Журнал - Проблемы криобиологии 2009 №2

Подождите немного. Документ загружается.

139

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

Рис. 1. Осмотическая реакция клеток СПЭВ при экспозиции в 1М раствора ЭГ (цифры – время экспозиции в секундах).

Fig. 1. Osmotic reaction of SPEV cells at exposure in 1 M EG solution (numbers show the exposition time in seconds).

a a б b

в c г d

д e е f

Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå

На серии микрофотографий представлена кине-

тика характерных изменений клеток СПЭВ при

экспозиции (18°С) в 1М растворе ЭГ (рис. 1). Мож-

но видеть, что осмотическая реакция клеток (быст-

Fig. 2, 3 demonstrate the features of experimental

dependence of SPEV cell volumes on contact time

with 1M EG and 1,2-BD, as well as theoretical curves,

extrapolating osmotic cell behavior. In the solutions of

1,2-BD there was noted less manifested dehydration

240

360

140

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 100 200 300 400 500 600

Рис. 2. Экспериментальные зависимости относительных

объемов клеток СПЭВ от времени контакта с 1М раство-

ром ЭГ и экстраполирующие осмотическое поведение

клеток теоретические кривые при разных температурах:

 – 35°С; – 18°С;  – 7°С.

Fig. 2. Experimental dependences of relative volumes of

SPEV cells on contact time with 1 M EG solution and ex-

trapolating the osmotic cell behavior theoretical curves at

different temperatures:  – 35°C; – 18°C;  – 7°C.

Время, с Time, sec

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 100 200 300 400 500 600

Рис. 3. Экспериментальные зависимости относительных

объемов клеток СПЭВ от времени контакта с 1М раство-

ром 1,2-БД и экстраполирующие осмотическое пове-

дение клеток теоретические кривые при разных темпе-

ратурах:  – 35°С; – 18°С;  – 7°С.

Fig. 3. Experimental dependences of relative volumes of

SPEV cells on contact time with 1 M 1,2-BD solution and

extrapolating the osmotic cell behavior theoretical curves

at different temperatures:  – 35°С; – 18°С;  – 7°С.

Время, с Time, sec

Относительный объем клетки V/V

Relative cell volume V/V

Относительный объем клетки V/V

Relative cell volume V/V

of cells than in the solutions of EG; reduced rehydration

rate of cells under the decrease of temperature is

characteristic for osmotic response in both solutions.

The findings testify to a reduced rate of penetration of

EG and 1,2-BD into cells under temperature fall and

more rapid penetration of 1,2-BD into cells comparing

to EG.

The permeability coefficients of SPEV cell memb-

ranes to molecules of EG and 1,2-BD, calculated by

means of theoretical dependencies, extrapolating the

experimental data are presented in the Table. The

presented research results demonstrate that perme-

ability of SPEV cell membranes to molecules of 1,2-

BD at 35°C is significantly higher than for EG mole-

cules. During the decrease of temperature the diffe-

rence in permeability for molecules of the studied

substances disappears. Higher permeability of 1,2-BD

if compared with EG correlates with higher value of

the partition coefficient (K

) of 1,2-BD in the “water-

n-octanol” system, that supposes the penetration of

1,2-BD into cells via lipid bilayer [2]. This supposition

may explain why the big size molecules penetrate into

cells quicker than those of smaller size.

In Fig. 4 the Arrhenius coordinates show the

penetration coefficients of SPEV cell membranes for

EG and 1,2-BD molecules at 35, 18 and 7°C, as well

as the linear dependences lnk(l/T), extrapolating

experimental data. Activation energies (E

), calculated

from these dependencies are equal to 45.07 kJ/mol

for EG and 55.35 kJ/mol for 1,2-BD.

рая дегидратация и последующая относительно

медленная регидратация) полностью завершается

к 5-й минуте экспозиции и не сопровождается

заметными нарушениями клеточной структуры. В

1М растворе 1,2-БД наблюдались аналогичные

изменения клеток.

На рис. 2, 3 приведены характерные экспери-

ментальные зависимости объемов клеток СПЭВ

от времени контакта с 1 М растворами ЭГ и 1,2-БД,

а также экстраполирующие осмотическое поведе-

ние клеток теоретические кривые. В растворах

1,2-БД отмечена менее выраженная дегидратация

клеток, чем в растворах ЭГ; снижение скорости

регидратации клеток при понижении температуры

характерно для осмотической реакции в обоих

растворах. Полученные данные свидетельствуют

о снижении скорости проникновения ЭГ и 1,2-БД в

клетки при понижении температуры и более

быстром проникновении в клетки 1,2-БД, чем ЭГ.

Коэффициенты проницаемости мембран клеток

СПЭВ для молекул ЭГ и 1,2-БД, рассчитанные на

основе теоретических зависимостей, которые экст-

раполируют экспериментальные данные, приве-

дены в таблице. Из представленных результатов

исследований следует, что проницаемость мемб-

ран клеток СПЭВ для молекул 1,2-БД при 35°С

достоверно выше, чем для молекул ЭГ. При пони-

жении температуры различие в проницаемости для

молекул исследуемых веществ исчезает. Более

высокая проницаемость 1,2-БД по сравнению с ЭГ

1,5

2,5

3,5

4,5

0,0032 0,0033 0,0034 0,0035 0,0036

141

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ln (K

×10

)

Коэффициенты проницаемости мембран клеток СПЭВ для молекул ЭГ и 1,2-БД, измеренные при разных

температурах, и некоторые физико-химические характеристики ЭГ и 1,2-БД

Permeability coefficients of SPEV cell membranes to EG and 1,2-BD molecules at different temperatures

and some physical and chemical characteristics of EG and 1,2-BD

Примечание: различия между значениями коэффициента проницаемости при различной температуре статистически достоверны

(р < 0,05); К

– коэффициент распределения в системе «вода-н-октанол» [7].

Notes: Differences between values of permeability coefficient at different temperatures are statistically significant (p < 0.05); K

–

partition coefficient in “water-n-octanol” system [7].

Рис. 4. Зависимости Аррениуса проницаемости мемб-

ран клеток СПЭВ для молекул криопротекторов в интер-

вале температур 35–7°С:  – 1,2-БД и ● – ЭГ.

Fig. 4. Arrhenius permeability dependences of SPEV cell

membranes for molecules of cryoprotectants within

temperature range of 35–7°C:  –1,2-BD and ● – EG.

The obtained in the research data about the perme-

ability parameters of SPEV cells to EG and 1,2-BD

point to the necessity at a comparative evaluation of

permeability of different cryoprotectants to take into

account temperature dependence of permeability

coefficients as well.

Conclusions

1. Using the method of volumometry and thermo-

dynamics equations of irreversible processes there we-

re measured the permeability coefficients of SPEV

cells to EG and 1,2-BD molecules at temperatures of

35, 18 and 7°C.

коррелирует с более высоким значением коэффи-

циента распределения (К

) 1,2-БД в системе “вода-

н-октанол”, что предполагает проникновение 1,2-

БД в клетки через липидный бислой [2]. Такое

предположение может объяснить, почему моле-

кулы большего размера проникают в клетки быст-

рее, чем молекулы меньшего размера.

На рис. 4 в координатах Аррениуса приведены

коэффициенты проницаемости мембран клеток

СПЭВ для молекул ЭГ и 1,2-БД при температурах

35, 18 и 7°С и экстраполирующие эксперимен-

тальные данные линейные зависимости lnk(1/T).

Энергии активации (Е

), рассчитанные из этих

зависимостей, равны: для ЭГ– 45,07 кДж/моль;

1,2-БД – 55,35 кДж/моль.

Полученные в работе данные о параметрах про-

ницаемости клеток СПЭВ для ЭГ и 1,2-БД указы-

вают на необходимость при сравнительной оценке

проницаемости различных криопротекторов учиты-

вать и температурную зависимость коэффициентов

проницаемости.

Âûâîäû

1. С использованием метода волюмометрии и

уравнений термодинамики необратимых процессов

измерены коэффициенты проницаемости клеток

СПЭВ для молекул ЭГ и 1,2-БД при температурах

35, 18 и 7°С.

2. При температуре 35°С проницаемость мемб-

ран клеток СПЭВ для молекул 1,2-БД достоверно

выше, чем для молекул ЭГ, при 7°С достоверных

различий в проницаемости этих диолов не выяв-

лено.

3. Определенные из температурных зависимос-

тей проницаемости энергии активации для ЭГ и 1,2-

БД составляют 45,07 и 55,35 кДж/моль соответст-

венно.

1,2-BD

= 55,35 kJ/mol

= 45,07 kJ/mol

1/T

ðîòêåòîðïîèðÊ

tnatcetorpoyrC

àëóìðîôÿàíðóòêóðòÑ

alumroflarutcurtS

ëóêåëîìðòåìàèÄ

,DD

retemaideluceloM

,DD

òíåèöèôôýîÊ

Êÿèíåëåäåðïñàð

noitubirtsiD

iffeoccKtnei

Ñ°,àðóòàðåïìåÒ

C°,erutarepmeT

òíåèöèôôýîÊ

èòñîìåàöèíîðï

× 01

ñ/ì,

ytilibaemreP

,tneiciffeoc

× 01

s/m,

ÃÅ

HC-OH

HC-

HO-6,2040,0

13,1±51,4

35,0±73,1

32,0±27,0

2,1 - ÄÁ

2,1 - DB

HC-OH

HC-HC-

HC-

3,4803,0

11,1±46,6

45,0±96,2

71,0±77,0

142

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

2. At temperature of 35°C the permeability of

SPEV cell membranes to molecules of 1,2-BD was

significantly higher than to the molecules of EG, at

7°C no significant differences in permeability of these

diols were found.

3. Found from temperature dependences the per-

meability of activation energy for EG and 1,2-BD made

45.07 and 55.35 kJ/mol, correspondingly.

Литература

Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С. Физические основы низко-

температурного консервирования клеточных суспен-

зий.– Киев:Наук. думка, 1994.– 142с.

Гордієнко О.І., Ліннік Т.П. Механізми проникання не-

електролітів низки діолів крізь мембрани еритроцитів //

Біофіз. вісник, Вісн. Харків. ун-ту.– 2002.– Вип.2, №568.–

С. 43–47.

Захаров А.Ф. Поздняя редупликация хромосом в культи-

вируемых клетках китайского хомячка // Цитология.–

1966.– Т. 8, №2.– C.201–207.

Коваленко Г.В., Коваленко И.Ф., Линник Т.П. Проница-

емость мембран эритроцитов крысы и кролика для крио-

протекторов ряда амидов и диолов// Пробл. криобио-

логии.– 2007.– Т. 17, №4.– C. 365–373.

Коваленко И.Ф., Кощий С.В., Тимофеева Е.В. и др.

Проницаемость мембран клеток СПЭВ для молекул воды

и диметилсульфоксида // Пробл. криобиологии.– 2009.–

Т. 19,№1.– С. 25–31.

Криобиология и криотехнология / Под общ. ред. А.А. Цу-

цаевой.– Киев: Наук. думка, 1987.– 216 с.

Линник Т.П., Бизикина О.В. Криоконсервирование спер-

мы петухов. 1. Цитотоксичность диолов и амидов // Пробл.

криобиологии.– 2001.– №2.– С. 72–79.

Розанов Л.Ф., Высеканцев И.П., Петренко Т.Ф. и др.

Чувствительность клеток перевиваемой клеточной ли-

нии СПЭВ и грибов Candida albicans к процессам вне- и

внутриклеточной кристаллизации // Пробл. криобио-

логии.– 2004.– №3.– С. 18–25.

Смольянинова Е.И., Погорелов А.Г., Лисина Е.Г. и др.

Влияние среды замораживания на жизнеспособность и

катионный состав ранних эмбрионов мыши // Пробл.

криобиологии.– 2005.– Т. 15, №3.– С. 310.

Поступила 15.01.2008

Рецензент А.В. Зинченко

References

Gordiyenko E.A., Pushkar N.S. Physical grounds of low tem-

perature preservation of cell suspensions.– Kiev: Naukova

dumka, 1994.– 142 p.

Gordiyenko O.I., Linnik T.P. Penetration mechanisms of non-

electrolytes of diols’ series via erythrocyte membranes //

Biophysical Bulletin. – 2002.– Issue 2.– P. 43–47.

Zakharov A.F. Late reduplication of chromosomes in cultured

cells of Chinese hamster // Tsitologiya.– 1966.– Vol. 8, N 2.–

P. 201–207.

Kovalenko G.V., Kovalenko I.F., Linnik T.P. Membrane

permeability of rat’s and rabbit’s erythrocytes to cryoprotec-

tants of amides and diols series // Problems of Cryobiology.–

2007.– Vol. 17, N4.– P. 365–373.

Kovalenko I.F., Koschiy S.V., Timofeyeva E.V. et al. Per-

meability of SPEV cell membranes to molecules of water and

dimethyl sulfoxide // Problems of Cryobiology.– 2009.–Vol. 19,

N1.– 25–31.

Cryobiology and cryotechnology / Ed. by A.A. Tsutsayeva.–

Kiev: Naukova dumka, 1987. – 216 p.

Linnik T.P., Bizikina O.V. Fowl sperm cryopreservation. 1.

Cytotoxicity of diols and amides // Problems of Cryobiology.–

2001.– N 2.– P. 72–79.

Rozanov L.F., Vysekantsev I.P., Petrenko T.F. et al. Sensitivity

of cells of inoculated cells line of SPEV and Candida albicans

fungi to processes of extra- and intracellular crystallization //

Problems of Cryobiology.– 2004.– N3.– P. 18–25.

Smolyaninova E.I., Pogorelov A.G., Lisina E.G. et al. Effect

of freezing medium on viability and cation composition of

murine early embryos // Problems of Cryobiology.– 2005.–

Vol. 15, N3.– P. 310.

Accepted in 15.01.2008

143

УДК 612.11.014.43.017

Â.Ã. ÁÀÁÈÉ÷ÓÊ

Êîëè÷åñòâåííàÿ îöåíêà àíòèãåí-ñïåöèôè÷åñêèõ êëåòîê â êðîâè

÷åëîâåêà ïîñëå ðèòìè÷åñêèõ õîëîäîâûõ âîçäåéñòâèé

UDC 612.11.014.43.017

V.G. BABIJCHUK

Quantitative Estimation of Antigen-Specific Cells in Human

Blood After Rhythmic Cold Effect

В крови мужчин 50–60 лет проведено иммунофенотипирование лимфоцитов крови, определено содержание специ-

фических групп с помощью экспрессирующих фенотипических маркеров на проточном цитофлюориметре после РХВ.

Показано, что клетки адаптивного иммунитета обладают уникальными характеристиками благодаря расположенным на их

поверхности узкоспециализированных рецепторов. Установлено, что 9 сеансов РХВ существенно улучшают функцию

иммунной системы, что способствует усилению адаптации организма к действию неблагоприятных факторов.

Ключевые слова: ритмические холодовые воздействия, клеточное и гуморальное звено иммунной системы, фенотипические

маркеры, лейкоциты.

У крові чоловіків 50–60 років проведені імунотипізування лімфоцитів крові, аналіз вмісту специфічних груп за допомогою

експресуючих фенотипових маркерів на проточному цитофлюориметрі після РХВ. Показано, що клітини адаптивного імунітету

мають унікальні характеристики завдяки розміщенню на їх поверхні вузькоспеціалізованих рецепторів. Встановлено, що 9

сеансів РХВ значно покращують функцію імунної системи, що підвищує адаптацію організму до дії несприятливих факторів.

Ключові слова: ритмічні холодові впливи, клітинне і гуморальне кільце імунної системи, фенотипові маркери, лейкоцити.

There was performed an immune phenotyping of blood lymphocytes in 50–60 years’ men blood, the content of specific groups

was determined with expressing phenotypic markers using flow cytometer after rhythmic cold efects. Cells of adaptive immunity were

shown to have the unique characteristics due to the single-functioned receptors, locating on their surface. Nine RCE sessions were

established to significantly improve the immune system function, contribute to strengthening of organism’s adaptation to the effect of

unfavourable factors.

Key-words: rhythmic cold effects, cell and humoral link of immune system, phenotypic markers, leukocytes.

* Àäðåñ äëÿ êîððåñïîíäåíöèè: óë. Ïåðåÿñëàâñêàÿ, 23,

ã. Õàðüêîâ, Óêðàèíà 61015; òåë.:+38 (057) 373-38-07, ôàêñ: +38

(057) 373-30-84, ýëåêòðîííàÿ ïî÷òà: cryo@online.kharkov.ua

Èíñòèòóò ïðîáëåì êðèîáèîëîãèè è êðèîìåäèöèíû

ÍÀÍ Óêðàèíû, ã. Õàðüêîâ

* Address for correspondence: 23, Pereyaslavskaya str., Kharkov,

Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 3807, fax: +380 57 373 3084,

e-mail: cryo@online.kharkov.ua

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-

tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine

The role of immune system in such problems as

longevity, life quality and human health is very difficult

to be overestimated. This system provides an early and

reliable protection against the effect of environmental

pathogens due to triggering integral protective mecha-

nisms against pathogen [1, 8]. Obviously, the variety

of immune protection factors, formed during evolution,

being in antagonism or synergism with antigen,

providing either its elimination or “peaceful” coexisten-

ce, are necessary for immune system functioning [4].

Moreover the antigen “strategy” in host organism plays

an important role in disease development, because of

possibility to get a “hidden presence” form. In this case

the immune system does not recognise pathogen, but

in more aggressive way it either damages the mecha-

nisms of immune protection or uses them for its pur-

poses [9].

The function of immune system, as another vital

systems, is subjected to dynamic changes. The orga-

nism ageing is generally accompanied by a decrease

in the efficiency of its activity, resulting in an increase

in risk of disease occurrence. Changes in functioning

Очень трудно переоценить роль иммунной

системы в проблеме долголетия, качества жизни

и здоровья человека. Эта система обеспечивает

раннюю и надежную защиту от действия болезне-

творных агентов внешней среды за счет включе-

ния полноценных механизмов защиты против

возбудителя [1, 8]. Очевидно, для функциониро-

вания иммунной системы необходимы выработан-

ные в ходе эволюции многообразные факторы им-

мунной защиты, которые действуют в антагонизме

или синергизме с возбудителем, обеспечивая или

его илиминацию, или “мирное” сосуществование

[4]. Причем “стратегия” возбудителя в организме

хозяина играет важную роль в развитии болезни,

так как может приобретать форму “тайного при-

сутствия”. В этом случае патоген не распознается

иммунной системой, а в более агрессивной форме

он повреждает механизмы иммунной защиты или

использует их в своих интересах [9].

Функция иммунной системы, как и других жиз-

ненно важных систем, подвержена динамическим

изменениям. Старение организма, как правило,

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

144

of immune system in aged people were established to

be one of the main causes of ageing, moreover a

congenital immunity suffers less, than an adaptive one.

Evidently, under age changes the process of a balanced

immune deficiency is in progress, when the function

of different immune system links is damaged. Conse-

quently, the problem of human life prolongation is tightly

related to the state of immune status, search for an

efficient therapy, which might contribute to correct

disorders in both congenital and adaptive immunities.

We may suggest, that in order to postpone ageing it is

necessary to find out the way to increase the activity

of weakened immune functions.

An extreme cryotherapy may be used as the mean of

medical rehabilitation after many diseases. In this regard

of especial efficiency are the rhythmic cold effects

(RCE). Extreme temperatures (–120°C) improve meta-

bolic processes and vegetative functions, stimulate the

immunity, that is very important for aged persons [2].

General cooling of human organism is successfully

applied for variuos diseases, including those based on

disorders in immune system functioning.

In available literature there are no system resear-

ches of immune system state after low temperature

effect on organism.

The research was aimed to study the RCE effect

on quantitative characteristics of lymphocyte popula-

tions in human blood.

Materials and methods

There were examined 10 patients-volunteers of 50–

60 years old with no contraindications in anamnesis

for RCE application.

Patients were cooled down in cryochamber (“Kho-

lod” JSC, Kiev) at –115°C operative temperature. Prior

to and after the procedure for patients we measured

the pulse, arterial pressure, respiratory frequency, body

temperature, the electrocardiogram was recorded.

Patients received 9 sessions according to the methods

reported [2].

As the norm indices there were admitted those of

immunity of healthy volunteers of 25–35 years old.

For lymphocyte immune phenotyping, when

determining the content of specific groups of these

cells, we used the expressing phenotype markers.

Stained cells were analysed with flow cytometer

FACS Calibur (BD Biosciences, USA) using CellQuest

Pro software (BD Biosciences, USA).

Results were statistically processed with the

Student-Fisher method.

Results and discussion

In aged people there is a change in thymus-

dependent link of immune system and, particularly,

population of developing T-cells, accomplishing some

key functions during immune response. As cells of

сопровождается снижением эффективности ее дея-

тельности, в результате чего повышается риск воз-

никновения заболеваний. Установлено, что измене-

ния в функционировании иммунной системы у

людей старшего возраста являются одной из основ-

ных причин старения, причем врожденный им-

мунитет страдает в меньшей степени, чем адап-

тивный. Очевидно, при возрастных изменениях

развивается процесс сбалансированного иммуно-

дефицита, при котором нарушается функция раз-

личных звеньев иммунной системы. Следователь-

но, проблема продления жизни человека тесно

связана с состоянием иммунного статуса, поиском

эффективной терапии, которая способствовала бы

коррекции нарушений как врожденного, так и адап-

тивного иммунитета. Можно предположить, что

для отсрочки старения необходимо найти способ

повышения активности ослабленных функций

иммунитета.

Экстремальная криотерапия может использо-

ваться как средство медицинской реабилитации

после многих заболеваний. Особенно эффектив-

ными в этом отношении являются ритмические

холодовые воздействия (РХВ). Экстремальные

температуры (–120°С) улучшают обменные про-

цессы и вегетативные функции, стимулируют им-

мунитет, что очень важно для лиц пожилого возрас-

та [2].

Успешно применяется общее охлаждение орга-

низма человека при различных заболеваниях, в том

числе в основе которых лежат нарушения функции

иммунной системы.

В доступной литературе системные исследова-

ния состояния иммунной системы после действия

на организм низких температур отсутствуют.

Цель работы – исследовать влияние РХВ на

количественные характеристики популяций лимфо-

цитов в крови людей.

Ìàòåðèàëû è ìåòîäû

Обследованы 10 пациентов-добровольцев 50–

60-летнего возраста, в анамнезе которых отсутст-

вовали противопоказания к применению РХВ.

Охлаждение пациентов проводили в криокамере

производства ОАО “Холод” (Киев) при рабочей

температуре –115° С. Перед и после процедуры

пациентам измеряли пульс, артериальное давление,

частоту дыхания, температуру тела, записывали

электрокардиограмму. Всего пациенты получали

9 процедур по методике [2].

В качестве показателей нормы принимали пока-

затели иммунитета здоровых 25–35-летних добро-

вольцев .

Для иммунофенотипирования лимфоцитов при

определении содержания специфических групп

этих клеток использовали экспрессирующие фено-

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

145

adaptive immunity, lymphocytes are characterised by

the presence of single-functioned receptors on their

surface, enabling each cell to respond to an antigen,

by the capability of recirculation from tissue into blood

flow, a long-term life duration, that is the base for

immune memory and specificity.

During ageing the number of immune system cells

may vary, meanwhile their functional activity reduces,

that is mostly the result of T-lymphocyte function

failure.

As known [5], T-lymphocytes in thymus come

through some consequent stages, during which there

are formed T-cell receptors, designated to recognise

the antigen, as well as T-helpers (CD4

) and cytotoxic

cells (CD8

CD4

T-cell presence as part of T-lymphocytes is

one of the most important protective mechanisms, since

CD4

T-helpers stimulate antibody production by

B-lymphocytes and activate CD8

as well.

CD4-receptor represents a transmembrane glyco-

protein, expressing on T-lymphocytes. The main

mission of CD4

lymphocytes is the induction activation

and “helping” in immunoglobulin synthesis by B-cells.

There was revealed a statistically significant decrease

in CD4

cell content in blood of observed patients com-

pared to the norm (Fig. 1). After 9 RCE sessions by

the described technique, the total number of CD4

cells

in patients’ blood considerably augments and corres-

ponds to the normal indices, typical for people of

reproductive age.

A decrease in the number of CD4

T-lymphocytes,

migrating from thymus, is possibly accompanied by the

reduction of a number of specific receptors, resulting

in disorders of its function.

CD8-receptor is expressed on the subpopulation

of cytotoxic T-lymphocytes, which frequently co-

express CD4-receptor

and represents a disulfide

bound dimer. Antigen-specific CD8

cells play an

important role in immune suppression and destroying

different viral infections as well [11, 12]. A part of

CD8

-cells is the pool of “naive” T-lymphocytes,

entering blood and peripheral lymphoid organs from

thymus.

Of note is also the fact, that after final differen-

tiation T-cells, carrying CD4 and T-cytotoxic lympho-

cytes (CD8

), form the memory cell subpopulation

(CD45RO

). A decrease in the content of CD4

the background of CD8

cell content rise is a bad

prognostic sign in old people (80–90 years old), because

it characterises the complex of changes in immune

system.

The Fig. 2 shows no observed statistically significant

changes of CD8

cell content in blood, but there was

traced the dynamics of their decrease in respect to

the control.

In the experiments (Fig. 3) the ratio of CD4

CD8

cell content remained statistically and signifi-

типические маркеры. Окрашенные клетки анали-

зировали на проточном цитофлуориметре FACS

Calibur (BD Biosciences, США) с использованием

программного обеспечения CellQuest Pro (BD

Biosciences, США).

Для статистической обработки результатов

использовали метод Стьюдента-Фишера.

Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå

У людей преклонного возраста изменяется

тимусзависимое звено иммунной системы и, в

частности популяция развивающихся Т-клеток,

выполняющих ряд ключевых функций при иммун-

ном ответе. Как клетки адаптивного иммунитета

лимфоциты характеризуются наличием на их

поверхности узкоспециализированных рецепторов,

позволяющих каждой отдельной клетке реагиро-

вать на антиген, способностью рециркуляции из

тканей в кровоток, длительной продолжитель-

ностью жизни, что является основой иммунной

памяти и специфичности.

В процессе старения численность клеток им-

мунной системы может не изменяться, тогда как

их функциональная активность снижается, что в

значительной степени является результатом недо-

статочности функции Т-лимфоцитов.

Как известно [5], в тимусе Т-лимфоциты прохо-

дят ряд последовательных стадий, в процессе

которых формируются Т-клеточные рецепторы,

предназначенные для распознавания антигена, в

том числе образуются Т-хелперы (СD4

-клетки)

и цитотоксические клетки (СD8

-клетки).

Наличие СD4

-клеток в составе Т-лимфоци-

тов – один из важнейших механизмов защиты, так

как СD4

– Т-хелперы стимулируют продукцию

антител В-лимфоцитами, а также активируют

СD8

-клетки.

СD4-рецептор представляет собой трансмем-

бранный гликопротеин, который экспрессирован на

Т-лимфоцитах. Основное назначение СD4

-лимфо-

цитов – активация индукции и “помощи” в синтезе

иммуноглобулинов В-клетками. Выявлено дос-

товерное снижение содержания СD4

-клеток в

крови наблюдаемых пациентов по сравнению с

нормой (рис. 1). После 9 процедур РХВ по опи-

санной методике общее количество СD4

-клеток

в крови пациентов существенно увеличивается и

соответствует показателям нормы, характерным

для людей репродуктивного возраста.

Возможно, снижение численности СD4

– Т-

лимфоцитов, мигрирующих из тимуса, сопровож-

дается уменьшением количества специфических

рецепторов, результатом чего могут быть наруше-

ния его функции.

СD8-рецептор экспрессируется на субпопуля-

ции цитотоксических Т-лимфоцитов, которые часто

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

146

Содержание клеток, %

Cell content, %

Содержание клеток, %

Cell content, %

Рис. 1. Популяция CD4

-лимфоцитов в крови: – норма;

– до охлаждения; – после охлаждения.

Fig. 1. CD4

cell population in blood: – norm; – before

cooling; – after cooling.

Рис. 2. Популяция CD8

-лимфоцитов в крови: – норма;

– до охлаждения; – после охлаждения.

Fig. 2. CD8

cell population in blood: – norm; – before

cooling; – after cooling.

cantly unchanged in respect of the norm, but signifi-

cantly increased after 9 RCE sessions, that might be

envisaged as a compensatory response to a possible

weakening of T-lymphopoiesis in thymus, since the

activation of CD4

and CD8

cells is suppressed with

age.

Weakening of T-cell functional capability during

ageing is possibly associated to a change in molecular

mechanisms of triggering of activation signals, phospho-

rylation processes, disorder of interleukine secretion,

weakening of transcription protein formation, that

creates the conditions for T-cell activation decrease.

These changes are more pronounced in the “naive”

and in CD4

cells, than in memory and CD8

ones,

correspondingly.

Obviously, RCE may be the factor, resulting in the

activation of immunogenesis, declining in old age,

accompanied with a manifested compensation, mostly

typical for young organism.

коэкспрессируют СD4-рецептор и представляет

собой дисульфидно связанный димер. Антиген-

специфические СD8

-клетки играют важную роль

в иммуносупрессии и в уничтожении различных

вирусных инфекций [11, 12]. Некоторая часть

СD8

-клеток представляет пул “наивных” Т-лим-

фоцитов, которые поступают в кровь и перифери-

ческие лимфоидные органы из тимуса.

Следует также отметить, что после оконча-

тельной дифференцировки Т-клетки, несущие СD4

и Т-цитотоксические лимфоциты (СD8

), форми-

руют субпопуляцию клеток памяти (СD45RO

Снижение содержания СD4

- на фоне повышения

уровня СD8

-клеток является плохим прогности-

ческим признаком у людей 80–90 лет, так как харак-

теризует комплекс изменений иммунной системы.

Как видно из рис. 2, достоверных изменений в

крови содержания СD8

-клеток не наблюдалось,

однако прослеживалась динамика их уменьшения

по отношению к норме.

В экспериментах (рис. 3) отношение содержа-

ния СD4

-клеток к СD8

-клеткам достоверно не

изменялось по отношению к норме, однако сущест-

венно повышалась после 9 сеансов РХВ, что

можно рассматривать как компенсаторную реак-

цию на возможное ослабление Т-лимфопоэза в

тимусе, так как активация СD4

- и СD8

-клеток с

возрастом подавляется.

Ослабление функциональной способности

Т-клеток в процессе старения возможно связано с

изменением молекулярных механизмов запуска

активационных сигналов, процессов фосфорилиро-

вания, нарушением секреции интерлейкинов, ослаб-

лением формирования транскрипционных белков,

что создает условия для снижения активации

Т-клеток. Эти изменения в “наивных” клетках вы-

ражены сильнее, чем в клетках памяти, в СD4

клетках сильнее, чем в СD8

-клетках.

Очевидно, РХВ могут быть фактором, приводя-

щим к активации угасающего в старости иммуно-

генеза, сопровождающегося выраженной компен-

сацией, в большей степени характерной для моло-

дого организма.

Одним из наиболее общих (интегральных) мар-

керов Т-лимфоцитов является СD3, который

представляет собой комплекс полипептидных

цепей, включающий Т-клеточный рецептор, кото-

рый присутствует на зрелых клетках. Одно из

свойств СD3

-клеток – активация других субпо-

пуляций Т-лимфоцитов. В процессе старения чело-

века количество “наивных” (СD3

СD45RA

), не

успевших проконтактировать с антигеном Т-лим-

фоцитов, снижается значительно быстрее, чем

Т-клеток памяти (СD3

СD45RО

), которые с воз-

растом практически не меняются за счет повтор-

ных контактов с антигенами. Подобными свойст-

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

147

0.5

1.5

2.5

3.5

4.5

Содержание клеток, %

Cell content, %

Рис. 3. Популяция CD4

/CD8

-лимфоцитов в крови: –

норма; – до охлаждения; – после охлаждения.

Fig. 3. CD4

/CD8

cell population in blood: – norm; –

before cooling; – after cooling.

One of the most common markers of T-lympho-

cytes is CD3, representing the complex of polypeptides

chains, including T-cell receptor, being present on

mature cells. One of CD3

cell effect is activation of

other T-lymphocyte subpopulations. During ageing the

number of “naive” (CD3

CD45RA

) T-lymphocytes,

failed to contact with antigen, reduces much more

rapidly, than memory T-cells (CD3

CD45RO

), not

practically changed with age due to the repeated

contacts with antigens. The similar properties are

intrinsic to cells comprising CD5 receptor, being present

on mature T-lymphocytes (their principal function is

thymocyte co-stimulation and activation), as well as

on mature B-cell membrane. CD3 and CD5 membrane

antigens are one of the earliest T-cell markers, which

differentiation is realised in bone marrow.

The data presented in Fig. 4 testify to a decrease

in CD3

cell content in the examined patients in respect

of the norm and an increase in their phenotype after 9

cryotherapeutic sessions. The same tendency (Fig. 5)

was typical for interpreting functional properties of

CD5

cells, though the changes in this case were not

statistically significant.

At an early stage of B-lymphocyte differentiation,

there is occurred an initial stage of immunoglobulin

gene rearrangement with the CD19 receptor appearan-

ce on membrane, that is necessary to form specific

receptor immunoglobulins for a selective expression

of membrane and cytoplasmic markers. These proces-

ses occur in bone marrow, where B-lymphocytes come

through the stage of antigen-dependent differentiation.

The CD19 is the common marker for all B-lympho-

cytes, because of not expressing on cells of other types

and participating in cell activation (Fig. 6). The presen-

ce of CD19 marker on a membrane corresponds to

the mature B-lymphocyte, after that a cell gets the

вами обладают клетки, содержащие СD5-рецеп-

тор, который присутствует на зрелых Т-лимфоци-

тах (их основная функция костимуляция и актива-

ция тимоцитов), а также на мембране зрелых В-

клеток. Мембранные антигены СD3 и СD5 яв-

ляются одним из наиболее ранних Т-клеточных

маркеров, дифференцировка которых осущест-

вляется в костном мозге.

Представленные на рис. 4 данные свидетельст-

вуют о снижении содержания СD3

-клеток у наб-

людаемых пациентов по отношению к норме и уве-

личении их фенотипа после 9 сеансов криотерапии.

Такая же тенденция (рис. 5) была характерна для

интерпретации функциональных свойств клеток

СD5

, хотя изменения в данном случае были ста-

тистически недостоверными.

На ранней стадии дифференцировки В-лимфо-

цитов происходит начальный этап перестройки

генов иммуноглобулинов с появлением на мембра-

не СD19-рецепторов, что необходимо для формиро-

вания специфических рецепторов-иммуноглобули-

нов для избирательной экспрессии мембранных и

цитоплазматических маркеров. Эти процессы

осуществляются в костном мозге, в котором

В-лимфоциты проходят этап антигеннезависимой

дифференцировки.

СD19 является общим маркером для всех

В-лимфоцитов, так как не экспрессируется на

клетках других типов и участвует в активации кле-

ток (рис. 6). Присутствие на мембране СD19-мар-

кера соответствует зрелому В-лимфоциту, после

чего клетка приобретает способность взаимодей-

ствовать с антигеном. После этого В-клетка поки-

дает костный мозг и приобретает свойства перифе-

рических В-клеток, основной функцией которых яв-

ляется реализация гуморально-иммунного ответа.

При иммунном ответе антитела нейтрализуют

свободные антигены, образуя иммунные комп-

лексы, активируют комплемент с помощью сыво-

роточного фактора опсонина (иммуноглобулин G),

обладающего свойствами соединяться с попавши-

ми в организм человека бактериями, повышать их

восприимчивость к действию фагоцитов и естест-

венных киллеров, которые их уничтожают.

У наблюдаемых пациентов содержание СD19

клеток было значительно ниже, чем в норме, что

является основанием для предположения снижения

его содержания с возрастом. Очевидно, РХВ не

приводили к существенным изменениям содержа-

ния СD19

-клеток в крови.

Экспрессия СD72 также характерна для иден-

тификации клеток, содержание которых в крови

наблюдаемых пациентов было ниже, чем в норме,

но не изменялось после проведенной экстремаль-

ной криотерапии (рис. 7).

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2

148

Содержание клеток, %

Cell content, %

Содержание клеток, %

Cell content, %

Рис. 4. Популяция CD3

-лимфоцитов в крови: – норма;

– до охлаждения; – после охлаждения.

Fig. 4. CD3

cell population in blood: – norm; – before

cooling; – after cooling.

Рис. 5. Популяция CD5

-лимфоцитов в крови: – норма;

– до охлаждения; – после охлаждения.

Fig. 5. CD5

cell population in blood: – norm; – before

cooling; – after cooling.

capability to interact with antigen. Afterwards B-cell

leaves bone marrow and acquires properties of

peripheral B-cells, which principal function is to realise

a humoral-immune response. During immune response

the antibodies neutralise free antigens, by forming

immune complexes, activate the complement by means

of opsonin serum factor (immunoglobulin G), having

the property to bind with bacteria, entering human

organism, increase their susceptibility to the effect of

phagocytes and natural killers, destroying them.

The CD19

cell content was much lower in the

examined patients, than in the norm, that enabled

suggesting about a decrease in its content with age.

Obviously, RCE did not result in significant changes of

CD19

cell content in blood serum.

The CD72 expression is typical for identifying cells,

which content in blood of the observed patients was

lower, than in the norm, but remained unchanged after

performed extreme cryotherapy (Fig. 7).

The activity of natural killer (NK) cells in humans

reduces with age. Much lower content of these cells

is formed as a responce to external stimulus in aged

people (Fig. 8).

In peripheral blood the NK cells, represent from 5

to 25% lymphocytes and cause a cytotoxic effect on

virus infected cells, they are deprived of T- and B-cell

markers. Cytoplasm of these cells comprises perforin,

protein, furthering the pore formation in cell-target

membranes, as well as enzymes, causing apoptosis

induction. Thus, the main function of natural killers is

a discharge of signal molecules, triggering apoptosis in

cell-targets with following contact cytolysis.

In the performed researches there was noted a

decrease in NK cell content in respect of the norm,

but after cold procedures the dynamics of their content

increase is distinctly traced, that might be explained

Рис. 6. Популяция CD19

-лимфоцитов в крови: – норма;

– до охлаждения; – после охлаждения.

Fig. 6. CD19

cell population in blood: – norm; –

before cooling; – after cooling.

Содержание клеток, %

Cell content, %

Активность клеток – натуральных киллеров

(НК) у людей снижается с возрастом. У пожилых

людей в ответ на внешний стимул образовывается

гораздо меньшее количество количество этих кле-

ток (рис. 8).

В периферической крови НК-клетки состав-

ляют от 5 до 25% лимфоцитов и оказывают цито-

токсическое действие на инфицированные вирусом

клетки, они лишены маркеров Т- и В-клеток.

Цитоплазма этих клеток содержит перфорин –

белок, который способствует образованию пор в

мембранах клеток-мишеней, а также ферменты,

вызывающие индукцию апоптоза. Таким образом,

основной функцией естественных киллеров являет-

ся выброс сигнальных молекул, включающих апоп-

тоз в клетках-мишенях с последующим контакт-

ным цитолизом.

PROBLEMS

OF CRYOBIOLOGY

Vol. 19, 2009, ¹2

ÏÐÎÁËÅÌÛ

ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ

Ò. 19, 2009, ¹2