Журнал - Проблемы криобиологии 2009 №4

Подождите немного. Документ загружается.

391

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

Таблица 3. Зависимость сохранности спермиев птиц до замораживания от времени инкубации

со смесью криопротекторов при 20°С (n = 6)

Table 3. Dependency of poultry spermatozoa integrity on incubation time

with cryoprotectant mixture at 20°C (n = 6)

functional protein groups, capability for electrostatic

and hydrophobic interactions). Of importance are the

mechanism and rate of cryoprotectant permeability

through a membrane, differing between the substances

of various chemical classes (amides, diols) within one

class.

In the Tables 3 and 4 there are summarised the

results of study of fowl and turkey spermatozoa motility

in time, their number with morphological damages under

the effect of cryoprotectant mixtures (diol+amide,

Примечание: Соотношение веществ в двойных смесях 1:1, в тройной – 1: 1: 0,5. Общая концентрация 1 М.

Notes: Substance ratio in double mixtures is 1:1, and 1:1:0.5 in triple ones. Total concentration made 1M.

после предварительного хранения спермы птиц в

течение 4 ч при температуре 4°С. Несмотря на

это, со смесью ДМФА + ЭГ получены результаты,

сравнимые по уровню сохранности спермиев ин-

дюка, наблюдаемые в присутствии отдельных

криопротекторов, что позволяет считать перспек-

тивным использование указанной смеси при

криоконсервировании спермы индюка.

На сперме петуха изучено повреждающее

действие на клетки только трех комбинаций: ЭГ +

ьсемС

кеторпоирк -

ворот

foerutxiM

stnatcetorpoyrc

ним,ямервзереч)%(ьтсонживдоП

nim,emitni)%(ytilitoM

веимрепсовтсечилоK

имиксечиголофромс

%,имяинеджервоп

htiwaozotamrepsforebmuN

%,sredrosidlacigolohprom

510609021081042

ним03

nim03

ним06

nim06

mrepsyekruTакюднииимрепС

ьлортноK

lortnoC

4±094±584±574±073±063±057,0±2,418,0±7,51

ГЭ+АФ

GE+AF

5±075±564±064±053±041±510,2±0,924,2±3,43

ГЭ+АФМД

GE+AFMD

5±575±075±564±064±052±038,1±3,622,2±7,13

ГЭ+ЦАМД

GE+CAMD

6±066±555±054±043±032±518,3±6,730,4±0,04

2,1 - ГЭ+ДП

2,1 - GE+DP

5±575±074±064±063±542±034,2±1,437,2±6,83

3,2 - ГЭ+ДБ

3,2 - GE+DB

6±066±065±054±533±032±510,4±8,934,4±9,34

2,1 - АФ+ДП

2,1 - AF+DP

5±054±044±533±522±020 9,4±3,946,5±9,55

3,2 - АФ+ДБ

3,2 - AF+DB

7±076±066±554±043±520 0,4±6,047,4±5,74

3,2 - АФМД+ДБ

3,2 - AFMD+DB

6±066±554±043±032±021±011,4±4,149,4±0,94

3,2 - ЦАМД+ДБ

3,2 - CAMD+DB

5±054±043±033±522±510 6,5±3,650,6±1,06

2,1+ГЭ - +ДП

3,2 - ДБ

2,1+GE - +DP

3,2 - DB

7±566±555±544±043±032±026,4±5,640,5±2,05

mrepslwoFахутепиимрепС

ьлортноK

lortnoC

4±594±584±084±073±063±056,0±7,210,1±6,91

ГЭ+АФ

GE+AF

7±566±065±054±043±032±028,2±6,729,3±8,83

3,2 - АФ+ДБ

3,2 - AF+DB

6±555±054±044±532±020 9,3±0,938,4±1,84

3,2 - АФМД+ДБ

3,2 - AFMD+DB

5±075±564±063±543±532±021,2±8,923,2±4,23

392

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

Таблица 4. Зависимость сохранности спермиев птиц до замораживания от времени инкубации

со смесью криопротекторов при 4°С (n = 6)

Table 4. Dependency of poultry spermatozoa integrity on incubation time

with cryoprotectant mixture at 4°C (n = 6)

Примечание: Соотношение веществ в двойных смесях 1:1, в тройной – 1: 1: 0,5. Общая концентрация 1 М.

Notes: Substance ratio in double mixtures is 1:1, and 1:1:0.5 in triple ones. Total concentration made 1M.

ФА, 2,3-БД + ФА и 2,3-БД + ДМФА, так как цито-

токсичность и криозащитная активность смесей

на основе амид + диол детально исследованы [6,

8]. Получены удовлетворительные данные оплодо-

творяемости, выводимости и вывода молодняка

после осеменения кур деконсервированной спер-

мой. Из трех изученных смесей более высокую

подвижность и морфологическую сохранность

сперматозоидов петуха при принятых условиях

diol+diol) at 20 and 4°C. Higher integrity of turkey

spermatozoa was observed in the presence of three

mixtures: DMFA+EG, FA+EG and 1,2-PD+EG.

However it should be admitted, that no statistically

significant differences of viability indices of turkey

spermatozoa under protection of mixtures compared

to some cryoprotectants were revealed (Tables 1–4),

probably, due to harder conditions: after preliminary

storage of poultry spermatozoa within 4 hrs at 4°C. In

ьсемС

кеторпоирк -

ворот

foerutxiM

stnatcetorpoyrc

ним,ямервзереч)%(ьтсонживдоП

nim,emitni)%(ytilitoM

веимрепсовтсечилоK

имиксечиголофромс

%,имяинеджервоп

htiwaozotamrepsforebmuN

%,sredrosidlacigolohprom

510609021081042

ним03

nim03

ним06

nim06

mrepsyekruTакюднииимрепС

ьлортноK

lortnoC

5±094±584±084±073±062±546,0±2,117,0±5,31

ГЭ+АФ

GE+AF

5±075±075±564±553±542±027,1±7,421,2±0,03

ГЭ+АФМД

GE+AFMD

5±575±075±075±564±052±036,1±0,320,2±1,82

ГЭ+ЦАМД

GE+CAMD

7±076±066±555±054±042±021,3±7,032,3±4,23

2,1 - ГЭ+ДП

2,1 - GE+DP

5±575±075±564±064±052±031,2±6,922,2±5,13

3,2 - ГЭ+ДБ

3,2 - GE+DB

7±566±065±054±044±532±024,3±5,439,3±8,83

2,1 - АФ+ДП

2,1 - AF+DP

7±076±064±043±033±521±012,4±3,249,4±0,94

3,2 - АФ+ДБ

3,2 - AF+DB

8±577±564±044±533±031±018,3±7,733,4±1,34

3,2 - АФМД+ДБ

3,2 - AFMD+DB

7±566±066±064±043±522±519,3±9,830,4±2,04

3,2 - ЦАМД+ДБ

3,2 - CAMD+DB

6±066±555±543±032±021±017,4±1,743,5±2,35

2,1+ГЭ - +ДП

3,2 - ДБ

2,1+GE - +DP

3,2 - DB

7±076±065±054±043±032±510,4±7,936,4±4,64

mrepslwoFахутепиимрепС

ьлортноK

lortnoC

4±595±094±584±584±073±065,0±1,016,0±6,11

ГЭ+АФ

GE+AF

6±066±066±554±044±533±525,2±1,526,3±2,63

3,2 - АФ+ДБ

3,2 - AF+DB

6±065±055±544±533±032±024,3±0,433,4±2,34

3,2 - АФМД+ДБ

3,2 - AFMD+DB

6±085±575±564±053±532±028,1±3,621,2±4,92

393

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

spite of this fact, with DMFA+EG mixture there were

obtained the results, comparable by the level of turkey

spermatozoa integrity, observed in the presence of

some cryoprotectants, that enables considering to be

perspective the usage of the mentioned mixture for

turkey sperm cryopreservation.

In fowl sperm there was studied a damaging effect

on cells of only three combinations: EG+FA, 2,3-

BD+FA and 2,3-BD+DMFA, since the cytotoxicity and

cryoprotective activity of mixtures on the base of

amide+diol have been studied in details [6, 8]. Satis-

factory data of hatchability and hatching of young birds

after hen insemination with frozen-thawed sperm, were

obtained. From the three studied mixtures a higher

motility and morphological integrity of fowl spermato-

zoa under the accepted experimental conditions were

observed in the presence of 2,3-BD+DMFA.

Conclusions

The research performed demonstrated the turkey

spermatozoa to be more sensitive to the effect of

studied substances at a preparative stage to freezing,

compared to the fowl ones. Therefore the incubation

time for turkey spermatozoa should be reduced to the

minimum (not more than 15 min) with cryoprotectants

at positive temperatures (not higher than 4°C).

By the degree of negative effect increase of amides

and diols on fowl spermatozoa the studied substances

are placed in the series: DMFA > EG > DMAC >

1,2-PD > 2,3-BD > FA; as for turkey there is: EG >

DMFA > DMAC = 1,2-PD = FA > 2,3-BD.

The lowest cytotoxic effect on turkey and fowl

spermatozoa prior to freezing was observed in the

presence of DMFA + EG and DMFA + 2,3-BD mix-

tures, correspondingly, with 1 M total concentration

under 1:1 ratio.

Литература

Белоусов В.П., Панов М.Ю. Термодинамика водных

растворов неэлектролитов. – Л.: Химия, 1983. – 265 с.

Вайсбергер А., Проскауэр Э., Риддик Д., Тупс Э. Органи-

ческие растворители.– М.: Химия, 1968.– 1450 с.

Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании

клеток, мембран и липопротеинов.– М.: Наука,1989.–

277 с.

Дюбко Т. С., Егоров М. И., Линник Т. П. и др. Флуоресцент-

ные зонды для исследования сперматозоидов в криоза-

щитных средах // Цитология.– 2007.– Т. 49, №6.– С. 521–

526.

Карапетян Ю.А., Энчис В.Н. Физико-химические свойст-

ва электролитных неводных растворов.– М.: Химия,

1989.– 252 с.

Линник Т.П., Бизикина О.В. Цитотоксичность и криопро-

текторная активность диолов, амидов и их смесей при

криоконсервировании спермы петухов // Биофизика

живой клетки.– 2003.– Т. 7, №1.– С. 42–49.

Линник Т.П. Амиды алифатических кислот – эффектив-

ные криопротекторы. І. Физико-химические свойства

соединений ряда амидов // Пробл. криобиологии.– 1998.–

№3.– С. 21–28.

Ліннік Т.П. Фізико-хімічні фактори кріопошкоджень і

кріозахисту сперматозоїдів півнів у циклі низькотем-

пературного консервування: Автореф. дис. ... д-ра біол.

наук.– Харків, 2003.– 36 с.

Пичугин Ю.И., Новиков А.Н. Линник Т.П. Зависимость

цитотоксичности и криопротекторной активности диолов

от их структуры и физико-химических свойств. II.

Криоконсервирование спермы карпа // Сб. научных

трудов “Криоконсервирование клеток и тканей”.–

Харьков, 1989.– С. 15–28.

Fahy G. M., Lilley T. H., Lindsell H. et al.Cryoprotectant toxi-

city and cryoprotectant toxicity reduction: in search of

10.

эксперимента наблюдали в присутствии 2,3-БД +

ДМФА.

Выводы

Проведенные исследования показали, что

спермии индюка более чувствительны к действию

изученных веществ на этапе подготовки к замора-

живанию по сравнению со спермиями петуха. Поэ-

тому следует сократить до минимума время инку-

бации спермиев индюка (не более 15 мин) с

криопротекторами при положительных темпера-

турах (не выше 4°С).

По степени увеличения негативного действия

амидов и диолов на спермии петуха изученные

вещества расположились в ряд: ДМФА > ЭГ >

ДМАЦ > 1,2-ПД > 2,3-БД > ФА; на спермии

индюка: ЭГ > ДМФА > ДМАЦ = 1,2-ПД = ФА >

2,3-БД.

Наименьшее цитотоксическое действие на

спермии индюка до замораживания наблюдается

в присутствии смеси криопротекторов ДМФА + ЭГ,

на спермии петуха – ДМФА + 2,3-БД с общей

концентрацией 1М при соотношении веществ 1:1.

References

Belousov V.P., Panov M.Yu. Thermodynamics of non-electro-

lyte aqueous solutions.– Leningrad: Khimiya, 1983.– 265 p.

Waisberger A., Proskauer E., Riddik J., Tups E. Organic

solvents.- Moscow: Khimiya, 1968.– 1450p.

Dobretsov G.E. Fluorescent probes in studying cells, memb-

ranes and lipoproteins.– Moscow: Nauka, 1989.– 277 p.

Dyubko T.S. Egorov M.I. Linnik T.P. et al. Fluorescent probes

to study spermatozoa in cryoprotective media // Tsitologiya.–

2007.– Vol. 49, N6.– P. 521–526.

Karapetyan Yu.A., Enchis V.N. Physical and chemical proper-

ties of electrolyte non-aqueous solutions.– Moscow: Khimiya,

1989.– 252 p.

Linnik T.P., Bizikina O.V. Cytotoxicity and cryoprotective

activity of diols, amides and their mixtures under fowl sperm

cryopreservation // Biofizika Zhivoj Kletki.– 2003.– Vol. 7,

N1.– P. 42–49.

Linnik T.P. Amides of the aliphatic acids are effective

cryoprotectants. I. Physical-chemical properties of the

394

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

molecular mechanisms // Cryobiology. – 1990.– Vol. 27, N3.–

P. 247–268.

Hammerstedt R.N., Graham J. K. Cryopreservation of poultry

sperm: the enigma of glycerol // Cryobiology. – 1992. – Vol. 29,

N1.– P. 26-38.

Tselutin K., Narubina L., Mavrodina T., Tur B. Cryopreser-

vation of poultry semen // Brit. Poultry Sci.– 1995.– Vol. 36,

N5.– P. 805–811.

Watson P.F. Recent developments and concepts in the cryo-

preservation of spermatozoa and the assessment of their

post-thawing // Reprod. Fertil. Dev.– 1995.– Vol. 7, N6.– P. 871–

891.

Wishart G.J. The cryopreservation of germplasm in domestic

and non-domestic birds // Cryobanking the genetic resource /

Eds.: P.F. Watson and W.V. Holt.– London, 2001.– P.181–

200.

Поступила 10.11.2009

Рецензент М.П. Петрушко

11.

12.

13.

14.

compounds of amide series // Problems of Cryobiology.- 1998.-

N3.– P. 21–28.

Linnik T.P. Physical and chemical factors of cryodamages

and cryoprotection of fowl spermatozoa in low temperature

preservation cycle: Author’s abstract of thesis of doctor of

biol. sciences.– Kharkiv, 2003.– 36 p.

Pichugin Yu.I., Novikov A.N. Linnik T.P. Dependency of

cytotoxicity and cryoprotective activity of diols on their

structure and physical-chemical properties. II. Carp sperm

cryopreservation // Collection of Scientific Papers “Cell and

tissue cryopreservation”.-–Kharkov, 1989.– P. 15–28.

Fahy G. M., Lilley T. H., Lindsell H. et al.Cryoprotectant toxi-

city and cryoprotectant toxicity reduction: in search of

molecular mechanisms // Cryobiology. – 1990.– Vol. 27, N3.–

P. 247–268.

Hammerstedt R.N., Graham J. K. Cryopreservation of poultry

sperm: the enigma of glycerol // Cryobiology. – 1992. – Vol. 29,

N1.– P. 26-38.

Tselutin K., Narubina L., Mavrodina T., Tur B. Cryopreser-

vation of poultry semen // Brit. Poultry Sci.– 1995.– Vol. 36,

N5.– P. 805–811.

Watson P.F. Recent developments and concepts in the cryo-

preservation of spermatozoa and the assessment of their

post-thawing // Reprod. Fertil. Dev.– 1995.– Vol. 7, N6.– P. 871–

891.

Wishart G.J. The cryopreservation of germplasm in domestic

and non-domestic birds // Cryobanking the genetic resource /

Eds.: P.F. Watson and W.V. Holt.– London, 2001.– P.181–

200.

Accepted in 10.11.2009

10.

11.

12.

13.

14.

395

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:

ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:(+38

057) 373-41-35, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта:

cryo@online.kharkov.ua

* To whom correspondence should be addressed: 23,

Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373

4135, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-

tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine

Институт проблем криобиологии и криомедицины

НАН Украины, г. Харьков

УДК 615.361.018.5.013.8.014.41:611.013.395.085.23

А.К. ГУЛЕВСКИЙ*, А.В. ТРИФОНОВА, Т.Ф. ПЕТРЕНКО

Стимулирующее действие низкомолекулярной фракции

из кордовой крови на адгезию и пролиферацию культуры

фибробластов человека после криоконсервирования

UDC 615.361.018.5.013.8.014.41:611.013.395.085.23

A.K. GULEVSKY*, A.V. TRIFONOVA, T.F. PETRENKO

Stimulating Effect of Low-Molecular Fraction from Cord Blood

on Adhesion and Proliferation of Human Fibroblast Culture

After Cryopreservation

Изучено влияние фракции до 5 кДа, полученной из кордовой крови, на адгезивные и пролиферативные свойства диплоидной

культуры эмбриональных фибробластов человека. Показано, что указанная фракция не влияет на эффективность прикрепления

клеток, увеличивает скорость распластывания клеток на подложке и стимулирует пролиферацию как нативной культуры, так

и после ее криоконсервирования. Сделан вывод о стимулирующем влиянии фракции из кордовой крови на рост культуры

фибробластов человека, показано ее репаративное действие на нарушенный в результате криоконсервирования клеточный

метаболизм.

Ключевые слова: фракция до 5 кДа из кордовой крови, фибробласты человека, криоконсервирование, адгезия, пролиферация.

Вивчена дія фракції до 5 кДа, шо отримана з кордової крові, на адгезивні та проліферативні властивості диплоїдної

культури ембріональних фібробластів людини. Показано, що ця фракція не впливає на ефективність прикріплення клітин,

підвищуе швидкість розшаровування клітин на підложці та стимулює проліферацію як нативної культури, так і після

кріоконсервування. Зроблено висновок про стимулюючу дію фракції з кордової крові на ріст культури фібробластів людини,

показана її репаративна дія на порушений клітинний метаболізм після кріоконсервування.

Ключові слова: фракція до 5 кДа із кордової крові, фібробласти людини, кріоконсервування, адгезія, проліферація.

The effect of the fraction below 5 kDa, procured from cord blood, on adhesive and proliferative properties of human embryonic

fibroblast diploid culture was studied. The mentioned fraction was shown as not affecting the efficiency of cell attachment, increasing

the rate of cell flattening on substrate and stimulating proliferation of both native culture and after cryopreservation. There was

concluded about a stimulating effect of cord blood fraction on human fibroblast culture growth, with demonstrating its reparative effect

on a disordered cellular metabolism after cryopreservation.

Key words: cord blood fraction below 5 kDa, human fibroblasts, cryopreservation, adhesion, proliferation.

Перспективность применения фибробластов че-

ловека в медицине [7–9, 15] обуславливает необхо-

димость создания банков для долговременного хра-

нения, что требует разработки технологий криокон-

сервирования, а также поиска путей для быстрого

восстановления клеток после криоконсервирования

с сохранением морфофункциональных свойств.

Существующие подходы, которые обеспечи-

вают восстановление повреждений в клетках после

криоконсервирования, основаны на применении

мембранстабилизирующих веществ [3], повыше-

нии энергетики клетки путем внесения дополни-

тельных субстратов энергетического обмена [21],

добавлении различных ростостимулирующих ве-

ществ [19].

Известно, что кордовая кровь содержит уни-

кальный сбалансированный комплекс специфи-

ческих плацентарных факторов, которые опреде-

ляют рост и дифференцирование тканей плода,

The perspectiveness of applying human fibroblasts

in medicine [7–9, 15] stipulates the necessity in establi-

shing banks for long-term storage, requiring the design

of cryopreservation technologies, as well as the search

for ways of rapid cell recovery after cryopreservation

with preserving morphofunctional properties.

Current approaches, providing the recovery of da-

maged cells after cryopreservation, are based on ap-

plying the membrane-stabilising substances [3], in-

creasing the cell energetics via introducing the additio-

nal substrates of energetic metabolism [21], adding

different growth-stimulating substances [19].

Cord blood is known to contain a unique balanced

complex of specific placental factors, determining the

growth, differentiation of fetal tissues and regulating

its metabolism [4]. The inclusion of fraction with mole-

cular weight below 5 kDa, procured from cord blood,

into the growth media composition of different lines,

was shown to stimulate their proliferation [6, 16].

396

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

регулируют его метаболизм [4]. Показано, что

включение фракции с молекулярным весом до

5кДа, полученной из кордовой крови, в состав рос-

товых сред различных линий стимулирует их

пролиферацию [6, 16].

Цель работы – изучение способности фракции

до 5 кДа, полученной из кордовой крови, оказывать

восстанавливающее действие на клетки диплоид-

ной культуры человека после хранения в криобанке

при –196

С.

Материалы и методы

Исследования выполнены на диплоидной куль-

туре эмбриональных фибробластов человека (ФЧ)

[17] на 4–6 пассажах. Клетки культивировали по

общепринятой методике [11], их посевная концен-

трация составила 0,8–1,0×10

кл/мл.

Криоконсервирование ФЧ осуществляли по

программам, разработанным для перевиваемых

клеточных культур [11].

Низкомолекулярную фракцию кордовой крови

(ФКК) получали из кордовой крови крупного рога-

того скота по оригинальной технологии [6].

Фракцию в концентрации 5,6 мкл/мл [6] добав-

ляли в стандартную ростовую среду с 10% эмбрио-

нальной сыворотки (ЭС) крупного рогатого скота

и минимальным содержанием ЭС – 2%, которое

обеспечивало пролиферацию клеток и формирова-

ние монослоя.

Препаратом сравнения служил фармакологи-

ческий препарат “Aктовегин” (Nycomed, Австрия)

в аналогичной концентрации [13].

О морфофункциональном состоянии диплоидной

культуры судили по адгезивным свойствам и

пролиферативной активности. Эффективность при-

крепления определяли подсчетом неприкрепив-

шихся клеток через 24 ч после начала культивиро-

вания [18]. Для определения скорости распласты-

вания культуры подсчитывали клетки различной

степени распластанности на фиксированных

препаратах через 1,5; 3; 5 и 24 ч после посева. Пре-

параты фиксировали в растворе Буэна, окрашивали

гематоксилином Карачи и 1%-м раствором эозина

[14]. Пролиферативную активность определяли на

4-е сутки культивирования по отношению количест-

ва снятых клеток к количеству посеянных клеток

в 1 мл. Результат выражали c помощью коэффи-

циента пролиферации (К). Клетки подсчитывали в

камере Горяева общепринятым способом [10].

Статистическую обработку результатов прово-

дили с помощью программного пакета “Statgraphic

plus for Windows”, версии 2.1 с использованием

критерия Манна-Уитни.

Результаты и обсуждение

Адгезия клеток – энергозависимый процесс,

который осуществляется посредством молекул

The research aim was to study the capability of

the fraction below 5kDa, derived from cord blood, to

cause a recovering effect on human diploid culture

cells after storage at cryobank under –196°C.

Materials and methods

The research was accomplished in diploid culture

of embryonic human fibroblasts (HFs) [17] with 4-6

passages. Cells were cultured according to the stan-

dard technique [11] with 0.8–1.0×10

cells/ml inocu-

lating concentration.

The HFs were cryopreserved by the programs, de-

signed for recultured cell cultures [11].

Low-molecular fraction of cord blood (FCB) was

derived from the cattle cord blood according to the

original technique [6].

The fraction in 5.6 µl/ml concentration [6] was

added into the standard growth medium with 10% fetal

bovine serum (FBS) and the minimum 2% FBS con-

tent, providing the cell proliferation and monolayer

formation.

The pharmacological preparation Actovegin (Nyco-

med, Austria) in the similar concentration served as

the reference substance [13].

Morphofunctional state of diploid culture was judged

by adhesive properties and proliferative activity. The

attachment efficiency was determined by calculating

the unattached cells in 24 hrs after culturing beginning

[18]. In order to determine the rates of culture flatten-

ing we calculated the cells with different flattening rate

on the fixed preparations in 1.5; 3; 5 and 24 hrs after

inoculation. Preparations were fixed in the Bouen’s

solution, stained with Karachi hematoxylin and 1% eo-

sin solution [14]. Proliferative activity was determined

to the 4

culturing day in respect to the number of

removed cells to that of inoculated ones in 1 ml. The

result was expressed with the proliferation coefficient

(K). Cells were calculated in Goryaev chamber accord-

ing to the standard methods [10].

The results were statistically processed with the

“Statgraphic plus for Windows” software, 2.1 version

with Mann-Whitney criterion.

Results and discussion

Cell adhesion is the energy-dependent process,

realising by means of molecules of intercellular adhe-

sion, representing proteins on a plasmatic membrane.

These proteins mediate the cell interactions among

themselves and with extracellular matrix as well [2].

Under monolayer culturing this process may be repre-

sented as the successive stages, starting from cell

attachment to the substrate and finishing by their

flattening with getting a typical morphology.

In our experiments the attachment efficiency of

HFs native culture (Table) was established as not

dependent on ES concentration in growth medium and

making 59–61% of a number of inoculated cells.

397

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

межклеточной адгезии, представляющие собой

белки на плазматической мембране. Эти белки

опосредуют взаимодействия клеток между собой

и с внеклеточным матриксом [2]. В условиях моно-

слойного культивирования этот процесс можно

представить как последовательные этапы, начи-

нающиеся с прикрепления клеток к подложке и

завершающиеся их распластыванием с приобрете-

нием характерной морфологии.

В наших экспериментах было установлено, что

эффективность прикрепления нативной культуры

ФЧ (таблица) не зависит от концентрации ЭС в

ростовой среде и составляет 59–61% от количест-

ва посеянных клеток. Изучение влияния ФКК на

эффективность прикрепления ФЧ показало, что

количество прикрепленных клеток достоверно не

отличалось от их количества в соответствующих

контролях. “Актовегин” также не влиял на этот по-

казатель. Установлено, что процесс криоконсерви-

рования по выбранной программе не оказывал

влияния на эффективность прикрепления ФЧ по

сравнению с нативной культурой во всех образцах.

“Актовегин” и ФКК в культуре после криоконсерви-

рования также не влияли на этот показатель по

сравнению с контролем.

Известно, что распластанность клеток на под-

ложке влияет на запуск механизмов деления, цито-

скелетные перестройки, регуляцию экспрессии ге-

нов [12, 20]. В случае, когда положительные сигналы

от адгезивных белков не поступают, блокируется

не только вступление клеток в митотический цикл,

но и происходит активация апоптоза [22, 23]. Вы-

сказывается также предположение, что сущес-

твует зависимость между площадью распластан-

ной клетки и количеством контактирующих моле-

кул факторов роста, а также потребленных пита-

тельных веществ [1]. Таким образом, количес-

твенный учет прикрепившихся клеток было целе-

сообразно дополнить изучением скорости их рас-

пластывания, что является важным показателем

арутьлуK

erutluC

едерсвСЭеинажредоС

%,яинаворивитьлук

noitavitlucnitnetnocSE

%,muidem

ьлортноK

lortnoC

KKФиинелвабодирП

FBCfogniddA

иинелвабодирП

"анигевоткА"

"nigevotcA"fogniddA

яанвитаН

noN - nezorf

013±956,0±366,0±85

24±163,6±366±16

яаннаворивреснокоирK

nezorF - dewaht

012±162±363±95

23±261±954±46

Эффективность прикрепления ФЧ через 24 ч культивирования, % (n = 6)

Efficiency of HFs attachment in 24 hrs of culturing, % (n = 6)

Studying the FCB effect on the efficiency of HFs

attachment demonstrated the number of attached cells

as not statistically and significantly different from that

in the corresponding controls. Actovegin did not affect

this index either. Cryopreservation process according

to the selected program was established as not

affecting the HFs attachment efficiency, compared to

a native culture in all the samples. FCB and Actovegin

in culture after cryopreservation did not affect this index

either, compared to the control.

Cell flattening on a substrate is known to affect the

triggering of fission mechanisms, cytoskeletal rear-

rangements and gene expression regulation [12, 20].

In this case, when the positive signals from adhesive

proteins do not income, not only the cell entry into a

mitotic cycle is blocked, but there is occurred the apop-

tosis activation as well [22, 23]. There is a suggestion

about the existence of dependence between the

flattened cell area and a number of contacting mole-

cules of growth factors, as well as the taken nutritives

[1]. Thus, it was expedient to perform a quantitative

accounting of attached cells with studying their

flattening rate, being an important index for culture

physiological state and necessary for its further growth

forecasting.

When studying the FCB effect on flattening

processes it was established as not causing a significant

effect on a total number of flattened cells of native

culture, independently on ES content in growth medium

(Fig. 1). Calculation of all the cells, manifesting flat-

tening signs, but being at different stages (from initial

to final ones) demonstrated, that in a native culture

even in 1.5 hrs after inoculation in media with various

ERS content (2 and 10%) and FCB adding, a total

number of flattened cells made 96.8 ± 0.9 and 96.6 ±

0.5%, correspondingly. This index did not statistically

and significantly differ from that in FCB-free media.

No statistically significant differences in total number

of flattened cells within following 3; 5 and 24 hrs in

the samples with FCB adding and corresponding control

100

01,53 5 24

б b

398

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

физиологического состояния культуры и необхо-

димо для прогноза ее дальнейшего роста.

При изучении влияния ФКК на процессы

распластывания установлено, что она не оказывала

существенного воздействия на общее количество

распластанных клеток нативной культуры, незави-

симо от содержания ЭС в ростовой среде (рис. 1).

Подсчет всех клеток, проявляющих признаки рас-

пластывания, но находящихся на разных стадиях

(от начальных до конечных) показал, что в нативной

культуре уже через 1,5 ч после посева в средах с

различным содержанием ЭС (2 и 10%) и добавле-

нием ФКК общее количество распластанных

клеток составляло 96,8 ± 0,9 и 96,6 ± 0,5% соответ-

ственно. Данный показатель достоверно не отли-

чался от такового в средах без добавления ФКК.

Не было отмечено и достоверных различий обще-

го количества распластанных клеток в последую-

щие 3; 5 и 24 ч в образцах с добавлением ФКК и

соответствующем контроле. “Актовегин” также не

влиял на этот показатель.

Отмечено, что опытные образцы визуально

отличались от контрольных. Показано, что степень

распластанности ФЧ, которую мы определяли по

количеству клеток с характерной для фиброблас-

тов веретенообразной формой, имеет существен-

ные различия во всех изученных вариантах (рис. 1).

В начальные сроки исследования (1,5 и 3 ч)

количество веретенообразных клеток при культиви-

ровании в среде с 10% ЭС в 9 и 1,5 раза превышало

их количество в среде с 2% ЭС. К 5 часам наблю-

дения процесс распластывания клеток в среде, со-

держащей 2% ЭС, значительно активировался.

Количество веретенообразных клеток в среде с

2% ЭС превышало таковое в среде с 10% в 1,5 ра-

за. Однако через 24 ч роста культуры количество

клеток веретенообразной формы в среде, содержа-

щей 10% ЭС, было достоверно выше, чем в среде

с 2% ЭС.

ФКК при добавлении в среду, содержащую 10%

ЭС, оказывала достоверное стимулирующее дейст-

вие на количество веретенообразных клеток отно-

сительно контроля с 3-х часов роста культуры –

на 15,4%; через 5 ч – на 18% и 24 ч – на 13,6%.

Действие ФКК, стимулирующее распластыва-

ние ФЧ, при добавлении в среду с 2% ЭС проявля-

лось в более ранние сроки после посева. Количест-

во веретенообразных клеток достоверно превыша-

ло контроль через 1,5 ч роста культуры на 5,2%,

3 ч – на 20,2%; 5 ч – на 16,8% и 24 ч – на 18,4%.

Как можно видеть из рис. 1, после 3-х часов рос-

та культуры распластывание ФЧ при добавлении

ФКК в среды культивирования более выражено в

среде, содержащей 2% ЭС. Через 5 ч количество

веретенообразных клеток в этом варианте было в

1,3 раза больше, чем при добавлении ФКК в среду

100

01,53 524

were revealed. Actovegin did not affect this index

either.

The samples were observed as visually differing

from the control ones. The HFs flattening degree,

Рис. 1. Динамика распластывания нативной культуры

ФЧ при добавлении ФКК и “Актовегина” в среду культи-

вирования в присутствии 10% ЭС (а) и 2% ЭС (б) (n = 5).

Общее количество распластанных клеток: 1 – контроль,

– при добавлении “Актовегина”,  – при добавлении

ФКК. Количество веретенообразных клеток: 0– конт-

роль;  – при добавлении “Актовегина”;  – при добав-

лении ФКК. *,

– различия статистически достоверны

для варианта с добавлением ФКК и “Актовегина” по

сравнению с контролем соответственно (р < 0,05).

Fig. 1. Dynamics of HFs native culture flattening when

adding FCB and Actovegin into the culturing medium in

the presence of 10% ES (a) and 2% ES (b) (n=5). Total number

of flattened cells: 1 – the control, – under Actovegin

adding,  – under FCB adding. Number of spindle-shaped

cells: 0– the control,  – under Actovegin adding,  –

under FCB adding. *,

–- differences are statistically sig-

nificant for the variant with FCB and Actovegin adding,

compared to the control, correspondingly (p<0.05).

Время, ч Time, hr

Количество клеток, %

Cell part, %

Количество клеток, %

Cell part, %

Время, ч Time, hr

a a

399

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

с 10% ЭС. После 24 ч наблюдения достоверных от-

личий между этими вариантами установлено не было.

Влияние “Актовегина” на скорость распласты-

вания культуры ФЧ аналогично ФКК, но количество

веретенообразных клеток в первые часы роста

культуры было достоверно ниже. Стимулирующее

действие “Актовегина” достигло уровня ФКК

только к 24 ч роста культуры.

Таким образом, стимулирующее действие ФКК

на скорость распластывания нативной культуры

ФЧ проявляется уже в первые часы после посева.

Через 24 ч роста нативной культуры количество

веретенообразных клеток в образцах с добавле-

нием ФКК в среды культивирования, содержащие

10 и 2% ЭС, превышает аналогичный показатель

в соответствующих контролях. Возможно, это яв-

ляется признаком ускорения репарации незначи-

тельных повреждений клеток, возникающих при

пересеве.

На следующем этапе работы изучали влияние

криоконсервирования на скорость распластывания

культуры ФЧ. Установлено, что распластывание

на подложке деконсервированных клеток при их

последующем культивировании существенно

замедляется (рис. 2). Если в нативной культуре уже

через 1,5 ч после посева клеток практически все

прикрепившиеся клетки, независимо от содержания

ЭС в среде культивирования, проявляли признаки

распластывания (см. рис. 1), то после криоконсер-

вирования этот показатель в средах, содержащих

10 и 2% ЭС, составил 45,2 ± 1,8 и 56,6 ± 2,8% соот-

ветственно. В последующие сроки наблюдения (3

и 5 ч после посева) общее количество распластан-

ных клеток при культивировании ФЧ в среде с 2%

ЭС было больше, чем в среде, содержащей 10%

ЭС. Представленные данные свидетельствуют о

том, что распластывание деконсервированных

клеток в ранние сроки было более выражено при

культивировании ФЧ в среде, содержащей 2% ЭС.

Однако к 24 ч наблюдения этот показатель досто-

верно не отличался в обоих вариантах и составлял

92,4–94,2%.

Возможно, для протекания адгезивных процес-

сов, особенно на начальных этапах, в нативных и

деконсервированных культурах клеток достаточно

некоторого порогового количества факторов адге-

зии, содержащихся в сыворотки крови. Высокое

содержание в среде культивирования сывороточ-

ных антител и других высокомолекулярных белков,

напротив, тормозит начальные этапы распласты-

вания клеток на подложке.

Изучение скорости распластывания ФЧ после

криоконсервирования показало, что количество

веретенообразных клеток при культивировании в

среде, содержащей 10% ЭС, в течение 5 ч после

посева оставалось очень низким и составляло 2,8–

determined by the number of cells with a spindle shape,

typical for fibroblasts, was shown to have significant

differences in all the studied variants (Fig. 1).

In initial research terms (1.5 and 3 hrs) the number

of spindle-shaped cells during culturing in 10% ES-

containing medium exceeded in 9 and 1.5 times their

number in the medium with 2% ES. To the 5 hrs of

observation the process of cell flattening in the 2%

ES-containing medium significantly activated. The

number of spindle-shaped cells in the medium with 2%

ES exceeded in 1.5 times that in 10% medium. How-

ever 24 hrs after culture growth the number of spindle-

like cells in 10% ES-containing medium, was sta-

tistically and significantly higher, compared to the 2%

one.

FCB during adding into the medium with 10% ES,

caused a statically significant stimulating effect on a

number of spindle-like cells in respect to the control in

3, 5 and 24 hrs by 15.4; 18 and 13.6%, correspondingly.

The FCB effect, stimulating the HFs flattening,

when adding into the medium with 2% ES, manifested

in earlier terms after inoculation. The number of

spindle-like cells statistically and significantly exceeded

the control by 5.2, 20.2, 16.8 and 18.4% in 1.5, 3, 5

and 24 hrs of culture growth, correspondingly.

The Fig. 1 shows, that 3 hrs after culture growth

the HFs flattening under FCB adding in culturing media

is more manifested in the medium with 2% ES. The

number of spindle-like cells in this variant 5 hrs later

was 1.3 times higher, compared to FCB adding into

the medium with 10% ES. After 24 hrs of observation

no statistically significant differences between these

variants were established.

Actovegin effect on flattening rate of HFs culture

is similar to FCB, but the number of spindle-shaped

cells within the first hours of culture growth was

statistically and significantly lower. Stimulating effect

of Actovegin reached the FCB level only to 24 hrs of

culture growth.

Thus, a stimulating effect of FCB on the flattening

rate of HFs native culture is manifested even within

the first hours after inoculation. In 24 hrs of native

culture growth the number of spindle-like cells in the

samples with FCB adding into the culturing media,

containing 10 and 2% ES, exceeds the similar index in

the corresponding controls. Possibly, this is a feature

of accelerated reparation of insignificant cell damages,

occurring during reinoculation.

At the following research stage we studied the

cryopreservation effect on HFs culture flattening rate.

The flattening on a substrate of frozen-thawed cells

under their following culturing was established as

significantly slowed down (Fig. 2). If in a native culture

even 1.5 hrs after cell inoculation practically all the

attached cells, independently on ES content in culturing

medium, manifested the flattening signs (Fig. 1), after

400

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, №4

ПРОБЛЕМЫ

КРИОБИОЛОГИИ

Т. 19, 2009, №4

5,8%. Это свидетельствует о замедленности про-

цессов распластывания деконсервированных ФЧ

в среде, содержащей 10% ЭС (рис. 2). В эти сроки

наблюдения количество веретенообразных клеток

при культивировании в среде, содержащей 2% ЭС,

было достоверно выше, чем в среде с 10% ЭС: в

первые 1,5 ч после посева оно составило 13,4 ±

1,1%, а к 5 ч увеличилось до 37,4 ± 0,5%. К 24 ча-

сам культивирования ситуация изменилась: коли-

чество веретенообразных клеток в среде, содер-

жащей 10% ЭС, достигло 71,2 ± 1,5%, а в среде с

2% ЭС – 56,8 ± 0,9%.

Полученные результаты динамики распласты-

вания ФЧ на подложке свидетельствуют о том, что

сыворотка крови в среде культивирования важна

для протекании репаративных процессов в клетках

после криоконсервирования. Несмотря на большую

скорость распластывания ФЧ на начальных этапах

культивирования в среде, содержащей 2% ЭС, в

итоге была получена меньшая степень расплас-

танности клеток по сравнению с культивированием

в среде с 10% ЭС, что свидетельствует о недо-

статке сывороточных факторов адгезии.

Очевидно, что отсутствие характерных приз-

наков распластывания в течение первых суток пос-

ле посева отражает функциональные повреждения

клеток, полученные в процессе криоконсервиро-

вания, которые не были выявлены по прижизнен-

cryopreservation this index in the media, containing 10

and 2% ES, made 45.2 ± 1.8 and 56.6 ± 2.8%, corres-

pondingly. Within the following observation terms (3

and 5 hrs after inoculation), the total number of flattened

cells during HFs culturing in the medium with 2% ES

was higher, than in the 10% ES-containing one. The

presented data testify to the fact, that the flattening of

frozen-thawed cells in early terms was more manifested

under HFs culturing in the medium, containing 2% ES.

However to 24 hrs of observation this index did not

statistically and significantly differ in both variants and

made 92.4–94.2%.

Possibly, for adhesive process proceeding, especial-

ly at initial stages, in native and frozen-thawed cell

cultures, it is sufficient a certain threshold number of

adhesive factors, contained in blood serum. High con-

tent in culturing medium of serum antibodies and other

high-molecular proteins, conversely, inhibits the initial

stages of cell flattening in a substrate.

Studying the rate of HFs flattening after cryopreser-

vation demonstrated a number of spindle-shaped cells

during culturing in the medium, containing 10% ES, as

remaining very low within 5 hrs after inoculation and

making 2.8–5.8%. This testifies to the deceleration of

frozen-thawed HFs flattening processes in the medium,

containing 10% ES (Fig. 2). Within these observation

terms the number of spindle-shaped cells under cultu-

ring in the medium, containing 2% ES, was statistically

100

1,5 3 5 24

100

1,5 3 5 24

Рис. 2. Динамика распластывания культуры ФЧ после криоконсервирования при добавлении ФКК и “Актовегина”

в среду культивирования в присутствии 10% ЭС (а) и 2% ЭС (б) (n = 5). Общее количество распластанных клеток:

1 – контроль, – при добавлении “Актовегина”,  – при добавлении ФКК. Количество веретенообразных клеток:

0– контроль;  – при добавлении “Актовегина”;  – при добавлении ФКК. *,

– различия статистически достоверны

для варианта с добавлением ФКК и “Актовегина” по сравнению с контролем соответственно (р < 0,05).

Fig. 2. Dynamics of HFs culture flattening after cryopreservation when adding FCB and Actovegin into the culturing

medium in the presence of 10% ES (a) and 2% ES (b) (n=5). Total number of flattened cells: 1 – the control, – under

Actovegin adding,  – under FCB adding. Number of spindle-shaped cells: 0– the control,  – under Actovegin adding,

 – under FCB adding. *,

– differences are statistically significant for the variant with FCB and Actovegin adding,

compared to the control, correspondingly (p<0.05).

б b

Количество клеток, %

Cell part, %

Время, ч Time, hr

а a

Количество клеток, %

Cell part, %

Время, ч Time, hr