Журнал - Проблемы криобиологии 2009 №2

Подождите немного. Документ загружается.

149

Содержание клеток, %

Cell content, %

Рис. 7. Популяция CD72

-лимфоцитов в крови: – норма;

– до охлаждения; – после охлаждения.

Fig. 7. CD72

cell population in blood: – norm; – before

cooling; – after cooling.

Рис. 8. Популяция НК -клеток

в крови: – норма; – до

охлаждения; – после охлаждения.

Fig. 8. Population of NK-cells in in blood: – norm; –

before cooling; – after cooling.

Содержание клеток, %

Cell content, %

as a compensatory response to T-lymphopoiesis

weakening, directed to an increase in the content and

functional activity of NK cells in dynamics of human

organism ageing (Fig. 8).

CD11a is expressed on all types of leukocytes,

participates in intercellular adhesion and co-stimulation.

Thepopulation of CD11a

cells remained practically

unchanged in peripheral blood of observed patients,

and it was statistically and significantly reduced vs.

the norm (Fig. 10).

The CD11b is the adhesin receptor, expressing on

granulocytes, macrophages, monocytes, NK cells,

being the killer cell receptor activator, as well as the

mediator of antibody-dependent cytotoxicity, contri-

butes to the interaction of hemopoietic cells with

activated endothelium of vessels, chemotaxis and

phagocytosis. Under atherosclerotic vascular damages

as a result of a disordered interaction between

В проведенных исследованиях было отмечено

снижение содержания НК-клеток по отношению к

норме, однако после холодовых процедур четко

прослеживается динамика увеличения их содержа-

ния, что можно объяснить как компенсаторную

реакцию на ослабление Т-лимфопоэза, направ-

ленную на повышение содержания и функцио-

нальной активности НК-клеток в динамике старе-

ния организма человека (рис. 8).

СD11а экспрессируется на всех типах лейкоци-

тов, участвует в межклеточной адгезии и костиму-

ляции. Популяция СD11а

-клеток практически не

изменялась в периферической крови наблюдаемых

пациентов, но была достоверно меньше по отноше-

нию к норме (рис. 9).

СD11b представляет собой рецептор-адгезин,

экспрессирован на гранулоцитах, макрофагах,

моноцитах, НK-клетках и является активатором

рецептора клеток-киллеров, а также медиатором

антителозависимой цитотоксичности, способст-

вует взаимодействию кроветворных клеток с

активированным эндотелием сосудов, хемотаксису

и фагоцитозу. При атеросклеротических поврежде-

ниях сосудов в результате нарушения взаимо-

действия между эндотелием и лейкоцитами

стимулируется синтез цитокинов, адгезионных мо-

лекул, что ассоциируется с процессами тромбоза

и атерогенеза. В результате экспрессии адгезион-

ных молекул как на лейкоцитах, так и на эндотелии

происходят миграция лейкоцитов и их взаимодейст-

вие с эндотелием. Под действием цитокинов (IL-8)

СD11b способствует пролонгированному контакту

лейкоцитов с сосудистым эндотелием.

Как видно из рис.10, РХВ достоверно снижает

содержание СD11b

-клеток в крови пациентов, что

позволяет предположить о благоприятном влиянии

холодовых процедур на механизм развития атеро-

100

120

Содержание клеток, %

Cell content, %

Рис. 9. Популяция CD11а

-лимфоцитов в крови: –

норма; – до охлаждения; – после охлаждения.

Fig. 9. CD11a

cell population in blood: – norm; – before

cooling; – after cooling.

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

150

endothelium and leukocytes, there is stimulated the

synthesis of cytokines, adhesive molecules, associated

to thrombosis and atherogenesis processes. As a result

of expression of adhesive molecules both on leukocytes

and endothelium, the migration of leukocytes and their

interaction with endothelium occurred.

The Fig. 10 shows RCE as statistically and

significantly reducing the CD11b

cell content pheno-

type in patient’s blood, that enables suggesting about a

favourable effect of cold procedures on mechanisms

of the development of atherosclerotic vascular changes

in aged people.

All compartments of immune system are subjected

to age changes, but a thymus-dependent immunity link

undergoes the deepest ones. The disorders, affecting

thymus stroma, especially its epithelial component, are

primary in these processes. During ageing these

disorders are dominating in age change formation.

Consequently, the “immunological clock” in human

organism is tightly related to thymus and reflects the

programmed processes with one-way and irreversible

character.

Studying the role of CD4

and CD8

cells in the

mechanisms of cell immunity disorder is of great

importance, because of serving as a target for some

viruses, and, consequently, being the index for need in

immune corrections.

The main target cells for many viruses, in particular,

human immune deficiency, is CD4

T-lymphocytes,

supporting adaptive immunity [3]. The acquired viral

properties enable in organism to indefinitely long avoid

its elimination, as well as to cause a deep immune

suppression, developing with time in a manifested

immune deficiency syndrome with following death of

patient and virus. Virus penetration into cells occurs

via CD4 molecule binding. When coming in T-lympho-

cyte through the immune receptors, virus is in a long

latent period, by acquiring the capability to use bioche-

mical apparatus of T-lymphocytes for its propagation.

The virus gets the properties, preventing its

recognition by cytotoxic CD8

cells, thereby depriving

lymphocyte of antigen-specific function and viral

infection elimination [11, 12]. At the same time there

is a supression of signal transfer to inhibited receptors

of natural killers, being the most important element of

congenital cell anti-viral immunity [10], as well as the

production of cytokines, necessary for its activation

[7]. An increased CD4

/CD8

cell ratio in our expe-

riments may be interpreted as a favourable factor,

increasing natural and specific immune protections,

actively resisting to viral expansion, possibly augmenting

the mechanisms of antigen immune recognition,

modulating the signal transfer into a cell and activating

transcription processes. In addition, we believe, that

the activation of adaptive immune mechanisms after

RCE is capable to hinder a disorder in intracellular

Рис. 10. Популяция CD11b

-лимфоцитов в крови: –

норма; – до охлаждения; – после охлаждения.

Fig. 10. CD11b

population of blood lymphocytes: – norm;

– before cooling; – after cooling.

Содержание клеток, %

Cell content, %

склеротических изменений сосудов у людей пожи-

лого возраста.

Возрастным изменениям в иммунной системе

подвержены все ее отделы, однако наиболее глубо-

ким нарушениям – тимусзависимое звено иммуни-

тета. Первичными в этих процессах являются

нарушения, затрагивающие строму тимуса, осо-

бенно ее эпителиальный компонент. Эти нарушения

в процессе старения являются доминирующими в

формировании возрастных изменений. Следова-

тельно, “иммунологические часы” в организме че-

ловека тесно связаны с тимусом и отражают

запрограммированные процессы, имеющие одно-

направленный и необратимый характер.

Изучение роли СD4

, СD8

-клеток в механиз-

мах нарушения клеточного иммунитета имеет

чрезвычайно важное значение, так как они служат

мишенью для ряда вирусов и, следовательно, яв-

ляются показателем необходимости иммунокорре-

гирующих воздействий.

Основными клетками-мишенями для многих

вирусов, в частности иммунодефицита человека,

являются СD4

– Т-лимфоциты, поддерживающие

адаптивный иммунитет[3]. При попадании вирусов

в организм их свойства изменяются, что позволяет

неопределенно долго избегать уничтожения, а так-

же вызывать глубокую иммуносупрессию, что со

временем перерастает в выраженный синдром

иммунодефицита с последующей гибелью боль-

ного и вируса. Проникновение вируса в клетки

происходит посредством связывания молекулы

СD4. Попадая в Т-лимфоцит через иммунные ре-

цепторы, вирус долгое время находится в латент-

ном периоде, приобретая способность использо-

вать биохимический аппарат Т-лимфоцитов для

своего размножения.

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

151

biochemical processes, prevent damages in important

immune function, particularly apoptosis.

The CD3

and CD4

cells are the necessary link of

regulatory T-cell phenotype, playing an important role

in immune suppression, having huge importance at

autoimmune diseases [6]. The main function of

regulatory T-cells is the cell homeostasis regulation,

especially under inflammation, stress, allergies and envi-

ronmental effects. They respond to them by changing

molecule expression on cell membranes, thereby

triggering the immune regulation mechanism, via

modelling the expression of cell surface markers.

Probably, RCE contribute to activating regulatory

processes by T-cells, via affecting their quantitative

and qualitative characteristics. This correlates well with

the improvement of disordered regulatory functions of

vegetative nervous system, that we observed in

experiments after 9 RCE sessions. Obviously, after

extreme cryoeffects the immune and vegetative

nervous systems contribute to “rejuvenescence” of

organism’s disordered homeostasis [2].

During organism’s ageing not only cell, but humoral

immunity link as well, associated to B-lymphocyte

function, undergo changes. Differentiation of the latter

into plasma cells and their accumulation determine

protective individual properties of an organism. The

results of age effect on B-lymphocyte capability to

differentiate into plasma cells and secrete antibodies

are reported contradictory.

In our research a B-cell link of immune reactivity

was subjected to significant changes, testified by CD19

and CD72

cell content in patient’s blood. The perfor-

med rhythmic cold procedures did not change the

direction of reduced humoral immune status in patients.

If analysing the principal function of NK cells,

consisting in elimination of damaged or infected cells,

we may trace the relationship between their activity

and human health state. The NK cells are a non-

specific immune link, which activity is directed by IL-12

macrophage secretion.

There is a direct correlation between the NK-cell

activity and health state. Consequently, when increasing

the NK cell activity, we may significantly strengthen

the immunity and improve health in aged people. People

with a high NK cell activity have a low risk of cancer

disease development.

A decreased number of NK cells may be assumed

to express a weak, but satisfactory cytotoxic capability,

however a significant reduction of their number in blood

of the studied patients should weaken the total resis-

tance of organism to pathogenic penetration, i. e. the

probability the diseases, accompanying elderly age, is

sharply increased.

Nine rhythmic sessions of extreme cryotherapy

contributed to a statistically significant increase in NK-

cell content in blood of observed patients and signifi-

cantly approximated their content to the control values.

Вирус приобретает свойства, препятствующие

распознаванию его цитоксическими СD8

-клетка-

ми, таким образом лишая лимфоцит функции

антиген-специфичности и устранения вирусной

инфекции [11, 12]. При этом подавляется передача

сигналов ингибированным рецепторам натураль-

ных киллеров, являющихся важнейшим элементом

врожденного клеточного противовирусного имму-

нитета [10], а также продукции цитокинов, необхо-

димых для их активации [7]. Повышенное

соотношение клеток СD4

/СD8

в наших экспери-

ментах можно трактовать как благоприятный

фактор, который повышает естественную и специ-

фическую иммунную защиту, активно противо-

стоит вирусной экспансии, возможно, повышает

механизмы иммунного распознавания антигенов,

модулирует передачу сигналов в клетку и акти-

вирует процессы транскрипции. Кроме того, акти-

вация адаптивных механизмов иммунитета после

РХВ, по нашему предположению, способна препят-

ствовать нарушению внутриклеточных биохими-

ческих процессов, предотвращать сбои важнейших

иммунных функций, в частности апоптоза.

СD3

- и СD4

-клетки являются необходимым

звеном регуляторных Т-клеток, играющих важную

роль в иммуносупрессии, и имеют огромное значе-

ние при аутоиммунных заболеваниях [6]. Основная

функция регуляторных Т-клеток – регулировать

клеточный гомеостаз и особенно при воспалении,

стрессе, аллергиях, воздействиях окружающей

среды. Они отвечают на них изменением экспрес-

сии молекул на мембранах клеток и таким образом

включают механизм иммунорегуляции, модулируя

экспрессию маркеров клеточной поверхности.

Возможно, РХВ способствуют активации регуля-

торных процессов Т-клетками, влияя на их коли-

чественные и качественные характеристики. Это

хорошо коррелирует с улучшением нарушенных

регуляторных функций вегетативной нервной

системы, которые мы наблюдали в экспериментах

после 9 сеансов РХВ. Очевидно, иммунная и

вегетативная нервная системы после экстремаль-

ных криовоздействий способствуют “омоложе-

нию” нарушенного гомеостаза организма [2].

При старении организма изменениям подвер-

жено не только клеточное, но и гуморальное звено

иммунитета, которое сопряжено с функцией В-лим-

фоцитов. Дифференцировка последних в плазма-

тические клетки, их накопление определяют

защитные индивидуальные свойства организма.

Результаты влияния возраста на способность

В-лимфоцитов дифференцироваться в плазмати-

ческие клетки и секретировать антитела в исследо-

ваниях имеют противоречивый характер.

В наших экспериментах В-клеточное звено

иммунореактивности было подвержено существен-

ным изменениям, о чем свидетельствует содер-

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

152

Conclusions

If analysing the results of the study, we may

suggest. that 9 RCE sessions significantly improve the

immune system function, contributed to strengthening

the organism’s adaptation to the effect of unfavourable

factors.

жание СD19

- и СD72

-клеток в крови пациентов.

Проведенные ритмические холодовые процедуры

не изменяли направленности сниженного гумораль-

ного иммунного статуса у пациентов.

Анализируя главную функцию НК-клеток,

заключающуюся в уничтожении поврежденных или

инфицированных клеток, можно проследить связь

между их активностью и состоянием здоровья

человека. НК-клетки представляют собой неспе-

цифическое звено иммунитета, активность которого

опосредована секрецией макрофагами IL-12.

Существует прямая корреляция между актив-

ностью НK-клеток и состоянием здоровья. Следо-

вательно, повышая активность НK-клеток, можно

существенно укреплять иммунитет и улучшать

здоровье пожилых людей. Люди, обладающие

высокой активностью НK-клеток, подвержены

низкому риску развития раковых заболеваний.

Можно предположить, что уменьшенное коли-

чество НK-клеток проявляет слабую, но удовлет-

ворительную цитотоксическую способность, тем

не менее существенное снижение их количества в

крови исследуемых пациентов должно ослабить

общую сопротивляемость организма патогенному

проникновению, т. е. вероятность развития сопут-

ствующих пожилому возрасту заболеваний резко

возрастает.

Девять ритмических сеансов экстремальной

криотерапии способствовали достоверному увели-

чению содержания НК-клеток в крови наблюдае-

мых пациентов и значительно приблизили их

содержание к норме.

Âûâîäû

Анализируя результаты исследований, можно

предположить, что 9 сеансов РХВ существенно

улучшают функцию иммунной системы, способст-

вуют усилению адаптации организма к действию

неблагоприятных факторов.

Литература

Атауллаханов Р.И., Гинцбург А.Л. Иммунитет и инфекция:

динамичное противостояние живых систем // Детские

инфекции.– 2005.–Т. 4,№1.– С.11–21.

Бабійчук В.Г. Вплив екстремальної кріотерапії на

функціональний стан систем нейрогуморальної регуляції

старих щурів // Науковий вісник Національного медичного

університету ім.О.О.Богомольця.–2007.– №1.– С. 60–62.

Железникова Г.Ф. Инфекция и иммунитет: стратегия

обеих сторон // Мед. иммунол.– 2006.–Т. 8, №5–6.– С. 597–

614.

Железникова Г.Ф. Иммуноглобулин Е: биологическая

роль при инфекционных заболеваниях // Мед.иммунол.–

2002.– Т. 4, №4–5.– С. 515–534.

Луговская С.А., Почтарь М.Е., Тупицын Н.Н. Иммуно-

фенотипирование в диагностике гемобластозов.–М.,

2005.– 166 с.

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

References

Ataullakhanov R.I., Gintsburg A.L. Immunity and infection:

dynamical opposition of living systems // Detskiye Bolezni.–

2005.– Vol. 4, N1.– P. 11–21.

Babijchuk V.G. Effect of extreme cryotherapy on functional

state of systems of neurohumoral regulation of old rats //

Scient. bulletin of O.O. Bogomolets National Medical

University.– 2007.– N1.– P. 60–62.

Zheleznikova G.F. Infection and immunity: strategy of both

sides // Med. Immunologiya.– 2006.– Vol. 8, N5–6.– P. 597–

614.

Zheleznikova G.F. Immunoglobulin E: biological role under

infectious diseases // Med. Immunologiya.– 2002.– Vol. 4,

N4–5.– P. 515–534.

Lugovskaya S.A., Pochtar’ M.E., Tupitsyn N.N. Immune

phenotyping in diagnostics of hemoblastosis.– Moscow,

2005.– 166 p.

Khajdukov S.V., Zurochka A.V. Extension of possibilities of

flow cytometry method for clinical and immunological practice //

Med. Immunologiya.– 2008.– Vol. 10, N1.– P. 5–12.

Ahmad A., Ahmad R. HIV’s evasion of host’s NK cell response

and novel ways of its countering and boosting anti-HIV

immunity // Curr. HIV Res.– 2003.– Vol. 1, N3.– P. 295–307.

Barnes K. Parasite evolution and the immune system // Allergy

Clin. Immunol. Int.– J. World Allergy Org.– 2005.– Vol. 17,

N6.– P. 229–236.

Brodsky M. Stealth, sabotage and exploitation // Immunol.

Rev.–1999.– Vol. 168.– P. 5–11.

Hamerman J.A., Ogasawa K., Lanier L.L. NK cells in innate

immunity // Curr. Opin. Immunol.– 2005.– Vol. 17.– P. 29–35.

Harty J.T., Tvinnerreim A.R., White D.W. CD8

T cell effector

mechanisms in resistence to infection // Annu. Rev. Immunol.–

2000.– Vol. 18.– P. 275–308.

Klebanoff C.A.,Gattinoni L., Restifo N.P. CD8

T cell memory

in tumor immunology and immunotherapy // Immunol. Rev.–

2006.–Vol. 211.– P. 214–224.

Accepted in 26.02.2009

10.

11.

12.

153

Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Расширение возможностей

метода проточной цитометрии для клинико-иммуно-

логической практики // Мед. иммунол.– 2008. –Т. 10,№1.–

С. 5–12.

Ahmad A., Ahmad R. HIV’s evasion of host’s NK cell response

and novel ways of its countering and boosting anti-HIV

immunity // Curr. HIV Res.– 2003.– Vol. 1, N3.– P. 295–307.

Barnes K. Parasite evolution and the immune system // Allergy

Clin. Immunol. Int.– J. World Allergy Org.– 2005.– Vol. 17,

N6.– P. 229–236.

Brodsky M. Stealth, sabotage and exploitation // Immunol.

Rev.–1999.– Vol. 168.– P. 5–11.

Hamerman J.A., Ogasawa K., Lanier L.L. NK cells in innate

immunity // Curr. Opin. Immunol.– 2005.– Vol. 17.– P. 29–35.

Harty J.T., Tvinnerreim A.R., White D.W. CD8

T cell effector

mechanisms in resistence to infection // Annu. Rev. Immunol.–

2000.– Vol. 18.– P. 275–308.

Klebanoff C.A.,Gattinoni L., Restifo N.P. CD8

T cell memory

in tumor immunology and immunotherapy // Immunol. Rev.–

2006.–Vol. 211.– P. 214–224.

Поступила 26.02.2009

Рецензент В.В. Рязанцев

10.

11.

12.

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

154

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

* Àâòîð, êîòîðîìó íåîáõîäèìî íàïðàâëÿòü êîððåñïîíäåíöèþ:

óë. Ïåðåÿñëàâñêàÿ, 23, ã. Õàðüêîâ, Óêðàèíà 61015; òåë.:+38

(057) 373-19-31, ôàêñ: +38 (057) 373-30-84, ýëåêòðîííàÿ ïî÷òà:

cryo@online.kharkov.ua

* To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavskaya

str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 1931, fax: +380 57

373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-

tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine

Èíñòèòóò ïðîáëåì êðèîáèîëîãèè è êðèîìåäèöèíû

ÍÀÍ Óêðàèíû, ã. Õàðüêîâ

УДК 597.554.3-131.7:547.569.2

Ê.Á. ÌÈÊÑÎÍ, Å.Ô. ÊÎÏÅÉÊÀ*, Ò.Ï. ËÈÍÍÈÊ

Óñëîâèÿ âèòðèôèêàöèè ýìáðèîíîâ âüþíà

(Misgurnus fossilis) â êðèîçàùèòíûõ ñðåäàõ

UDC 597.554.3-131.7:547.569.2

K.B. MIKSON, E.F. KOPEIKA*, T.P. LINNIK

Conditions for Loach (Misgurnus fossilis) Embryo

Vitrification in Cryoprotective Media

Исследовали устойчивость эмбрионов вьюна (Misgurnus fossilis) к воздействию 5 криозащитных сред и определяли

условия их витрификации. Полученные экспериментальные данные показали, что на стадии развития, соответствующей началу

пульсации сердца, наибольшее количество витрифицированных эмбрионов (до 100%) было при инкубировании 30 мин в

криозащитной среде, состоящей из 30% сахарозы, 10% этиленгликоля, 3% полиэтиленоксида 1500 и 20% 1,2-пропандиола.

Температура витрификации эмбрионов вьюна на этой стадии развития была в диапазоне –80...–176°С.

Ключевые слова: эмбрионы, вьюн (Misgurnus fossilis), криозащитная среда, витрификация.

Досліджували стійкість ембріонів в’юна (Misgurnus fossilis) до дії 5 кріозахисних середовищ і визначали умови їх вітрифікації.

Отримані експериментальні дані показали, що на стадії розвитку, яка відповідає початку пульсації серця, найбільша кількість

вітрифікованих ембріонів (до 100%) була при 30-хвилинній обробці їх кріозахисним середовищем, яке складається з 30%

сахарози, 10% етиленгліколю, 3% поліетиленоксиду 1500 і 20% 1,2-пропандіолу. Температура вітрифікації ембріонів в’юна на

цій стадії розвитку була в діапазоні –80...–176°С.

Ключові слова: ембріони, в’юн (Misgurnus fossilis), кріозахисне середовище, вітрифікація.

Resistance of loach (Misgurnus fossilis) embryos to the effect of 5 cryoprotective media was investigated and the conditions of

their vitrification were determined. The obtained experimental data demonstrated, that at a developmental stage, corresponding to the

heart beating onset, the highest number of vitrified embryos (up to 100%) was observed during 30 min incubation within a cryoprotective

medium, consisting of 30% sucrose, 10% ethylene glycol, 3% polyethylene oxide – 1500 and 20% 1,2-propane diol. Vitrification

temperature of loach embryos at this developmental stage was within –80...–176°C range.

Key-words: embryos, mud loach (Misgurnus fossilis), cryoprotectant medium, vitrification.

Решение проблемы криоконсервирования ооци-

тов и эмбрионов рыб позволит создать страховые

запасы гамет и эмбрионов ценных и промысловых

видов рыб, а также предотвратить их исчезновение

в результате массовых эпизоотий [7]. Особенно это

важно для редких и исчезающих видов [11]. Боль-

шую пользу результаты исследований могут при-

нести в селекции промысловых видов, при полу-

чении товарной личинки в любое время года неза-

висимо от их нерестовых периодов.

Однако до настоящего времени методы крио-

консервирования эмбрионов рыб не разработаны

[15, 28, 30] из-за крупных размеров яйцеклеток,

сложно устроенного комплекса, состоящего из эмб-

риональных клеток и желточного мешка, низкой

проницаемости мембран и чувствительности эм-

брионов к переохлаждению [19, 21]. Попытки

заморозить эмбрионы рыб традиционными мето-

дами в средах с низкими концентрациями криопро-

текторов и низкими скоростями охлаждения не дали

надежных результатов [18]. Поэтому большинство

Solving the problem of fish oocyte and embryo

cryopreservation will enable creating the reserve stocks

for gametes and embryos of useful and target fish

species, as well as preventing their endangered state

because of mass epizootic diseases [7]. This is of a

special importance for rare and endangered species

[11]. Research results may be of great benefit in se-

lecting the target species, when procuring market larva

at any season independently on their spawning periods.

However the methods for fish embryo cryopre-

servation have still remained undeveloped [15, 28, 30]

because of a big size of oocytes, a complicated way

of complex organisation, consisting of embryonic cells

and yolk sac, low membrane permeability and embryo

sensitivity to overcooling [19, 21]. The attempts to

freeze fish embryos using the standard methods in the

media with low cryoprotective concentrations and low

cooling rates did not provide the reliable results [18].

Therefore the applying of vitrification procedure is

considered to be perspective by most researchers [24,

27].

155

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

исследователей считают перспективным примене-

ние процедур витрификации [24, 27].

Использование сред с высокой концентрацией

криопротекторов и последующей витрификацией

эмбрионов солоноводных рыб позволило получить

после размораживания 32% жизнеспособных эмб-

рионов ложного палтуса [9] и 2,13% желтой камба-

лы [26]. Однако эмбрионы пресноводных рыб ме-

нее устойчивы к экстремальным факторам крио-

консервирования [9, 26]. Поэтому для эмбрионов

каждого вида рыб необходимо определять как крио-

защитную среду, так и условия их витрификации.

Цель данной работы – определение состава

криозащитной среды и режимов охлаждения, поз-

воляющих витрифицировать эмбрионы вьюна на

стадии развития 35 (начало пульсации сердца).

Ìàòåðèàëû è ìåòîäû

Половозрелых особей вьюна (Misgurnus fossi-

lis L. 1758) возрастом от 4 до 6 лет отлавливали из

мест их природного обитания во время ледостава,

сортировали по полу и содержали раздельно при

4–5°C в пластиковых контейнерах с отстоянной

водопроводной водой. Перед проведением экспе-

риментов температуру повышали до 21°C [1]. В

каждом эксперименте при повторах (n = 5) было

использовано 3 самки и 5 самцов.

Эмбрионы были получены по методу, модифи-

цированному Нейфахом [4]. После инъекции хорио-

нического гонадотропина (самкам по 300 ед., сам-

цам по 100 ед.) производителей помещали в пласти-

ковые контейнеры с отстоянной водопроводной во-

дой объемом 10 л и содержали при температуре

21°C. Созревание наступало через 30–36 ч. Икру

каждой самки осеменяли смесью измельченных

семенников от нескольких самцов и распределяли

по чашкам Петри примерно по 200 штук для пос-

àäåðÑ

muideM

%,àâòñåùåâåèíàæðåäîÑ

%,tnetnocecnatsbuS

àçîðàõàÑ

esorcuS

ÎÝÏ - 0051

OEP - 0051

ÃÝ

2,1 - ÄÏ

2,1 - DP

ÖÀÌ

CAM

1Ñ033 5,7025,2

2Ñ3,751,25,7--

3Ñ8 2,201--

4Ñ0330102-

5Ñ03301--

Состав криозащитных сред

Composition of cryoprotective media

Примечание: ПЭО-1500 – полиэтиленоксид с м. м. 1500; ЭГ – этиленгли-

коль; 1,2-ПД – 1,2-пропандиол; МАЦ – метилацетамид.

Notes: PEO-1500 – polyethylene oxide with molecular weight 1500; EG –

ethylene glycol; 1,2-PD – 1,2-propane diol; MAC – methyl acetamide.

ледующей инкубации в воде при темпе-

ратуре 21°C, pH 7,2, dGH 6,7 мг-экв/л.

Воду меняли три раза в сутки. Погиб-

шие и остановившиеся в развитии эмб-

рионы удаляли. Оценку развивающихся

эмбрионов проводили согласно картам

эмбрионального развития [1]. Развиваю-

щиеся эмбрионы, которые находились на

стадии развития, соответствующей на-

чалу пульсации сердца, отбирали при

каждом повторе от трех самок. Эмб-

рионы освобождали от наружных оболо-

чек гидравлическим ударом без повреж-

дений.

В каждой серии эмбрионы от трех

самок (20 штук) подвергали обработке

криозащитными средами (таблица) с

интервалом в 5 мин в течение 25–60 мин

для установления времени выживания.

Using the media with high cryoprotective concen-

tration and following embryo vitrification of saltwater

fish species enabled to obtain after freeze-thawing 32

and 2.13% of viable embryos of flounder [9] and

Alaska plaice [26], correspondingly. However the

freshwater fish embryos are less resistant to extreme

cryopreservation factors [9, 26]. Therefore for emb-

ryos of each species it is necessary to determine both

cryoprotective medium and conditions for their vitrifica-

tion.

This research was aimed to determine the compo-

sition of cryoprotective medium and cooling regimens,

allowing to vitrify loach embryo at the developmental

stage 35 (heart beating onset).

Materials and methods

Mature loach (Misgurnus fossilis L. 1758) species

aged from 4 to 6 years were caught from their natural

habitats during freeze-up, sex-graded and kept

separately at 4–5°C in plastic containers with settled

tap water. Prior to experiment performance we rise

temperature up to 21°C [1]. In each experiment with

the repeats (n = 5) we used 3 females and 5 males.

Embryos were procured according to the method,

modified by Neifakh [4]. After injecting chorionic

gonadotropin (by 300 and 100 units for females and

males, correspondingly) the spawners were placed into

10 l plastic containers with settled water and kept at

21°C. Maturation occurred in 30–36 hrs. Each female

eggs were inseminated by the mixture of testes from

several males and distributed by Petri dishes approxi-

mately by 200 pieces for following incubation in water

at 21°C, pH 7.2, dGH 6.7 mg-eq/l. Water was changed

thrice a day. Died and stopped in their development

embryos were removed. Developing embryos were

estimated according to the embryonic development

maps [1]. Embryos in progress, being at the develop-

156

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

За развитием отмытых эмбрионов наблюдали

до стадии свободно плавающей личинки.

Для замораживания эмбрионы отбирали микро-

пипеткой поштучно с общим объемом криозащит-

ной среды 15–20 мкл и накапывали на охлажден-

ную медную пластину, размещенную в парах жид-

кого азота. Витрифицированные эмбрионы в каж-

дой среде определяли визуально по степени проз-

рачности.

Статистический анализ проводили с помощью

пакета прикладных программ STATISTICA. Для

определения статистически значимых различий по

выживаемости в сравниваемых группах эмбрионов

использовали тесты Тюки и Манна-Уитни. Статис-

тически значимыми отличия считали при р < 0,05.

Результаты представляли в виде среднего ± стан-

дартная ошибка. Все величины преобразовывали

в arcsin для приведения полученных данных к

нормальному распределению.

Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå

Эмбрионы костистых рыб развиваются быстро,

и их устойчивость к криопротекторам и переохлаж-

дению изменяется неравномерно, что некоторые

авторы [17, 29] связывают с асинхронностью деле-

ния клеток на разных стадиях развития. Количество

желтка на поздних стадиях развития значительно

снижается в связи с интенсивным эндогенным

питанием, а оболочки хориона разрыхляются [1],

что позволяет уменьшить время эквилибрации в

криозащитных средах. Чтобы достичь состояния

витрификации при замораживании эмбрионов

вьюна на стадии развития 35 использовали высокие

концентрации криозащитных сред.

В связи с низкой проницаемостью эмбриональ-

ных мембран необходимо увеличивать время

инкубации эмбрионов в криозащитных средах, что

могло привести к их гибели еще до замораживания

вследствие токсичности криопротекторов [7, 26].

Поэтому на первом этапе исследований опреде-

ляли динамику гибели эмбрионов в зависимости

от времени эквилибрации с криозащитными сре-

дами.

Было установлено, что при инкубации эмбрио-

нов в криозащитных средах в течение 25 мин пока-

затель уровня выживаемости не имел статисти-

чески значимых различий с контрольными группа-

ми (тест Манна-Уитни, р < 0,05) (рис. 1).

При инкубации эмбрионов в течение 30 мин

наблюдалось несущественное снижение уровня их

выживаемости во всех криозащитных средах. Пос-

ле инкубации в криозащитных средах в течение

30–35 мин сердце перестает пульсировать, но у

отмытых эмбрионов впоследствии восстанавли-

валось биение сердца и сохранялась способность

к развитию. Увеличение времени инкубации эмб-

mental stage, corresponding to the heart beating onset,

were selected at every repeat from three females.

External embryonic membranes were removed by

means of hydraulic shock without damages.

In each series the embryos of three females (20

pieces) were treated with cryoprotective media (Table)

with 5 min interval during 25–60 min to establish a

survival time.

Development of washed-out embryos was obser-

ved up to the stage of free swimming larvae.

For freezing the embryos were selected with micro-

pipette by the piece with 15–20 ml total volume of

cryoprotective medium and pipetted on a cooled copper

plate, placed in liquid nitrogen vapour. Vitrified embryos

in each medium were visually detected by the clarity

degree.

Statistical processing was done using the “Statis-

tica” software. In order to determine the statically

significant differences on the survival rate in embryo

groups under comparison we used the Tukey’s and

Mann-Whitney’s tests. Statistically significant values

were calculated at p < 0.05. Results were presented

as a mean ± standard error. All values were transfor-

med in arcsin to bring the obtained data into the normal

distribution.

Results and discussion

Bony fish embryos develop rapidly and their

resistance to cryoprotectants and overcooling changes

in a nonuniform way, that is believed by some authors

[17, 29] to be associated with cell mitosis at different

developmental stages. At late developmental stages

the yolk amount considerably reduces due to an

intensive endogenous nutrition and the chorion mem-

branes are getting loosed [1], allowing to reduce the

equilibration time in cryoprotective media. To achieve

the vitrification state during loach embryo freezing at

developmental stage 35 we used high concentrated

cryoprotective media.

Due to a low permeability of embryonic membranes

it is necessary to increase the incubation time for emb-

ryos in cryoprotective media, that might result in their

death even before freezing because of cryoprotective

toxicity [7, 26]. Therefore at the first stage of research

we determined the dynamics of embryo death depen-

ding on equilibration time with cryoprotective media.

During 25 min incubation of embryos in cryopro-

tective media the index of survival level was established

to have no statistically significant differences with the

control groups (Mann-Whitney’s test, p < 0.05) (Fig. 1).

During 30 min embryo’s incubation a slight decrease

in their survival level was observed in all the cryopro-

tective media. After incubating in cryoprotective media

within 30–35 min, heart stops beating, but in washed

embryos heart beatings recovered and the capability

for development was kept.

157

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

рионов от 40 до 60 мин приводило к высокой смерт-

ности, что нецелесообразно при проведении замо-

раживания, т. е. оптимальное время эквилибрации

составляет 30–35 мин.

Мы использовали в криозащитных средах

криопротекторы 1,2-пропандиол (1,2-ПД) и полиэти-

леноксид с м. м. 1500 (ПЭО-1500) потому, что эти

криопротекторы в составе криозащитных сред для

эмбрионов других карповых были отмечены как

малотоксичные [29]. Добавление в криозащитные

среды С1 и С4 криопротекторов 1,2-ПД и ПЭО-

1500 не оказало отрицательного воздействия на

выживаемость эмбрионов при инкубировании в

течение 35 мин, несмотря на то, что в С1 выживае-

мость наименьшая, а в С4 – наибольшая.

Было установлено, что метилацетамид (МАЦ)

обладает высокой проницаемостью и не оказывает

существенного влияния на выживаемость сперма-

тозоидов птиц [2], но в наших экспериментах он

оказал негативное влияние на выживаемость эмб-

рионов вьюна при увеличении времени инкубации

свыше 15 мин, что согласуется с [12]. В среде С1

с присутствием криопротектора МАЦ установлен

самый низкий уровень выживаемости. Однако

нами было показано, что увеличение содержания

сахарозы в криозащитных средах способно в

некоторой степени снизить токсичность остальных

криопротекторов и нейтрализовать их негативное

влияние. Это согласуется с результатами [23].

Эффект влияния самок на выживаемость эмб-

рионов наблюдался во всех экспериментальных

группах (рис. 2).

Были установлены различия по уровню выжи-

ваемости между группами эмбрионов, полученных

Rise in incubation time for embryos to 40–60 min

resulted in a high mortality rate, that was not expedient

during freezing and the optimal equilibration time was

30–35 min.

We used 1,2-propane diol (1,2-PD) and polyethy-

lene oxide with molecular weight of 1500 (PEO-1500)

in cryoprotective media because of their low-toxicity

as part of cryoprotective media for embryos of other

carp species [29]. Adding 1,2-PD and PEO-1500 into

C1 and C4 cryoprotective media had no negative effect

on embryo survival during 35 min incubation, despite

the fact, that the lowest and highest survivals were in

C1 and C4, correspondingly.

Methyl acetamide (MAC) was established to have

a high permeability and no significant effect on bird

spermatozoa survival [2], but in our experiments it

negatively affected the index for loach embryo when

increasing incubation time over 15 min, that correlated

to the data, reported in the paper [12]. In C1 medium

with MAC presence there was established the lowest

survival level. However we demonstrated a sucrose

content increase in cryoprotective media as capable

to reduce in some extent the toxicity of the rest cryo-

protectants and neutralise their negative effect. This

correlates with the result [23].

The effect of female influence on embryo survival

was observed in all the experimental groups (Fig. 2).

Differences on survival level between embryo

groups, obtained from different females, were estab-

lished. Statistically significant differences were defined

between the 2

and 3

females. The same effect was

found in the paper [12, 22]. Differences in embryo

survival of different females the authors explained by

those in fish physiological state and its embryos as well.

С4

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

1,4

1,6

25 30 35 40 45 50 55 60 К

Время эквилибрации, мин Equilibration duration, min

Рис. 1. Выживаемость эмбрионов вьюна (среднее ± стандартная ошибка) в зависимости от времени инкубации в

криозащитных средах (n = 5): – C1; – C2; – C3; – C4; – C5;К – контроль;* – статистические различия между

значениями для времени инкубации, р < 0,05

Fig. 1. Loach embryo survival (mean ± standard error) depending on incubation time in cryoprotective media (n = 5): –

C1; – C2; – C3; – C4; – C5; K is control; * – statistically significant differences between values for equilibration

time, p < 0.05,

Выживаемость эмбрионов, arcsin %

Embryo survival, arsin %

158

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

от разных самок. Статистически значимые разли-

чия были определены между 2-й и 3-й самками.

Подобный эффект был описан в [3, 22]. Различия

в выживаемости эмбрионов разных самок авторы

объяснили различиями в физиологическом состоя-

нии рыб, и, следовательно, их эмбрионов.

Эмбрионы, обработанные в течение 30 мин

криозащитными средами, замораживали для опре-

деления оптимальной витрифицирующей среды.

Измерение температуры медной пластины с по-

мощью термопары показало, что диапазон темпе-

ратур, в котором происходит витрификация, –80...

–176°С. При более высоких температурах замора-

живания не наблюдалось стеклования объектов, а

при температуре замораживания ниже –176°С не

удавалось зафиксировать стеклование, так как

капля раствора с эмбрионом разрушалась.

При замораживании определялся наибольший

процент витрифицированных эмбрионов (рис. 3).

Установлено, что эмбрионы вьюна имеют вы-

сокую устойчивость к воздействию криопротекто-

ров на стадиях развития 23–35 (образование за-

чатков глаз – начало пульсации сердца) [3]. Для

каждого вида рыб эти стадии индивидуальны, и у

большинства исследованных находятся в диапа-

зоне между стадией развития, соответствующей

поздней гаструле и началу биения сердца [16, 31,

32]. Однако эмбрионы вьюна на стадии развития

23 имеют большое количество желтка, который

может препятствовать их витрификации [20]. На

более поздних стадиях развития желточный мешок

меньше. Кроме того, мы предположили, что на

стадии 35 проницаемость эмбриональных мембран

выше, что поможет осуществить дегидратацию

эмбрионов и насыщение их криозащитными сре-

дами. Наши результаты согласуются с результа-

тами Robles et al. [26, 27] об устойчивости эмб-

рионов на поздних стадиях развития к переохлаж-

дению, токсичности криопротекторов и механичес-

ким повреждениям.

В наших экспериментах невитрифицированные

эмбрионы были белого цвета, что указывает на при-

сутствие межклеточных и внутриклеточных крис-

таллов льда у эмбриона или желточного мешка.

Было установлено, что лучшей средой, в кото-

рой наблюдался наибольший процент витрифи-

цированных эмбрионов, является среда С4, состоя-

щая из 30% сахарозы + 10% этиленгликоля (ЭГ) +

3% ПЭО-1500 и 20% 1,2-ПД.

После витрифицирования эмбрионы погружали

в жидкий азот и сохраняли в течение 60 мин, отогре-

вали эмбрионы в чашках Петри объемом 40 мл с

водой при температуре 22°С. Для удаления крио-

протекторов троекратно меняли воду. В дальней-

шем эмбрионы инкубировались при температуре

Embryos treated with cryoprotective media for 30

min were frozen to determine the optimal vitrifying

medium. Measuring temperature of copper plate using

thermocouple has shown the temperature range, where

vitrification occurs, to be –80...–176°C. Under higher

freezing temperatures no objects’ vitrification was

observed, but under those, lower than –176°C the

vitrification could not be fixed because of the dest-

ruction of embryo-contained solution drop with .

During freezing there was determined the highest

percentage of vitrified embryos (Fig. 3).

Loach embryos were established to be high resistant

to cryoprotective effect at developmental stages 23-

35 (eye bud formation – heart beating onset) [3]. For

each fish species these stages are individual and in the

most researches they are within the range between

developmental stage, corresponding to the late gastrula

and heart beating onset [16, 31, 32]. However the loach

embryos at the developmental stage 23 have a big

amount of yolk, which may prevent their vitrification

[20]. At later developmental stages the yolk sac is

smaller. In addition, we believed that at the stage 35

the permeability of embryonic membranes was higher,

assisting in realising embryo dehydration and their

saturation with cryoprotective media. Our results

correlate with those of Robles et al. [26, 27] on embryo

resistance at later developmental stages to overcooling,

cryoprotective toxicity and mechanical damages.

Рис. 2. Выживаемость эмбрионов разных самок после

инкубирования в криозащитных средах. Статистически

значимые различия существуют между группами, не

имеющими одинаковых символов (тест Тюки, р < 0,05,

n=5): – стандартное отклонение; – стандартная

ошибка; – среднее.

Fig. 2. Survival of embryos from different females after

incubating in cryoprotective media. Statistically significant

differences exist between the groups without equal symbols

(Tukey’s test, p<0.05, n = 5): – standard deviation;

– standard error; – is mean.

Самки Females

Выживаемость эмбрионов, arcsin %

Embryo survival, arsin %