Журнал - Проблемы криобиологии 2009 №2

Подождите немного. Документ загружается.

159

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

20°С. Видимых морфологических изменений у

размороженных эмбрионов в сравнении с контроль-

ными группами не установлено, но отсутствовало

биение сердца.

Статистически значимые отличия в показа-

телях уровня гибели эмбрионов установлены после

6 ч инкубации (~ 20%) (p < 0,05). Через 14 ч инкуба-

ции после оттаивания во всех случаях (n = 5)

эмбрионы погибали (100%), что выражалось в

побелении эмбрионов, указывающее на некроти-

зацию тканевых структур (рис. 4).

Для эмбрионов морского карася на стадии раз-

вития, соответствующей началу биения сердца, ус-

тановлено, что с увеличением концентрации

криозащитной среды повышается процент витри-

фицированных эмбрионов [12]. При использовании

криозащитной среды, состоящей из 20,5% диме-

тилсульфоксида + 15,5% ацетамида + 10% пропи-

ленгликоля + 6% пропиленэтиленгликоля был

получен относительно высокий процент витрифици-

рованных эмбрионов (> 40%). Но уровень смерт-

ности резко возрастал с увеличением времени экви-

либрации (более 15 мин) в этой среде. После размо-

раживания все эмбрионы погибали. Они белели или

имели повреждения в виде разбухания, деструкту-

ризации оболочек и др.

При замораживании эмбрионов ложного пал-

туса в криозащитных средах с различными комби-

100

C1 C2 C3 C4 C5

Криозащитная среда

Cryoprotective medium

Витрифицированные эмбрионы, %

Vitrified embryos, %

Рис. 3. Витрификация эмбрионов после 30 мин эквилиб-

рации в 5 криозащитных средах. Статистически значимые

различия определены между группами, не имеющими

одинаковых символов (тест Тюки, р < 0,05, среднее ±

стандартная ошибка, n = 5).

Fig. 3. Embryo vitrification after 30 min equilibration in 5

cryoprotective media. Statistically significant differences

were determined between the groups without equal symbols

(Tukey’s test, p < 0.05, mean ± standard error, n = 5).

In our experiments the non-vitrified embryos were

white, suggesting the presence of inter- and intracellular

ice crystals in embryos or yolk sac.

It was established that the best medium with obser-

ved highest percentage of vitrified embryos was the

medium C4, consisting of 30% sucrose + 10% ethylene

glycol (EG) + 3% PEO-1500 and 20% 1,2-PD.

After vitrifying the embryos were immersed into

liquid nitrogen and preserved within 60 min, then

thawed in 40 ml Petri dishes with water at 22°C. Water

was thrice changed for cryoprotectant removing.

Further embryos were incubated at 20°C. No visible

morphological changes in frozen-thawed embryos

compared to the control groups were revealed, but heart

beating was absent.

Statistically significant differences in the indices of

embryo death level were found out 6 hrs later incu-

bation (20%) (p < 0.05). After 14 hrs incubation follo-

wing thawing in all the cases (n = 5) the embryos died

(100%), that was manifested in embryo whitening,

pointing to the tissue structure nectrotisation (Fig. 4).

For red sea bream embryos at the developmental

stage, corresponding to the heart beating onset, there

was established, that with an increase in cryoprotective

medium concentration the percentage of vitrified

embryos augmented [12]. When using cryoprotective

medium, comprising 20.5% dimethyl sufoxide +15.5%

acetamide + 10% propylene glycol + 6% propylene

ethylene glycol, quite a high percentage of vitrified

embryos (> 40%) was obtained. However the mortality

level sharply increased with a rise in equilibration time

(more than 15 min) in this medium. After freeze-

100

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Время инкубации, ч

Incubation duration, hrs

Выживаемость эмбрионов, %

Embryo survival, %

Рис. 4. Выживаемость эмбрионов вьюна после оттаи-

вания (n = 5), среднее ± стандартное отклонение: 0 –

n 1; – n 2;  – n 3;  – n 4; 1 – n 5.

Fig. 4. Loach embryo survival after thawing (n = 5), mean ±

standard deviation: 0 – n 1; – n 2;  – n 3;  – n 4; 1 – n 5.

160

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

нациями метанола, глицерина и пропиленгликоля

отмечался высокий процент витрификации (85–

95%) [9]. При этом был получен высокий показа-

тель уровня выживаемости эмбрионов (до 32%)

при оттаивании. Эмбрионы наблюдались в течение

90 ч, что составило время от момента оттаивания

до гибели последнего.

Однако в сообщении [13] указывается на недо-

статки этого метода. Повторный эксперимент,

проведенный при тех же условиях, показал низкий

уровень витрифицированных эмбрионов. При

дальнейшем охлаждении часть их белела, что

указывало на присутствие критического объема

кристаллической фазы, а при отогреве все эмб-

рионы белели.

При замораживании эмбрионов линя в указан-

ных криозащитных средах при тех же условиях (в

экспериментах использовано свыше 5000 эмбрио-

нов) [14] результаты соответствовали данным [13].

Это объяснялось тем, что эмбрионы пресноводных

рыб менее устойчивы к высоким концентрациям

криопротекторов, чем эмбрионы морских, которые

имеют природную резистентность к гипертоничес-

ким растворам [10, 26].

В работе [26] использовали криозащитные сре-

ды, состоящие из комбинаций метанола, пропан-

диола и этиленгликоля, в которых 0,92–2,13% эмб-

рионов желтой камбалы определены как морфо-

логически интактные в течение первого часа после

оттаивания, но они не развивались и затем все поги-

бали.

Таким образом, в нашей работе получен ус-

тойчивый высокий уровень витрифицирования

эмбрионов вьюна (91,3 ± 18,7%), что позволяет

говорить о необходимости продолжения исследова-

ний в данном направлении.

Мы предполагаем, что гибель эмбрионов после

отогрева была обусловлена различными причина-

ми. Во-первых, возможно существовали микропов-

реждения, вызванные криозащитными средами, и

дальнейшее охлаждение отрицательно сказы-

валось на компенсаторных реакциях [6, 8]. Во-

вторых, при охлаждении вероятно возникали

микроскопические центры кристаллизации, что

приводило к рекристаллизационным процессам,

вызывающим механические повреждения отдель-

ных клеток при оттаивании [18]. В-третьих,

повреждения мембранных структур были связа-

ны с индивидуальной чувствительностью биологи-

ческого объекта [5, 25] или были использованы

неоптимальные режимы оттаивания [7].

Âûâîäû

В результате проведенных исследований опре-

делена лучшая среда для витрифицирования эмб-

рионов вьюна на стадии пульсации сердца сос-

thawing all embryos died. They whitened and had

swelling-like damages, membrane destructurisation etc.

When freezing Japanese flounder’s embryos within

cryoprotective media with different combinations of

methanol, glycerol and propylene glycol there was ob-

served a high percentage of vitrification (85–95%) [9].

At the same time there was obtained a high index of

embryo survival level (up to 20%) during thawing. Emb-

ryos were observed during 90 hrs, that made the time

from the moment of thawing to the death of last one.

However this method’s disadvantages are reported

in the paper [13]. Repeated experiment, performed

under the same conditions showed a low level of

vitrified embryos. During following cooling a part of

them whitened, that pointed to the presence of critical

volume of crystal phase, but under thawing all embryos

whitened.

During freezing of common tench embryos in the

mentioned cryoprotective media under the same

conditions (over 5,000 embryos were used in the

experiments) [14], the results corresponded to the data,

reported in the paper [13]. This was explained by the

fact, that freshwater fish embryos were less resistant

to high concentrations of cryoprotectants, than those

of seawater ones, which had a natural resistance to

hypertonic solutions [10, 26].

In the paper [26] there were applied cryoprotective

media, consisting of methanol, propanediol and ethylene

glycol combinations, where 0.92–2.12% Alaska plaice

embryos were determined as morphologically intact

within the first hour after thawing, but they did not

develop and then all died.

Thus, in our research we obtained a stable high

rate (91.3 ± 18.7%) of vitrified loach embryos (despite

freshwater species), that enabled concluding about a

right way in studying fish embryo freezing.

We assume embryo death after thawing as stipu-

lated by different causes. First, microdamages of

chemical character, caused by cryoprotective media,

might occur and further cooling negatively affected

the compensatory reactions [6, 8]. Secondly, there was

a probable formation of microscopic centers of

crystallisation, resulting in recrystallisation micro-

processes, causing mechanical damages of single cells

during thawing [18]. Thirdly, the damages of membrane

structures were associated to an individual sensitivity

of biological object [5, 25] or non-optimal regimens of

thawing were used [7].

Conclusions

As a result of the research performed there was

determined the best medium for loach embryo

vitrification at heart beating stage, consisting of 30%

sucrose, 10% EG, 3% PEO-1500 and 20% 1,2-PD.

Freezing regimen, enabling to achieve 91.3 ± 18.7%

embryo vitrification was determined.

161

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

тоящая из 30% сахарозы, 10% ЭГ, 3% ПЭО-1500

и 20% 1,2-ПД.

Определен режим замораживания, позволяю-

щий достичь 91,3 ± 8,7% витрификации эмбрионов.

Установлено, что выживаемость эмбрионов в

криозащитных средах зависит от индивидуальных

особенностей особей, от которых были получены

клетки.

Литература

Костомарова А.А. Вьюн Misgurnus fossilis L. // Объекты

биологии развития.– М.: Наука, 1975.– C. 308–323.

Линник Т.П., Бизикина О.В. Криоконсервирование

спермы петухов. II. Криопротекторная активность

амидов и диолов // Пробл. криобиологии.– 2001.– №4.–

С. 43–51.

Миксон К.Б., Копейка Е.Ф., Ишков Г.С. Влияние компо-

нентов криозащитной среды на эмбрионы вьюна (Misgur-

nus fossilis, L.1758) // Ветеринарна медицина: Міжвідом-

чий тематичний збірник.– 2008.– Вип. 89.– С. 271–274.

Нейфах А.А. Использование метода радиоактивной

инактивации ядер для исследования их функций в

раннем развитии рыб // Журн. общей биол.– 1959.– №20.–

С. 202-213.

Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус А.М., Калугин Ю.В.

Криопротекторы.– Киев: Наук. думка, 1978.– 204 с.

Ahammad M.M., Bhattacharyya D., Banerjee R.D., Bandyo-

padhyay P.K. Toxicity of protectants to embryos of silver

carp (Hypophthalmichthys molitrix) after cold storage at

different storage time periods // Cell Preservation Technology.–

2004.– Vol. 2, N3.– P. 227–233.

Bart A.N. New approaches in cryopreservation of fish

embryos / Cryopreservation in Aquatic Species. The World

Aquaculture Society.– Louisiana: Baton Rouge, 2000.– P. 179–

187.

Cabrita E., Robles V., Chereguini O., Real M. et al. Toxicity

of different permeable and non-permeable cryoprotectants

on turbot embryos (Scophthalmus maximus) // Cryobiology.–

2002.– Vol. 45, N3.– P. 261.

Chen S.L., Tian Y.S. Cryopreservation of flounder (Para-

lichthys olivaceus) embryos by vitrification // Therioge-

nology.– 2004.– Vol. 63, N4.– P. 1207–1219.

Chen S.L. Progress and prospect of cryopreservation of

fish gametes and embryos // J. Fish China.– 2002.– Vol. 26,

N2.– P. 161–168.

Cryopreservation in aquatic species / Eds: T.R. Tiersch and

P.M. Mazik.– Baton Rouge: The World Aquaculture Society,

2000.– 441 p.

Ding F.H., Xiao Z.Z., Li J. Preliminary studies on the vitrification

of red sea bream (Pagrus major) embryos // Theriogenology.–

2007.– Vol. 68, N5.– P. 702–708.

Edashige K., Valdez D.M., Hara T. et al. Japanese flounder

(Paralichthys olivaceus) embryos are difficult to cryopre-

serve by vitrification // Cryobiology.– 2006.– Vol. 53, N1.–

P. 96–106.

El-Battawy K.A., Linhart O. Preleminary studies on

cryopreservation of common tench (Tinca tinca) embryos

(Work in progress) // Journal of Fisheries International.–

2008.– Vol. 3, N1.– P. 12–18.

Gwo J.C. Cryopreservation of eggs and embryos from aquatic

organisms / Cryopreservation in Aquatic Species. The World

Aquaculture Society.– Louisiana: Baton Rouge, 2000.– P. 211–

229.

Haga Y. On the subzero temperature preservation of fertilised

eggs of rainbow trout // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish.– 1982.–

Vol. 48, N11.– P. 1569–1572.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

Embryo survival in cryoprotective media was

established as dependent on individual peculiarities of

females.

References

Kostomarova A.A. Loach Misgurnus fossilis L. // Objects of

developmental biology.– Moscow: Nauka, 1975.– P. 308–323.

Linnik T.P., Bizikina O.V. Fowl sperm cryopreservation. II.

Amide and diol cryoprotective activity // Problems of Cryo-

biology.– 2001.– N4.– P. 43–51.

Mikson K.B., Kopeika E.F., Ishkov G.S. Effect of components

of cryoprotective media on loach embryos (Missgurnus

fossilis, L. 1758) // Veterinarnaya meditsina: Interdepartmental

Thematic Collection.– 2008.– Issue 89.– P. 271–274.

Neifakh A.A. Usage of method of radioactive inactivation of

nuclei for studying their function in early development of fish //

Zhurn. Obschey Biologii.– 1959.– N20.– P. 202–213.

Pushkar N.S., Shrago M.I., Belous A.M., Kalugin Yu.V.

Cryoprotectants.– Kiev: Nauk. dumka, 1978.– 204 p.

Ahammad M.M., Bhattacharyya D., Banerjee R.D., Bandyo-

padhyay P.K. Toxicity of protectants to embryos of silver

carp (Hypophthalmichthys molitrix) after cold storage at

different storage time periods // Cell Preservation Technology.–

2004.– Vol. 2, N3.– P. 227–233.

Bart A.N. New approaches in cryopreservation of fish

embryos / Cryopreservation in Aquatic Species. The World

Aquaculture Society.– Louisiana: Baton Rouge, 2000.– P. 179–

187.

Cabrita E., Robles V., Chereguini O., Real M. et al. Toxicity

of different permeable and non-permeable cryoprotectants

on turbot embryos (Scophthalmus maximus) // Cryobiology.–

2002.– Vol. 45, N3.– P. 261.

Chen S.L., Tian Y.S. Cryopreservation of flounder (Para-

lichthys olivaceus) embryos by vitrification // Therioge-

nology.– 2004.– Vol. 63, N4.– P. 1207–1219.

Chen S.L. Progress and prospect of cryopreservation of

fish gametes and embryos // J. Fish China.– 2002.– Vol. 26,

N2.– P. 161–168.

Cryopreservation in aquatic species / Eds: T.R. Tiersch and

P.M. Mazik.– Baton Rouge: The World Aquaculture Society,

2000.– 441 p.

Ding F.H., Xiao Z.Z., Li J. Preliminary studies on the vitrification

of red sea bream (Pagrus major) embryos // Theriogenology.–

2007.– Vol. 68, N5.– P. 702–708.

Edashige K., Valdez D.M., Hara T. et al. Japanese flounder

(Paralichthys olivaceus) embryos are difficult to cryopre-

serve by vitrification // Cryobiology.– 2006.– Vol. 53, N1.–

P. 96–106.

El-Battawy K.A., Linhart O. Preleminary studies on

cryopreservation of common tench (Tinca tinca) embryos

(Work in progress) // Journal of Fisheries International.–

2008.– Vol. 3, N1.– P. 12–18.

Gwo J.C. Cryopreservation of eggs and embryos from aquatic

organisms / Cryopreservation in Aquatic Species. The World

Aquaculture Society.– Louisiana: Baton Rouge, 2000.– P. 211–

229.

Haga Y. On the subzero temperature preservation of fertilised

eggs of rainbow trout // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish.– 1982.–

Vol. 48, N11.– P. 1569–1572.

Hagedorn M., Kleinhans F.W. Problems and prospects in

cryopreservation of fish embryos / Cryopreservation in

Aquatic Species. The World Aquaculture Society.– Louisiana:

Baton Rouge, 2000.– P. 161–178.

Hagedorn M., Peterson A., Mazur P., Kleinhans F.W. High

ice nucleation temperature of zebrafish embryos: slow–

freezing is not an option // Cryobiology.– 2004.– Vol. 49, N2.–

P. 181–189.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

162

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

Hagedorn M., Kleinhans F.W. Problems and prospects in

cryopreservation of fish embryos / Cryopreservation in

Aquatic Species. The World Aquaculture Society.– Louisiana:

Baton Rouge, 2000.– P. 161–178.

Hagedorn M., Peterson A., Mazur P., Kleinhans F.W. High

ice nucleation temperature of zebrafish embryos: slow–

freezing is not an option // Cryobiology.– 2004.– Vol. 49, N2.–

P. 181–189.

Hagedorn M., Kleinhans F.W., Wildt D.E. et al. Chilling

sensitivity and cryoprotectant permeability of dechorionated

zebrafish embryos, Brachydanio rerio // Cryobiology.– 1997.–

Vol. 34, N3.– P. 251–263.

Hagedorn M., Hsu E.W., Pilatus U. et al. Magnetic resonance

microscopy and spectroscopy reveal kinetics of cryoprotec-

tant permeation in a multicompartment biological system //

Proc. Natl. Acad. Sci. USA.– 1996.– Vol. 93, 15.– P. 7454–

7459.

Isaeva A., Zhang T., Rawson D.M. Studies sensitivity of

zebrafish (Danio rerio) oocytes // Cryobiology.– 2004.–

Vol. 49, N2.– P. 114–122.

Kopeika J., Kopeika E., Zhang T. et al. Effect of DNA repair

inhibitor (3-aminobenzamide) on genetic stability of loach

(Misgurnus fossilis) embryos derived from cryopreserved

sperm // Theriogenology.– 2004.– Vol. 69, N9.– P. 1661–1673.

Kuleshova L.L., MacFarlane D.R., Trounson A.O., Shaw J.M.

Sugar exert a major influence on the vitrification properties

of ethylene glycol-based solutions and have low toxity to

embryos and oocytes // Cryobiology.– 1999.– Vol. 38, N2.–

P. 119–130.

Liu K.C., Chou T.C., Lin H.D. Cryosurvival of goldfish embryo

after subzero freezing // Aquatic Living Resources.– 1993.–

Vol. 6, N3.– P. 63–66.

Meryman H.T. Osmotic stress as a mechanism of freezing

injury // Cryobiology.– 1971.– Vol. 8, N5.– P. 489–500.

Robles V., Cabrita E., Fletcher G.L. et al. Vitrification assays

with embryos from a cold tolerant sub-arctic fish species //

Teriogenology.– 2005.– Vol. 64, N7.– P. 1633–1646.

Robles V., Cabrita E., Real M. et al. Vitrification of turbot

embryos: preliminary assays // Cryobiology.– 2003.– Vol. 47,

N1.– P. 30–39.

Tian Y.S., Chen S.L., Yan A.S. et al. Studies on vitrification

method of sea perch (Lateolabrax japonicus) embryos //

Acta Zoologica Sinica.– 2003.– N49.– P. 843–850.

Zhang T.T. Cryopreservation of gametes and embryos of

aquatic species // Life in the Frozen State / Ed. by B. Fuller,

E. Benson, N. Lane.– Luton: CRC Press LLC, 2004.– P. 415–

436.

Zhang T.T., Rawson D.M. Feasibility studies on vitrification

of intact zebrafish (Brachydanio rerio) embryos // Cryobio-

logy.– 1996.– Vol. 33, N1.– P. 1–13.

Zhang T.T., Rawson D.M., Morris G.J. Cryopreservation of

pre-hatch embryos of zebrafish (Brachydanio rerio) // Aquatic

Living Resources– 1993.– Vol. 6, N2.– P. 145–153.

Zhang X.S., Zhao L., Hua T.C. et al. A study on the

cryopreservation of common carp (Cyprinus carpio) emb-

ryos // Cryo-Letters.– 1989.– Vol. 10.– Р. 271–278.

Поступила 19.05.2009

Рецензент И.Ф. Коваленко

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

Hagedorn M., Kleinhans F.W., Wildt D.E. et al. Chilling

sensitivity and cryoprotectant permeability of dechorionated

zebrafish embryos, Brachydanio rerio // Cryobiology.– 1997.–

Vol. 34, N3.– P. 251–263.

Hagedorn M., Hsu E.W., Pilatus U. et al. Magnetic resonance

microscopy and spectroscopy reveal kinetics of cryoprotec-

tant permeation in a multicompartment biological system //

Proc. Natl. Acad. Sci. USA.– 1996.– Vol. 93, N15.– P. 7454–

7459.

Isaeva A., Zhang T., Rawson D.M. Studies sensitivity of

zebrafish (Danio rerio) oocytes // Cryobiology.– 2004.–

Vol. 49, N2.– P. 114–122.

Kopeika J., Kopeika E., Zhang T. et al. Effect of DNA repair

inhibitor (3-aminobenzamide) on genetic stability of loach

(Misgurnus fossilis) embryos derived from cryopreserved

sperm // Theriogenology.– 2004.– Vol. 69, N9.– P. 1661–1673.

Kuleshova L.L., MacFarlane D.R., Trounson A.O., Shaw J.M.

Sugar exert a major influence on the vitrification properties

of ethylene glycol-based solutions and have low toxity to

embryos and oocytes // Cryobiology.– 1999.– Vol. 38, N2.–

P. 119–130.

Liu K.C., Chou T.C., Lin H.D. Cryosurvival of goldfish embryo

after subzero freezing // Aquatic Living Resources.– 1993.–

Vol. 6, N3.– P. 63–66.

Meryman H.T. Osmotic stress as a mechanism of freezing

injury // Cryobiology.– 1971.– Vol. 8, N5.– P. 489–500.

Robles V., Cabrita E., Fletcher G.L. et al. Vitrification assays

with embryos from a cold tolerant sub-arctic fish species //

Teriogenology.– 2005.– Vol. 64, N7.– P. 1633–1646.

Robles V., Cabrita E., Real M. et al. Vitrification of turbot

embryos: preliminary assays // Cryobiology.– 2003.– Vol. 47,

N1.– P. 30–39.

Tian Y.S., Chen S.L., Yan A.S. et al. Studies on vitrification

method of sea perch (Lateolabrax japonicus) embryos //

Acta Zoologica Sinica.– 2003.– N49.– P. 843–850.

Zhang T.T. Cryopreservation of gametes and embryos of

aquatic species // Life in the Frozen State / Ed. by B. Fuller, E.

Benson, N. Lane.– Luton: CRC Press LLC, 2004.– P. 415–

436.

Zhang T.T., Rawson D.M. Feasibility studies on vitrification

of intact zebrafish (Brachydanio rerio) embryos // Cryobio-

logy.– 1996.– Vol. 33, N1.– P. 1–13.

Zhang T.T., Rawson D.M., Morris G.J. Cryopreservation of

pre-hatch embryos of zebrafish (Brachydanio rerio) // Aquatic

Living Resources– 1993.– Vol. 6, N2.– P. 145–153.

Zhang X.S., Zhao L., Hua T.C. et al. A study on the

cryopreservation of common carp (Cyprinus carpio) emb-

ryos // Cryo-Letters.– 1989.– Vol. 10.– Р. 271–278.

Accepted in 19.05.2009

19.

20.

21.

22.

23.

24.

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

163

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

* Àâòîð, êîòîðîìó íåîáõîäèìî íàïðàâëÿòü êîððåñïîíäåíöèþ:

óë. Ïåðåÿñëàâñêàÿ, 23, ã. Õàðüêîâ, Óêðàèíà 61015; òåë.:+38

(057) 373-38-71, ôàêñ: +38 (057) 373-30-84, ýëåêòðîííàÿ ïî÷òà:

cryo@online.kharkov.ua

* To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavskaya

str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 3871, fax: +380 57

373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-

tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine

Èíñòèòóò ïðîáëåì êðèîáèîëîãèè è êðèîìåäèöèíû

ÍÀÍ Óêðàèíû, ã. Õàðüêîâ

УДК 536.6:547.422

À.Ô. ÒÎÄÐÈÍ*, Ë.È. ÏÎÏÈÂÍÅÍÊÎ, Ñ.Å. ÊÎÂÀËÅÍÊÎ

Òåïëîôèçè÷åñêèå ñâîéñòâà êðèîïðîòåêòîðîâ.

I. Òåìïåðàòóðà è òåïëîòà ïëàâëåíèÿ

UDC 536.6:547.422

A.F. TODRIN*, L.I. POPIVNENKO, S.YE. KOVALENKO

Thermophysical Properties of Cryoprotectants.

I. Temperature and Heat of Melting

Систематизированы данные разных литературных источников по температуре и теплоте плавления водных растворов ряда

криопротекторов. Получены эмпирические формулы для расчета температур плавления водных растворов 38 криопротекторов

в зависимости от их массовой концентрации, а также формулы для расчета скрытой теплоты плавления водных растворов 11

криопротекторов в зависимости от их массовой концентрации и для 3 криопротекторов и воды в зависимости от переохлаждения.

Ключевые слова: криопротектор, температура плавления, скрытая теплота плавления, эмпирические зависимости.

Систематизовано дані різних літературних джерел щодо температури і теплоти плавлення водних розчинів ряду

кріопротекторів. Отримано емпіричні формули для розрахунку температур плавлення водних розчинів 38 кріопротекторів

в залежності від їх масової концентрації, а також формули для розрахунку прихованої теплоти плавлення водних розчинів 11

кріопротекторів в залежності від їх масової концентрації та для 3 кріопротекторів і води в залежності від переохолодження.

Ключові слова: кріопротектор, температура плавлення, прихована теплота плавлення, емпіричні залежності.

The data from different literature sources about temperature and heat of melting for aqueous solutions of some cryoprotectants

were systematised. There were obtained the empirical formulae to calculate melting temperatures for aqueous solution of 38

cryoprotectants depending on their mass concentration, as well as the ones to calculate the latent heat of melting for aqueous solutions

of 11 cryoprotectants versus their mass concentration and for 3 cryoprotectants and water depending on overcooling.

Key-words: cryoprotectants, temperature of melting, latent heat of melting, empirical dependencies.

В настоящее время в доступной литературе

отсутствуют систематизированные данные о

физико-химических и теплофизических свойствах

криопротекторов. Имеющиеся данные разбросаны

по различным источникам, неполны и малочислен-

ны. К тому же даже для одного вида объекта

данные не всегда совпадают, и эти отличия бывают

весьма существенными. Очевидно, это связано с

методами исследований и с использованием ве-

ществ от разных производителей.

Одними из наиболее востребованных в криобио-

логии данных являются значения температуры и

теплоты плавления водных растворов криопротек-

торов. Однако даже для таких, казалось бы, изу-

ченных растворов, как водные растворы глицерина,

разброс данных достигает существенной величи-

ны, что затрудняет их использование, особенно в

теоретических исследованиях.

Цель работы – обобщение и систематизация

данных литературы на основе построения эмпири-

ческих формул для расчета значений температуры

и теплоты плавления водных растворов криопро-

текторов в зависимости от их концентрации.

In literature there are no systematised data about

physical, chemical and thermophysical properties of

cryoprotectants. The available data are spread over

various sources, they are not complete and not nume-

rous. However even for one type of object the data

are not always consistent, the differences occur to

be quite significant. This is evidently associated to

research methods and usage of substances from

different producers.

The values of temperature and heat of melting for

cryoprotective aqueous solutions are the most actual

in cryobiology. However, even for such seemingly

well studied solutions as glycerol aqueous ones, the

data spread achieves significant value, complicating

their usage, especially in theoretic studies.

The research was aimed to summarise and syste-

matise the literature data, based on building empirical

formulae to calculate values of temperature and heat

of melting for cryoprotective aqueous solutions depen-

ding on their concentration.

To systematise the available literature data for

each type of cryoprotectant we built graphs of values

of temperature and heat of melting for cryoprotective

164

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

Для систематизации имеющихся литературных

данных по каждому криопротектору построены

графики значений температуры и теплоты плавле-

ния водных растворов криопротекторов в зависи-

мости от их массовой концентрации. С помощью

регрессионного анализа получены аппроксимирую-

щие кривые, описываемые полиномами.

В данной работе приводятся коэффициенты

эмпирических зависимостей температур и теплот

плавления от концентрации тех водных растворов

криопротекторов, для которых имеется достаточ-

ное количество данных.

Температура плавления играет важную роль как

в теоретических исследованиях (как граничное

условие на границе раздела фаз при решении задач

теплообмена в процессе замораживания-плавления

объектов), так и в практической криобиологии.

В качестве примера приведем ряд графиков за-

висимостей температуры плавления от массовой

концентрации некоторых криопротекторов.

Фазовая диаграмма водных растворов глицери-

на, представленная на рис. 1, построена на основа-

нии данных, полученных из [4, 8, 11, 13, 16–18, 20,

25, 29, 33, 36, 37, 40, 42, 43, 45, 50, 57, 58, 63, 67, 69,

72, 76]. На левой ветви диаграммы разброс данных

по температуре плавления для одних и тех же кон-

центраций криопротектора доходит до 9, на пра-

вой – до 4,5°С.

-50

-40

-30

-20

-10

0 20406080100

Рис. 1. Зависимость температуры плавления водных раст-

воров глицерина от его массовой концентрации:  – дан-

ные для построения левой ветви диаграммы;  – данные

для построения правой ветви диаграммы;

– аппро-

ксимирующая кривая.

Fig. 1. Dependency of melting temperature of glycerol

aqueous solutions on its mass concentration:  – data for

plotting the right arm of diagram;

– approximation curve.

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0 10203040506070809010

Рис. 2. Зависимость температуры плавления водных

растворов этиленгликоля от его массовой концентрации.

Обозначения те же, что на рис. 1.

Fig. 2. Dependency of melting temperature of ethylene gly-

col aqueous solutions on its mass concentration. Legends

are the same as in Fig. 1.

aqueous solutions depending on their mass concen-

tration. Using regressive analysis there were obtained

the approximating curves, described by polynomials.

This paper shows the coefficients of empirical

dependencies of temperature and heat of melting on

the concentration of the aqueous solutions of cryo-

protectants, for those the number of data is sufficient.

Melting temperature plays an important role in both

theoretical research (as a boundary condition at inter-

face when solving the tasks of heat exchange during

freeze-melting of objects) and in practical cryobiology.

The series of graphs of melting temperature de-

pendencies on mass concentration of some cryopro-

tectants, are exemplified.

Phase diagram of glycerol aqueous solutions,

shown in Fig. 1, is built, basing on the data, obtained

from the papers [4, 8, 11, 13, 16–18, 20, 25, 29, 33,

36, 37, 40, 42, 43, 45, 50, 57, 58, 63, 67, 69, 72, 76]. In

left and right diagram branches the data spread on

melting temperature for the same concentrations of

cryoprotectant reaches 9 and 4.5°C, correspondingly.

Difference in melting temperature for similar

concentrations of ethylene glycol (Fig. 2) is more

significant both for left and right branches of phase

diagram [9, 10, 12, 15, 18, 27, 37, 44, 46, 57, 58, 63,

69, 73, 75, 76]. For left and right branches this

difference reaches 15÷18.5 and 6°C, correspondingly.

Of note is also the fact, that in various sources the

difference in melting temperature of pure ethylene

glycol gets 4°C.

Концентрация, масс. %

Concentration, mass %

Температура, °C

Temperature, °C

Концентрация, масс. %

Concentration, mass %

Температура, °C

Temperature, °C

165

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

Разница в температуре плавления для одинако-

вых концентраций этиленгликоля (рис. 2) является

более существенной как для левой, так и для

правой ветвей фазовой диаграммы [9, 10, 12, 15,

18, 27, 37, 44, 46, 57, 58, 63, 69, 73, 75, 76]. Для левой

ветви эта разница доходит до 15÷18,5°С, а для пра-

вой – до 6°С. Необходимо также отметить, что в

разных источниках разница в температуре плавле-

ния чистого этиленгликоля достигает 4°С.

На рис. 3 и 4 представлены данные по темпера-

туре плавления водных растворов диметилформа-

мида (ДМФА) и диметилсульфоксида (ДМСО)

соответственно. Для ДМФА данные получены из

[1, 14, 15, 18, 43, 63]; для ДМСО – из [16, 17, 20, 25,

33, 37, 43, 50, 58, 63, 69]. Разброс данных по темпе-

ратуре плавления для ДМФА доходит до 14÷35 и

10°С для левой и правой ветви соответственно, а

для ДМСО – до 10°С для обеих ветвей.

На рис. 5 и 6 приведены левые ветви диаграмм

плавления водных растворов 1,2-пропандиола

(1,2-ПД) и трегалозы. Правые ветви этих диаграмм

не построены из-за отсутствия соответствующих

данных в доступной литературе (имеются только

точки плавления чистых веществ: 1,2-ПД –

= 50÷60°C [10, 57, 68, 73]; дигидрат трегалозы –

= 91÷103°C; дегидратированная трегалоза –

= 203÷218°C [70]). Разброс данных по темпера-

туре плавления для 1,2-ПД меньше, чем для преды-

дущих веществ (до 5°С) [6, 10, 16, 17, 26, 29, 35, 37,

-120

-100

-80

-60

-40

-20

0 20406080100

Рис. 3. Зависимость температуры плавления водных

растворов ДМФА от его массовой концентрации. Обоз-

начения те же, что на рис. 1.

Fig. 3. Dependency of melting temperature of DMFA

aqueous solutions on its mass concentration. Legends are

the same as in Fig. 1.

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0 20406080100

Рис. 4. Зависимость температуры плавления водных

растворов ДМСО от его массовой концентрации.

Обозначения те же, что на рис. 1.

Fig. 4. Dependency of melting temperature of DMSO

aqueous solutions on its mass concentration. Legends are

the same as in Fig. 1.

Fig. 3 and 4 show the data on melting tempe-rature

of aqueous solutions of dimethyl formamide (DMFA)

and dimethyl sulfoxide (DMSO), corres-pondingly.

For DMFA and DMSO the data were obtained from

the papers [1, 14, 15, 18, 43, 63] and [16, 17, 20, 25,

33, 37, 43, 50, 58, 63, 69], corres-pondingly. Data

spread on melting temperature for DMFA reaches

14÷35 and 10°C for left and right branches,

correspondingly, and for DMSO it does 10°C for both

ones.

Fig. 5 and 6 demonstrate the left branches of

melting diagrams of 1,2-propanediol (1,2-PD) and

trehalose aqueous solutions. Right branches of these

diagrams are not built due to the absence of

corresponding data in available literature (there are

only melting points of pure substances: t

= 50÷60°C

for 1,2-PD [10, 57, 68, 73]; t

= 91÷103°C for

trehalose dihydrate; t

= 203÷218°C for dehydrated

trehalose [70]). Data spread on melting temperature

for 1,2-PD is less, than for previous substances (to

5°C) [6, 10, 16, 17, 26, 29, 35, 37, 46, 54, 57, 64, 65,

68, 73, 74]. For trehalose [16, 62, 69] the spread

achieves 5°C as well.

As demonstrated, under such differences in mel-

ting temperature for the same concentrations of cryo-

protectants it is complicated to tell which of the values

may be used as the information ones.

In addition to the mentioned above cryoprotec-

tants, we considered the following: hydroxyethyl

Концентрация, масс. %

Concentration, mass %

Температура, °C

Temperature, °C

Концентрация, масс. %

Concentration, mass %

Температура, °C

Temperature, °C

166

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

46, 54, 57, 64, 65, 68, 73, 74]. Для трегалозы [16, 62,

69] разброс также доходит до 5°С.

Как видно, при таких различиях в температуре

плавления для одних и тех же концентраций крио-

протекторов сложно сказать, какие величины мо-

гут быть использованы как справочные.

Кроме вышеперечисленных, нами были рассмо-

трены следующие криопротекторы: гидроксиэтил-

крахмал (ГОЭК) [44, 51]; глюкоза [22, 66, 69];

диметилацетамид (ДМАц) [1, 5, 14, 15, 63]; диэтил-

сульфоксид (ДЭСО) [16, 17, 56]; мальтоза [16, 69];

метиловый спирт [13, 18, 43, 47, 63, 69, 73]; моно-

метиловый эфир глицерина (ММЭГ) [6, 76]; моно-

метиловый эфир пропиленгликоля (ММЭПГ) [76];

монометиловый эфир этиленгликоля (ММЭЭГ)

[76]; моноэтиловый эфир глицерина (МЭЭГ) [6];

оксиэтилированные глицерины (ОЭГ) со степенями

замещения n = 3, 5, 7, 12 [19], поливинилпирролидон

(ПВП) [2, 3, 18, 44, 55, 69]; полиэтиленоксиды

(ПЭО) с молекулярной массой 100, 200, 300, 400,

900, 2000 [16–20]; рибоза [16, 69]; сахароза [22, 49,

69]; сорбит [41]; этиловый спирт [13, 36, 47, 63,69,

73], 1,3-БД [15, 31, 37, 38, 58]; 1,4-БД [15, 38, 39];

2,3-БД [15, 38, 71]; Levo-2,3-бутандиол (БД) [31, 37,

58]; 1,3-метокси-2-пропанол (1,3-м-2-П) [76]; 1,3-

ПД [2, 10, 15], а также NaCl [18, 19, 22, 48, 51, 66, 69].

Для других криопротекторов соответствующие

данные в доступной литературе отсутствуют.

Зависимости температуры плавления (t

, °С)

водных растворов криопротекторов от их массовой

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0204060

Рис. 5. Зависимость температуры плавления водных

растворов 1,2-пропандиола от его массовой концентра-

ции.

Fig. 5. Dependency of melting temperature of 1,2-PD aque-

ous solutions on its mass concentration.

-20

-18

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0 204060

Рис. 6. Зависимость температуры плавления водных

растворов трегалозы от ее массовой концентрации.

Fig. 6. Dependency of melting temperature of trehalose

aqueous solutions on its mass concentration.

starch (HES) [44, 51]; glucose [22, 66, 69]; dimethyl

acetamide (DMAc) [1, 5, 14, 15, 63]; diethyl sulfoxide

(DESO) [16, 17, 56]; maltose [16, 69]; methyl alcohol

[13, 18, 43, 47, 63, 69, 73]; monomethyl ether of

glycerol (MMEG) [6, 76]; monomethyl ether of

propylene glycol (MMEPG) [76]; monomethyl ether

of ethylene glycol (MMEEG) [76]; monoethyl ether

of glycerol (MEEG) [6]; oxyethylated glycerols

(OEG) with substitution degree of n = 3,5, 7, 12 [19],

polyvinylpyrrolidone (PVP) [2, 3, 18, 44, 55, 69];

polyethylene oxides (PEO) with 100, 200, 300, 400,

900, 2000 molecular mass [16–20]; ribose [16, 69];

sucrose [22, 49, 69]; sorbite [41]; ethyl alcohol [13,

36, 47, 63,69, 73], 1,3-BD [15, 31, 37, 38, 58]; 1,4-

BD [15, 38, 39]; 2,3-BD [15, 38, 71]; Levo-2,3-

butanediol (BD) [31, 37, 58]; 1,3-metoxy-2-propanol

(1,3-m-2-P) [76]; 1,3-PD [2, 10, 15]; as well as NaCl

[18, 19, 22, 48, 51, 66, 69].

There are no relevant data for other cryoprotec-

tants in available literature.

Dependencies of melting temperature (t

, °C) of

cryoprotective aqueous solutions on their mass con-

centration may be described by polynomials of 3

degree, taking the following form:

= a

+ a

C + a

(1)

where a

÷a

are polynomial coefficients with °C

dimension; C is mass concentration of solution. Values

of polynomial coefficients and dispersion of approxi-

mation

are shown in Table 1.

Концентрация, масс. %

Concentration, mass %

Температура, °C

Temperature, °C

Концентрация, масс. %

Concentration, mass %

Температура, °C

Temperature, °C

167

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

концентрации могут быть описаны полиномами 3-й

степени, имеющими вид:

= a

+ a

C + а

(1)

где а

÷а

– коэффициенты полинома, имеющие

размерность °С; С – массовая концентрация раст-

вора. Значения коэффициентов полинома и диспер-

сии аппроксимации

приведены в табл. 1.

Наряду с температурой плавления в криобио-

логии большую роль играет скрытая теплота плав-

ления. Она оказывает непосредственное влияние

на среднюю скорость охлаждения при одноэтапном

замораживании биообъектов. При замораживании

выделение скрытой теплоты плавления из глубины

образца замедляет охлаждение его внешних слоев,

что непременно скажется на сохранности замора-

живаемого биообъекта.

На рис. 7 представлены зависимости скрытой

теплоты фазового перехода водных растворов

глицерина и 1,2-ПД от массовой концентрации

криопротектора, а на рис. 8 – зависимости скрытой

теплоты плавления водных растворов изомеров

бутандиолов (БД) от их массовой концентрации.

Графики построены и обработаны с условием, что

при нулевой концентрации криопротектора теплота

фазового перехода равна теплоте фазового перехо-

да воды (334,14 кДж/кг).

Зависимости теплоты плавления ∆Н (кДж/кг)

водных растворов криопротекторов от их массо-

100

150

200

250

300

350

0 102030405060

100

150

200

250

300

350

0 1020304050

Рис. 7. Зависимость теплоты плавления водных раство-

ров глицерина () и 1,2-ПД () от их массовых кон-

центраций.

Fig. 7. Dependency of melting heat of glycerol () and 1,2-

PD () aqueous solutions on its mass concentration.

Рис. 8. Зависимость теплоты плавления водных раство-

ров бутандиолов от их массовых концентраций:  – 1,3-

БД; – 2,3-БД;  – Levo-2,3-БД.

Fig. 8. Dependency of melting heat of aqueous solutions

of butane diol isomers on its mass concentration:  – 1,3-

BD; – 2,3-BD;  – Levo-2,3-BD.

Along with melting temperature the key role in

cryobiology is played by the latent heat of melting. It

directly affects an average cooling rate under one-

step freezing of bioobjects. Under freezing the release

of latent melting heat from a sample’s depth slows

down the cooling of its external layers (that will

certainly affect the integrity of frozen bioobject).

Fig. 7 shows the dependencies of latent heat of

phase transition of glycerol and 1,2-PD aqueous

solutions on mass concentration of cryoprotectant,

and Fig. 8 does the dependencies of latent melting

heat of aqueous solutions of butane diols (BD)

isomers on their mass concentration. Graphs are built

and treated with the condition, that at a zero con-

centration of cryoprotectant the heat of phase tran-

sition equals to that for water (334.14 kJ/kg).

Dependencies of melting heat ∆Н (kJ/kg) of

cryoprotective aqueous solutions on their mass

concentrations, as well as melting temperature, are

described by polynomial of 3

degree:

∆Н = b

+ b

C+ 334,14, (2)

where b

÷b

are polynomial coefficients (kJ/kg), C is

mass concentration of cryoprotectant.

The values of polynomial coefficients are summa-

rised in Table 2.

From cryobiological point of view, of importance

is the dependency of phase transition heat on over-

cooling degree, which is observed at each procedure

Концентрация, масс. %

Concentration, mass %

∆H, кДж/кг

∆H, kJ/kg

Концентрация, масс. %

Concentration, mass %

∆H, кДж/кг

∆H, kJ/kg

168

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

Таблица 1. Значения коэффициентов уравнения (1) и дисперсии аппроксимации

для ряда водных растворов криопротекторов

Table 1. Values of equation coefficients (1) and dispersion of approximation for series

of cryoprotective aqueous solutions

ðîòêåòîðïîèðK

tnatcetorpoyrC

× 01

íîçàïàèÄ

,éèöàðòíåöíîê

%.ññàì

noitartnecnoC

)w/w(%,egnar

íèðåöèëÃ

lorecylG

3483,9-3712,9-10002,003789,00÷ 7,66

0751,36948,12,071-6899,07,66 ÷ 001

àçîêþëÃ

esoculG

4358,7-624,127221,0-01299,00÷ 57

ÊÝÎÃ

SEH

2769,6-78,732470,0-01699,00÷ 06

öÀÌÄ

cAMD

663,5-32,401-1230,006299,00÷ 55

073,183268,0-41,51-0,155 ÷ 001

ÎÑÌÄ

OSMD

039,48-8083,0-0 6759,00÷ 07

06,922550,1-506,501-4499,007 ÷ 001

ÎÑÝÄ

OSED

082,69-2990,0-02899,00÷ 04

07,507124,01-47,9537199,008 ÷ 001

ÀÔÌÄ

AFMD

3238,5-13,101-070,0-0 4549,00÷ 08

048,0059759,6-34,5311959,008 ÷ 001

àçîòüëàÌ

esotlaM

1,2-768,6-3840,0-00,10÷ 06

éûâîëèòåÌ

òðèïñ

lonahteM

911,92-74,7318640,1-09199,00÷ 77

02,601-2546,387,553-2999,077 ÷ 001

ÃÝÌÌ

GEMM

08,59-9620,0-05799,00÷ 06

ÃÏÝÌÌ

GPEMM

04,78-7361,0-01099,00÷ 05

ÃÝÝÌÌ

GEEMM

04,711-9841,0-06999,00÷ 05

ÃÝÝÌ

GEEM

07,87-8910,0-05899,00÷ 06

3=nÃÝÎ

3=nGEE

85,98-40,1741839,0-0 6299,00÷ 04

5=nÃÝÎ

5=nGEO

3,51-98,4644073,0-04589,00÷ 05

7=nÃÝÎ

7=nGEO

3,16-5,9232176,0-09299,00÷ 05

21=nÃÝÎ

21=nGEO

29,01-74,983653,0-02899,00÷ 06

ÏÂÏ

PVP

20,52-4,5215291,0-07998,00÷ 06

ÎÝÏ - 001

OEP - 001

085,87-6390,0-07699,00÷ 06

00,0663,0-0,33-0,106 ÷ 001