверно в

сравнении с контрольными эритроцитами, p < 0,05; # – достоверно в сравнении с контрольными эритроцитами,

p < 0,05.

Effect of PEO-1500 on hematocrit change (1) and hemolytic damage (2) of human (a), equine (b) and bovine (c) erythrocytes

during their following transfer into 4.0 M NaCl under 37 and 0°C: * – statistically significant if compared with the control

erythrocytes, p < 0.05; # – statistically significant if compared with the control erythrocytes, p < 0.05.

Гемолиз, %

Hemolysis, %

Гемолиз, %

Hemolysis, %

Гематокрит, %

Hematocrit, %

Гематокрит, %

Hematocrit, %

Гемолиз, %

Hemolysis, %

Гемолиз, %

Hemolysis, %

Гематокрит, %

Hematocrit, %

Гематокрит, %

Hematocrit, %

Гематокрит, %

Hematocrit, %

Гемолиз, %

Hemolysis, %

Гемолиз, %

Hemolysis, %

Гематокрит, %

Hematocrit, %

а a

б b

ПЭО-1500, % PEO-1500, % ПЭО-1500, % PEO-1500, %

в c

ПЭО-1500, % PEO-1500, % ПЭО-1500, % PEO-1500, %

цитов человека изменяется. При использовании

ПЭО-1500 в концентрации 5% наблюдается резкое

снижение повреждения клеток, которое достигает

минимального значения при 10%-м ПЭО-1500 и

затем практически не изменяется.

tonic hemolysis level of bovine cells under 37°C is

lower, versus human erythrocytes. In spite of initially

low level of bovine erythrocyte hypertonic hemolysis

under 0°C (about to 20%), previous treatment of PEO-

1500 cells enables to reduce their damage.

°°

°C

°°

°C

°°

°C

°°

°C

°°

°C

°°

°C

409

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

Для эритроцитов быка (рисунок в, кривая 2) за-

висимость гипертонического гемолиза при 37 и 0°С

аналогична зависимостям, полученным для эрит-

роцитов человека при соответствующих темпе-

ратурах. Однако при максимально используемой

концентрации ПЭО-1500 уровень гипертонического

гемолиза клеток быка при 37°С ниже, чем для

эритроцитов человека. Несмотря на изначально

низкий уровень гипертонического гемолиза эритро-

цитов быка при 0°С (около 20%), предобработка

клеток ПЭО-1500 позволяет снизить их поврежде-

ние.

Для эритроцитов лошади (рисунок б, кривая 2)

при 37°С характер концентрационной зависимости

сохраняется, как для эритроцитов человека и быка,

а при 0°С в отличие от клеток других млекопита-

ющих не наблюдается снижения гипертонического

гемолиза при использовании криопротектора в низ-

кой концентрации (5%), а максимальное снижение

уровня гемолиза отмечено при 15–20% ПЭО-1500.

Обработка эритроцитов разных видов млекопи-

тающих 20%-м ПЭО-1500 приводит к снижению

уровня повреждения клеток при перенесении в 4,0 М

NaCl как при 37, так и 0°С. Следует отметить, что

для эритроцитов человека при обоих температур-

ных режимах гипертонический гемолиз составляет

около 26%. Для клеток животных уровень повреж-

дения зависит от температуры и составляет при

37°С для клеток быка и лошади 44 и 13%, а при

0°С – 9 и 3% соответственно.

В экспериментальных работах по заморажи-

ванию эритроцитов млекопитающих использовали

15% ПЭО-1500 [2, 4]. Эритроциты человека и быка

экспонировали с ПЭО-1500 при разных темпера-

турах (0 и 22°С), а затем подвергали быстрому

замораживанию до –196°С. Было показано, что

для эритроцитов человека [2] и быка [4] более

высокая сохранность клеток наблюдается в случае

введения криопротектора при околонулевой темпе-

ратуре. Эритроциты лошади после разморажи-

вания характеризуются очень низким уровнем

повреждения (<1%), поэтому влияние температуры

не отмечено [4].

Анализ полученных данных по гипертони-

ческому гемолизу эритроцитов млекопитающих

при использовании криопротектора в концентрации

15% (рисунок) согласуется с тем, что повреждение

клеток ниже, если криопротектор вводили в среду

при более низкой температуре (0°С). Для эритро-

цитов человека, быка и лошади уровень гемолиза

в присутствии 15 % ПЭО-1500 при 37°С составляет

36, 50 и 23%, а при 0°С – 28, 9 и 3% соответственно.

Следует отметить, что при использовании ПЭО-1500

в диапазоне высоких концентраций (15–20%) раз-

For equine erythrocytes (Fig. b, curve 2) under 37°C

the type of concentration dependence is preserved both

for human and bovine erythrocytes, and under 0°C in

contrast to the cells of other mammals the reduction

of hypertonic hemolysis is not observed when using

cryoprotectant low concentration of 5%, but maximal

decrease of hemolysis level is noted under 15–20%

PEO-1500.

The erythrocyte treatment of different species of

mammals with 20% PEO-1500 results in reduction of

cell damage level during removal into 4.0 M NaCl not

only under 37, but also 0°C. It should be noted that for

human erythrocytes under both temperature regimens

the hypertonic hemolysis makes nearly 26%. For

animal cells the damage level depends on temperature

and makes 44 and 13% under 37C for bovine and

equine cells, but under 0°C does 9 and 3%, accordingly.

In the experimental works for mammalian erythro-

cyte freezing 15% PEO-1500 was used [2, 4]. Human

and bovine erythrocytes were exposed to PEO-1500

under different temperatures (0 and 22°C), and then

were rapidly frozen down to –196°C. It has been

shown that for human [2] and bovine [4] erythrocytes

higher cell survival is observed in case of cryoprotectant

introduction at temperatures about zero. Equine eryth-

rocytes after freezing are characterized by very low

damage level (<1%), therefore the temperature effect

is not noted [4].

The analysis of the obtained data for hypertonic

hemolysis of mammalian erythrocytes when using 15%

cryoprotectant (Figure) consistent with that cell damage

is lower, if cryoprotectant was introduced into the

medium under lower temperature (0°C). For human,

bovine and equine erythrocytes the hemolysis level in

the presence of 15% PEO-1500 under 37°C makes

36, 50 and 23%, but under 0°C is 28, 9 and 3%,

accordingly. It should be noted that when using PEO-

100 within the range of high concentrations (15-20%)

the dependencies at the level of erythrocyte hypertonic

hemolysis under 37 and 0°C are the lower, the higher

is cryoprotectant concentration.

PEO-1500 is a polymer compound, the molecules

of which are not able to get through erythrocyte memb-

ranes [7]. During cryopreservation of biological mate-

rial its protective effect is connected with ability to

remove water from cell, thereby preventing a process

of intracellular crystallization. The change of volume

characteristics of mammalian erythrocytes in the

presence of different concentrations of PEO-1500

cryoprotectant under 37 and 0°C was studied.

In the Figure (curve 1) the results of volume change

of human, equine and bovine erythrocytes in PEO-

1500 solutions under 37 and 0°C were shown. It is

seen that with increase of PEO-1500 concentration in

410

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

личия в уровне гипертонического гемолиза эритро-

цитов при 37 и 0°С тем меньше, чем выше концент-

рация криопротектора.

ПЭО-1500 является полимерным соединением,

молекулы которого не способны проходить через

эритроцитарные мембраны [7]. Его защитный

эффект при криоконсервировании биологического

материала связан со способностью удалять воду

из клетки, тем самым предотвращая процесс внут-

риклеточной кристаллизации. Исследовали из-

менение объемных характеристик эритроцитов

млекопитающих в присутствии разных концент-

раций криопротектора ПЭО-1500 при 37 и 0°С.

На рисунке (кривая 1) представлены результаты

по изменению объема эритроцитов человека, ло-

шади и быка в растворах ПЭО-1500 при 37 и 0°С.

Видно, что по мере увеличения концентрации

ПЭО-1500 в среде объем эритроцитов млекопита-

ющих снижается и достигает минимальных

значений при 20% ПЭО-1500.

Следует отметить, что уменьшение клеточного

объема эритроцитов млекопитающих в концентриро-

ванных растворах криопротектора (рисунок, кри-

вая 1) сопровождается снижением уровня гипертони-

ческого гемолиза клеток в 4,0 М NaCl (кривая 2).

Было показано [1], что при 37 и 0°С изменение

объема эритроцитов млекопитающих на этапе

предварительной инкубации в умеренно концент-

рированных солевых средах коррелирует со сни-

жением уровня гемолиза при последующем

перенесении этих клеток в среду, содержащую 4,0 М

NaCl. Для эритроцитов человека и лошади такой

средой предварительного обезвоживания является

раствор NaCl в концентрации 0,4 М, осмотическое

давление которого примерно соответствует

значению осмотического давления 20%-го раст-

вора ПЭО-1500, приготовленного на физиологи-

ческом растворе (850 мОсм/кг) [6, 17]. Таким

образом, независимо от качественного состава

среды, в которой происходит предварительное

обезвоживание клеток человека и лошади, наблю-

даются максимальное изменение клеточного

объема и минимальный уровень гипертонического

повреждения этих эритроцитов при перенесении в

4,0 М NaCl.

Максимально устойчивое состояние эритро-

цитов быка к действию 4,0 М NaCl наблюдается

после предварительного обезвоживания в среде,

содержащей NaCl в концентрации 1,0 М, что соот-

ветствует осмолярности примерно 2000 мОсм/кг

[1]. Подобную осмолярность растворы ПЭО-1500

имеют при использовании в такой концентрации,

которая не пригодна для работы с биологическими

объектами. Высокие концентрации ПЭО-1500

могут вызывать агрегацию эритроцитов, образова-

medium the mammalian erythrocyte volume reduces

and achieves minimal values under 20% PEO-1500.

It should be noted that reduction of cell volume of

mammalian erythrocytes in concentration solutions of

cryoprotectant (Figure, curve 1) is accompanied with

decreasing level of cell hypertonic hemolysis in 4.0 M

NaCl (curve 2).

It has been shown [1] that under 37 and 0°C the

change of mammalian erythrocyte volume at the stage

of preliminary incubation in moderate concentration

salt media correlates with decrease of hemolysis level

at following transfer of these cells into the medium,

containing 4.0 M NaCl. For human and equine

erythrocytes this medium of preliminary dehydration

is NaCl solution of 0.4 M concentration, which osmotic

pressure approximately corresponds to the value of

osmotic pressure of 20% PEO-1500 solution, prepared

with physiological solution (850 mOsm/kg) [6, 17].

Thus, independently on qualitative composition of the

medium, wherein preliminary dehydration of human

and equine cells occurs, there are observed maximal

change of cell volume and minimal level of hypertonic

damage of these erythrocytes being removed into 4.0 M

NaCl.

Maximally resistant state of bovine erythrocytes to

4.0 M NaCl effect is observed after preliminary dehyd-

ration in the medium, containing 1.0 M NaCl, that

corresponds to osmolarity approximately 2000 mOsm/kg

[1]. PEO-1500 solutions have equal osmolarity when

using this concentration, which is unsuitable for work

with biological objects. High concentrations of PEO-

1500 may trigger erythrocyte aggregation, formation

of pores in erythrocyte membranes, distribution of polar

and hydrophobic membrane components, stabilizing lipid

levels [16, 18].

It should be noted that when using non-penetrating

cryoprotectant PEO-1500 (20%) the decrease of cell

volume and level of bovine erythrocyte hypertonic

hemolysis in 4.0 M NaCl (Fig. c) is observed, however

those minimal values of cell volume and level of

hypertonic damage of the cells, derived when using as

1.0 M NaCl dehydration media, are not managed to

be achieved.

Mammalian erythrocytes used in the work are dif-

fered for dominant intracellular cation. Human and

equine erythrocytes have K

cations, but bovine has

ones. In addition, these cells are differed by compo-

sition of intracellular water [9]. The feature of cyto-

skeletal-membrane complex of the studied erythrocytes

is an absence in equine erythrocytes of 4.2 M protein,

which are classified as anchorage proteins, binding

integral proteins with cytoskeletal complex [10]. Bovine

erythrocyte membranes in contrary to human and

equine ones are enriched with sphingomyelin and are

characterized by a high cholesterol content [12].