Тимощенко Л.В., Чубик М.В. Основы микробиологии и биотехнологии: учебное пособие

Подождите немного. Документ загружается.

171

Воздействие грибного препарата на насекомое начинается с про-

никновения споры гриба в полость его тела через кожные покровы. По-

пав в тело насекомого, грибная спора прорастает в гифу, затем разраста-

ется в мицелий, от которого отчленяются гифальные тельца – конидии,

составляющие инфекционную единицу энтомопатогенных грибов. Как

правило, гибель наступает от большого количества токсинов, выделяю-

щихся грибами. Если же токсинов недостаточно либо насекомое не чув-

ствительно к ним, гибель наступает после того, как нитевидный мице-

лий заполняет все тело насекомого, поражая, прежде всего, мышечную

ткань. В зависимости от размеров насекомого гибель наступает в пери-

од от двух до восьми дней.

В России производится грибной препарат боверин на основе гриба

рода Beauveria. Этот препарат применяют для уничтожения около 60-ти

видов насекомых-вредителей, преимущественно жуков. Он безвреден

для теплокровных животных и человека, не вызывает ожогов у расте-

ний.

Получают боверин с помощью как глубинного, так и поверхност-

ного культивирования промышленного штамма гриба.

Получение боверина методом глубинного культивирования

Получение боверина этим методом осуществляют в строго асепти-

ческих условиях. В состав питательной среды входят следующие ком-

поненты (в %): дрожжи кормовые – 2; крахмал – 1; хлорид натрия – 0,2;

хлорид марганца – 0,01; хлорид кальция – 0,05. Продолжительность

культивирования составляет трое–четверо суток при температуре 25–

С. Выращивание гриба проводят в условиях постоянного перемеши-

вания и принудительной аэрации. В ходе глубинного культивирования

гриба в течение первых суток–полтора кормовые дрожжи полностью

лизируются, а гриб за это время проходит все фазы своего роста. К кон-

цу полного созревания гриба выделяется максимальное количество

ферментов, что ведет к лизису мицелия и способствует накоплению ко-

нидий. Готовую культуральную жидкость подвергают сепарации или

фильтрации. После фильтрования получают пасту влажностью 70–80 %,

которую направляют на распылительную сушилку. Высушенные споры

представляют собой мелкодисперсный порошок влажностью 10 %. По-

лученный порошок стандартизуют необходимым количеством каолина,

иногда в качестве добавок в готовый препарат вводят смачиватель и

прилипатель.

Технология получения боверина методом поверхностного

культивирования гриба

172

Этот способ более длителен и трудоемок, поэтому имеет ограни-

ченное применение. Поверхностное культивирование гриба проводят

как в жидкой питательной среде, так и на полутвердых, на этих средах

гриб обладает хорошей скоростью роста. Его микробиологическое про-

изводство завершается на стадии получения спороносной пленки, кото-

рую впоследствии снимают, высушивают, измельчают и при необходи-

мости стандартизуют соответствующим количеством наполнителя. Сре-

ди возможных приемов, используемых в производстве боверина поверх-

ностным культивированием, различают: а) культивирование гриба на

жидких средах без автоклавирования, перемешивания и аэрации; б)

культивирование на твердых автоклавированных средах без перемеши-

вания и аэрации. Эти приемы основаны на том, что гриб хорошо растет

на различных растительных субстратах – отходах сельскохозяйственной

продукции.

Культивирование гриба на жидких средах без автоклавирования,

перемешивания и аэрации проводят без предварительной стерилизации

среды, ее просто нагревают до кипения, разливают в деревянные карка-

сы, покрытые изнутри полиэтиленовой пленкой. Среду, охлажденную

до 30–40

С, засевают сухими спорами. Сверху каркасы накрывают по-

лиэтиленовой пленкой, которую после образования спороносной пленки

гриба снимают. В качестве сред используют всевозможные отвары, на-

пример: из сахарной свеклы, картофеля, тыквы, зерна, муки.

В процессе культивирования гриба на твердых автоклавированных

средах без перемешивания и аэрации предусматривается стерилизация

размещенных по отдельным емкостям питательных сред (сусло–агар,

картофель, морковь, кукуруза, корки арбуза) в течение сорока минут

при 110

С. В стерильный субстрат вносят сухие споры, емкости с суб-

стратом встряхивают до однородного распределения посевного мате-

риала и оставляют стоять при температуре окружающего воздуха 18–23

С. Образование конидиоспор завершается к концу 12–15 суток. Куль-

туру гриба с остатками субстрата извлекают из емкостей и высушивают

на стеллажах при 25–28

С. Получение готового препарата завершают

размолом материала до мелкодисперсного порошка.

5.1.3. Технология получения вирусных энтомопатогенных препаратов

Из всех энтомопатогенных препаратов вирусные обладают наибо-

лее высокой специфичностью по отношению к насекомому-хозяину:

обычно они поражают только один вид, поэтому они практически пол-

ностью безвредны для флоры, фауны и человека.

173

Вирусы отличает высокая устойчивость к неблагоприятным воз-

действиям окружающей среды (температуры, влажности), они способны

сохранять свою активность в течение 10–15 лет, находясь вне насекомо-

го.

Заражение насекомого вирусом происходит при питании вредите-

ля. Попавшие в кишечник вирионы проникают в клетки организма, и в

ядрах этих клеток происходит репликация вирусов. Высвободившиеся

вирусы поражают другие клетки до тех пор, пока насекомое не погиб-

нет.

Отличительной особенностью производства вирусов является то,

что они размножаются только в живой ткани. Поэтому производство

любого вирусного препарата отличается от рассмотренных бактериаль-

ных препаратов.

Технология любого из вирусных препаратов начинается с разведе-

ния насекомого-хозяина на искусственных питательных средах, обеспе-

чивающих их физиологически здоровое состояние. На определенной

стадии развития (обычно на стадии гусеницы) насекомых заражают, до-

бавляя вирусную суспензию к корму. При этом инокулят предваритель-

но получают от нескольких больных личинок. После выдержки, для

максимального накопления вирусов в тканях насекомого (7–9 суток),

собирают отмершие личинки, подсушивают их при 30–35

С, измель-

чают механическим способа для вывода телец-включений из тканей. К

полученной массе добавляют физиологический раствор или дистилли-

рованную воду из расчета 1 мл на гусеницу, перемешивают и фильтру-

ют (центрифугируют).

Готовые препараты изготовляют в виде водных растворов, масля-

ных растворов, сухих порошков, паст и т. п.

5.2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ УДОБРЕНИЯ

Присутствующая в почве микрофлора оказывает непосредственное

влияние на ее плодородие, а, следовательно, и на повышение урожайно-

сти. Почвенные микроорганизмы в процессе роста и развития улучшают

структуру почв, накапливают в них питательные вещества, превращая

органические и неорганические соединения в легкоусвояемые расте-

ниями компоненты питания.

С целью стимулирования деятельности почвенной микрофлоры

разработаны различные бактериальные удобрения. В практике сельского

хозяйства нашли применение такие бактериальные удобоения, как нит-

рагин, азотобактерин и фосфоробактерин.

174

5.2.1. Технология получения сухого нитрагина

Нитрагин – бактериальное удобрение, приготовленное на основе

жизнеспособных клубеньковых бактерий из рода Rhizobium и предна-

значенное для повышения урожая бобовых растений: гороха, фасоли,

сои, люцерны, люпина и др. Бактерии способны фиксировать свобод-

ный азот атмосферы, превращая его в легкоусвояемые растениями со-

единения, поскольку в их организмах есть фермент – нитрогеназа. Нит-

рогеназа восстанавливает молекулярный азот до аммиака, который во-

влекается затем в ряд превращений с образованием глутамина и глута-

миновой кислоты. Эти кислоты в дальнейшем идут на синтез расти-

тельного белка. Этот процесс возможен только в симбиозе с бобовыми

растениями: растение обеспечивает бактерии необходимыми питатель-

ными веществами и создает для них оптимальные условия существова-

ния, а бактерии, находясь в клубеньках, проросших в корни растения,

снабжают его азотистым питанием. Ни растения, ни бактерии сами по

себе не могут фиксировать азот.

В почве всегда есть некоторое количество клубеньковых растений,

которые располагаются на дикорастущих бобовых растениях. Однако

при засевании полей бобовыми монокультурами клубеньковых бакте-

рий оказывается недостаточно, вследствие чего растения снижают уро-

жайность. При этом минеральные азотистые удобрения оказываются в

данном случае бесполезными, поскольку азот усваивается только через

клубеньки. Поэтому производство бактериальных удобрений чрезвы-

чайно актуально.

Задачей конкретного производства бактериальных удобрений явля-

ется максимально возможное накопление жизнеспособных клеток, со-

хранение их жизнеспособности на всех стадиях технологического про-

цесса и приготовление на их основе готовых форм препаратов с сохра-

нением их активности в течение гарантийного срока.

Сухой нитрагин – порошок светло-серого или коричневого цвета,

который содержит в 1 г препарата не менее 9 млрд жизнеспособных

клеток в смеси с наполнителем (бентонитом, каолином, мелом и пр.).

Промышленное производство нитрагина построено по типичной

схеме асептического микробиологического процесса. «Узким» местом

является стадия высушивания, поскольку именно на этой стадии бакте-

рии могут потерять жизнеспособность из-за температурных воздейст-

вий. Поэтому сушку осуществляют под вакуумом при 30–35

С.

Для производства посевного материала исходную культуру клу-

беньковых бактерий выращивают сначала на агаризованной среде, со-

держащей, например, отвар семян бобовых растерий, 2 % агара и 1 %

сахарозы. На всех этапах промышленного культивирования применяют

175

питательную среду одного и того же состава, включающую такие ком-

поненты, как мелассу, кукурузный экстракт, минеральные соли в виде

сульфатов аммония и магния, мел, хлорид натрия и двухзамещенный

фосфат калия. Основную ферментацию проводят в течение двух–трех

суток при температуре 28–30

С и рН 6,5–7,5. Готовую культуральную

жидкость направляют на сепарацию, в результате которой отделяется

биомасса в виде пасты влажностью 70–80 %. Пасту смешивают с за-

щитной средой, имеющей различный состав, но всегда содержащей ме-

лассу и тиомочевину в соотношении 20:1, и направляют на высушива-

ние. Процесс сушки осуществляют в вакуум-сушильных шкафах при

30–35

С и остаточном давлении 10–13 кПа. Высушенную биомассу

размалывают.

Нитрагин способствует увеличению урожайности бобовых на 15–

25 %, а в районах, где бобовые засеваются впервые, – на 100 %. Вносят

препараты путем опудривания семян непосредственно перед посевом.

5.2.2. Технология получения сухого азотобактерина

Азотобактерин – бактериальное удобрение, приготовленное на ос-

нове культуры свободноживущего почвенного микроорганизма

Azotobacter chroococcum, способного фиксировать до 20 мг атмосферно-

го азота на 1 г использованного сахара. Кроме того, эти бактерии выде-

ляют в почву биологически активные вещества: никотиновую кислоту

(витамин PP), пантотеновую кислоту, пиридоксин, биотин (витамин H)

и некоторые фунгицидные вещества, угнетающие развитие нежелатель-

ных микроскопических грибов.

Все виды азотобактера – строгие аэробы. Бактерии этого вида

очень чувствительны к наличию фосфора и развиваются при высоком

содержании его в питательной среде. Технология получения азотобак-

терина имеет много общего с технологией производства нитрагина, по-

этому будут рассмотрены наиболее существенные отличия в его техно-

логии.

Культуру микроорганизмов выращивают методом глубинного

культивирования на среде, содержащей те же компоненты, что и при

культивировании Rhizobium. Дополнительно вводят сульфаты железа и

марганца, а также сложную соль молибденовой кислоты. РН среды

культивирования 5,7–6,5, аэрация – 1 объем воздуха на 1 объем среды в

1 мин.

Процесс ферментации проводят до начала стационарной фазы рос-

та культуры, так как в этой стационарной фазе биологически активные

вещества выделяются из клетки и остаются в культуральной жидкости.

176

При этом существует опасность, что с их выходом клетки могут утра-

тить способность фиксировать атмосферный азот после внесения в поч-

ву.

Биологически активные вещества полностью или частично могут

теряться и в процессе высушивания клеток, однако оставшиеся жизне-

способными клетки после выведения азотобактера из анабиоза восста-

навливают способность продуцировать биологически активные вещест-

ва.

Использовать препараты азотобактерина рекомендуется лишь в

плодородных почвах, содержащих фосфор и микроэлементы. Отсутст-

вие последних отрицательно сказывается на жизнедеятельности вноси-

мых бактерий. Применяют азотобактерин для бактеризации семян, рас-

сады, компостов. При этом улучшается корневое питание растений и на

10–15 % повышается урожайность зерновых, технических и овощных

культур.

5.2.3. Технология получения фосфоробактерина

Фосфоробактерин – бактериальное удобрение, содержащее споры

микроорганизма Bacillus phosphaticum. Бактерии обладают способно-

стью превращать сложные фосфорорганические соединения (нуклеино-

вые кислоты, нуклеопротеины и др.) и трудноусвояемые минеральные

фосфаты (пирофосфаты, полифосфаты) в доступную для растений фор-

му. Кроме того, они также вырабатывают различные биологически ак-

тивные вещества, в том числе витамины, стимулирующие рост расте-

ний, особенно на ранних стадиях их развития.

По морфологическим признакам Bac. phosphaticum представляет

собой мелкие, грамположительные, аэробные спорообразующие палоч-

ки.

Технология его получения мало отличается от таковой для нитра-

гина и азотобактерина.

Культуру Bacillus phosphaticum выращивают глубинным способом.

Состав питательной среды следующий (в %): кукурузный экстракт – 1,8;

меласса – 1,5; сульфат аммония – 0,1; мел – 1; вода – остальное. Культи-

вирование проводят в строго асептических условиях при постоянном

перемешивании и принудительной аэрации до стадии образования спор.

Основные параметры проведения процесса: температура – 28–30

С, рН

среды – 6,5–7,5; длительность культивирования – 1,5–2 суток. Получен-

ныю в ходе культивирования биомассу клеток отделяют центрифугиро-

ванием и высушивают в распылительной сушилке при 65–75

С до оста-

177

точной влажности 2–3 %. Высушенные споры смешивают с наполните-

лем (каолином).

В отличие от нитрагина и азотобактерина фосфоробактерин обла-

дает большей устойчивостью при хранении. Потеря жизнеспособности

клеток после 1 года хранения не превышает 20 %.

Следует отметить, что фосфоробактерин не заменяет фосфорные

удобрения, а резко увеличивает их эффективность, поэтому его вносят

вместе с фосфорными удобрениями. Фосфоробактерин рекомендуют

применять на черноземных почвах. Он необходим для повышения уро-

жайности зерновых, картофеля, сахарной свеклы и других сельскохо-

зяйственных растений.

ГЛАВА 6. ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

6.1. АЭРОБНАЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА СТОЧНЫХ ВОД

Бытовые и промышленные сточные воды представляют собой

сложную смесь, в состав которой входят различные питательные веще-

ства и самые разнообразные микроорганизмы, поэтому для обработки

стоков необходимо такие большое количество различных протистов.

Эти организмы конкурируют в потреблении питательных веществ,

уничтожают друг друга и взаимодействуют многими другими путями,

характерными для небольшой экологической системы.

В сточных водах содержится сложная смесь твердых и растворен-

ных веществ, причем последние обычно присутствуют в очень малых

концентрациях. На очистных станциях концентрации всех этих веществ

снижают до приемлемого уровня или же химически трансформируют

вредные вещества в безопасные соединения. Конкретная схема очист-

ной станции зависит от степени загрязненности и количества обрабаты-

ваемых стоков, а также от экономических и экологических соображе-

ний. Большая часть водоочистных станций, однако, имеет много обще-

го, что позволяет изобразить общую схему системы водоочистки, как на

рис. 6.2. Показанные здесь различные способы переработки ила и уда-

ления загрязняющих веществ отражают разные возможные пути дости-

жения одной и той же цели. В типичной станции по биологической очи-

стке сточных вод используются лишь некоторые из множества возмож-

ных вариантов.

Теперь перейдем к изучению общих задач и целей каждой из ос-

новных операций (или последовательностей нескольких операций). В

операциях первичной обработки удаляют наиболее легко отделяющиеся

178

загрязнения, например: крупные, легкоосаждающиеся частицы (рис.

6.1), масляные пленки и другие «легкие» компоненты. Суспендирован-

ные твердые частицы и растворимые компоненты отделяют в процессе

вторичной обработки. Во многих случаях загрязняющие вещества име-

ют органическую природу; в таких случаях обычно используют биоло-

гическое окисление, которое мы рассмотрим детальнее чуть позже.

Цель третичной обработки заключается в полном или частичном отде-

лении всех оставшихся примесей. На этой стадии используются такие

методы, как электродиализ, обратный осмос, фильтрование через тол-

стый слой и адсорбция.

В процессе первичной обработки отделяют влажные концентриро-

ванные твердые вещества, называемые илом; при вторичной обработке

образуется активный клеточный ил. Мы неоднократно упоминали о

взаимосвязи между утилизацией субстрата и образованием биомассы.

Хотя процессы вторичной биологической обработки с участием множе-

ства видов микроорганизмов очень эффективны при деградации разбав-

ленных смесей органических отходов, не следует забывать, что при

этом образуется и биомасса. Таким путем очень мелкие нерастворимые

частицы и растворенные компоненты жидких отходов частично пре-

вращаются в ил, который легче поддается отделению, чем исходные за-

грязняющие вещества. Установки для переработки ила являются важ-

ной составной частью станций по очистке сточных вод.

179

Рис. 6.1. Отделение твердых частиц различной величины на различных

стадиях очистки сточных вод

Для уменьшения объема ила, образующегося при очистке воды,

широко применяется операция анаэробной переработки, при которой

органические вещества подвергаются биологической деградации в ана-

эробном окружении.

Не следует думать, что во всех случаях используются все три уров-

ня очистки сточных вод и переработки ила. Иногда сточные воды спус-

кают в природные водоемы (ручьи, реки, пруды, озера и океан) без ка-

кой бы то ни было обработки. В других случаях применяют только пер-

вичную обработку. В то же время для большинства городских систем

водоочистки та или иная форма вторичной обработки является обяза-

тельной, а третичная обработка в настоящее время применяется лишь

изредка.

180

Отделение

тонкоизмель-

ченных сус-

пендированных

твердых веществ

Стерилизация

Отделение сле-

довых количеств

органических

веществ

неорганических

солей

Фильтрование

через слой

песка

Хлорирование

Электродиализ

Ионный

обмен

Упаривание

Вымораживание

Жидкостная

экстракция

Обратный

осмос

Отходы отработан-

ного реагента или

солевого раствора

ОЧИЩЕННАЯ

ВОДА

Фильтрование

через активиро-

ванный уголь

Фильтрование

через диатамовую

землю

Рис. 6.2. Типовые операции, применяющиеся для первичной, вторичной и третичной очистки сточных вод