Тимощенко Л.В., Чубик М.В. Основы микробиологии и биотехнологии: учебное пособие

Подождите немного. Документ загружается.

141

ращивании на качалках в течение двух–трех суток для каждой генерации

(3а и 3б). Из второй генерации культуры в колбе делают посев в не-

большой (10 л) инокулятор 4, после чего хорошо развившуюся культуру

переносят в более крупный инокулятор 5 (100–500 л), откуда и делают

посев в основной ферментатор 6. Для посева в основной ферментатор

используют от 5 до 10 % посевного материала (инокулята).

Развитие продуцента антибиотика в ферментаторах

Развитие микроорганизма в ферментаторах проходит при строгом

контроле всех его стадий и очень точном выполнении регламента усло-

вий развития. Большое внимание уделяют поддержанию заданной тем-

пературы культивирования, активной кислотности среды (рН), степени

аэрации и скорости работы мешалки. В процессе развития организма

осуществляют биологический контроль, учитывают потребление орга-

низмом основных питательных компонентов субстрата (источника угле-

рода, азота, фосфора), внимательно следят за образованием антибиоти-

ка. В последнее время все чаще биологический контроль проводят с по-

мощью ЭВМ.

Большое внимание при развитии продуцента в ферментаторах об-

ращают на процесс пеногашения. При продувании воздуха через куль-

туру микроорганизма образуется обильная пена, которая существенно

нарушает процесс развития продуцента антибиотика в ферментаторе.

Появление большого количества пены обусловлено белковыми вещест-

вами, находящимися в среде, и ее высокой вязкостью, что связано с

обильным накоплением биомассы.

Для борьбы с пеной в ферментаторах используют поверхностно-

активные вещества: растительные масла (соевое, подсолнечное), живот-

ный жир (лярд, кашалотовый жир), а иногда минеральные масла (вазе-

линовое, парафиновое), спирты и высшие жирные кислоты. Нередко в

качестве пеногасителей используют специально синтезированные веще-

ства (силиконы, диазобутананкарбамил и др.).

Многие вещества (масла, жиры, спирты и др.), используемые в ка-

честве пеногасителей, потребляются продуцентами антибиотиков как

дополнительные источники углеродного питания. При этом часто на-

блюдается повышение выхода антибиотика. Однако внесение пеногаси-

теля может снижать скорость растворения кислорода, что, в свою оче-

редь, отрицательно сказывается на развитии микроорганизма и его био-

синтетической активности.

Иногда используются механические способы пеногашения (отса-

сывание пены через специальные трубы, разрушение пузырьков пены

сильными струями жидкости, пара или газа).

142

Общая схема производства антибиотиков до стадии выделения и

химической очистки представлена на рис. 4.6.

Предварительная обработка культуральной жидкости, выделение и

химическая очистка антибиотиков

В процессе развития микроорганизмов образуемые им антибиотики

в большинстве случаев почти полностью выделяются из клеток в окру-

жающую среду. Однако в ряде случаев в культуральную жидкость попа-

дает лишь часть антибиотика, а другая часть сохраняется внутри клеток.

У ряда продуцентов антибиотик почти полностью содержится в

клетках организма. В зависимости от того, где антибиотическое вещест-

во сосредоточено, применяют соответствующие методы его извлечения.

Так, если антибиотик находится в культуральной жидкости, его выделя-

ют методами экстракции, используя для этого растворители, не смеши-

вающиеся с жидкой фазой, осаждают в виде нерастворимого соединения

или сорбируют ионообменными смолами. Если антибиотик содержится

в культуральной жидкости и в клетках продуцента, то сначала антибио-

тик переводят в фазу, из которой наиболее целесообразно его изолиро-

вать. Например, антибиотик, содержащийся в культуральной жидкости,

и клетки с антибиотическим веществом переводят в осадок, из которого

антибиотик экстрагируют.

143

Рис. 4.6. Схема производства антибиотиков:

I – приготовление посевного материала; II – инокуляторы для наращивания посев-

ного материала; III – стерилизатор среды для большого ферментатора; IV – установ-

ка для биосинтеза антибиотика; а – стерилизация среды в колбах; б – охлаждение и

посев культуры продуцента в колбу; в – рост культуры в покое; г – рост культуры в

качалке; д – инокулятор со стерильной средой; е – инокулятор со средой, засеянной

культурой продуцента; ж – фильтры и компрессор; з – резервуар со сжатым возду-

хом; и – нагрев воздуха; к – ферментатор;

л – рубашка для охлаждения ферментатора

Отделение нативного раствора от биомассы и взвешенных частиц

проводят методами фильтрации или центрифугирования.

Цель химической очистки – извлечение антибиотика из нативной

жидкости или из клеток продуцента, его концентрация и освобождение

(собственно, очистка) от сопутствующих примесей и в конечном счете

получение высокоочищенного препарата, пригодного для соответст-

вующего применения.

В ряде случаев антибиотические вещества под влиянием жестких

внешних факторов (повышенной температуры, высокой кислотности

144

или щелочности и др.) теряют свои свойства, инактивируются. Поэтому

при их выделении и очистке необходимо соблюдать максимум осторож-

ности.

Основные методы очистки антибиотиков следующие: экстракция,

ионообменная сорбция и осаждение.

Сушка, контроль и расфасовка препарата

После выделения и химической очистки антибиотика его необхо-

димо высушить, т. е. удалить из препарата свободную и связанную воду.

Поскольку большинство антибиотиков в той или иной степени термола-

бильны, для их высушивания применяют методы, не приводящие к по-

тере биологической активности, не изменяющие цвета препарата. На со-

временном этапе промышленного получения антибиотиков используют

следующие методы обезвоживания. Это:

·Лиофильная сушка антибиотиков – широко распространенный ме-

тод, он проводится при сравнительно низких температурах (-8 – -12

С).

·Высушивание с применением распылительной сушилки – про-

грессивный метод при работе с большими количествами антибиотика,

раствор антибиотика пневматически распыляется до мельчайших капель

в камере с потоком нагретого воздуха. Процесс высушивания антибио-

тиков занимает несколько секунд, при этом даже термолабильные пре-

параты не меняют свойств.

·Метод взвешенного слоя (или сушка в вакуум-сушильных шка-

фах) применяется для высушивания зернистых и пастообразных анти-

биотических препаратов.

Контроль препарата. Готовый антибиотик подвергается тщатель-

ному контролю: биологическому и фармакологическому.

При биологическом контроле ставится задача выяснения стериль-

ности готового препарата. Для этого обычно используют два метода.

Первый связан с инактивацией антибиотика и высевом его в соот-

ветствующую питательную среду. Например, биологический контроль

бензилпенициллина и полусинтетических препаратов, полученных на

его основе, проводится следующим образом. В пробирки, содержащие

тиогликолевую среду, вносят фермент пенициллазу в количестве, спо-

собном полностью инактивировать пенициллин. Пробирки с пеницилла-

зой выдерживают двое–трое суток при температуре 37

С для контроля

стерильности фермента, затем в них вносят раствор пенициллина. Про-

бирки разделяют на две группы: одну выдерживают при 37

С, а другую

– при 24

С в течение пяти суток. Ведут ежедневное наблюдение за воз-

можным развитием микроорганизмов.

Второй метод выяснения стерильности антибиотиков определяется

тем, что для большинства этих соединений не имеется инактиваторов их

145

биологической активности. Поэтому у изучаемых препаратов выявляют

устойчивые к ним формы микроорганизмов, а также определяют воз-

можное присутствие чувствительной микрофлоры. Для определения

возможного присутствия в таких препаратах чувствительной к ним мик-

рофлоры раствор антибиотика пропускают через мембранные фильтры с

диаметром пор не более 0,75 мк.

Фармакологический контроль. К антибиотическим веществам, ис-

пользуемых в медицинской практике, в соответствии с Государственной

Фармакопеей предъявляются очень строгие требования. Каждый новый

лекарственный препарат, прежде чем он будет разрешен к практическо-

му применению, должен пройти всесторонние испытания на токсич-

ность, пирогенность и другие свойства, жизненно важные для организ-

ма. Препарат изучают на разных видах животных в отношении его ост-

рой и хронической токсичности (влияние на кровь, ЦНС, дыхание и

т. д.). Показатели острой токсичности – один из критериев качества

антибиотического вещества. Устанавливают максимально переносимую

дозу (МПД) антибиотика; дозу, вызывающую гибель 50 % подопытных

животных (LD

) и смертельную дозу (LD

100

). Только после всесторон-

него и тщательного изучения препарата он может быть рекомендован к

практическому применению.

Расфасовка и упаковка антибиотика – завершающий этап работы.

Расфасованный и упакованный антибиотик с указанием показателя био-

логической активности, даты выпуска и срока годности поступает в

продажу.

Обобщая весь многостадийный и многоступенчатый процесс полу-

чения антибиотика, можно отметить, что он включает в себя четыре ос-

новные стадии:

I стадия – получение соответствующего штамма, продуцента анти-

био-тика, пригодного для промышленного производства;

II стадия непосредственно связана с процессом биосинтеза анти-

биотика;

III стадия – это процессы выделения и очистки образовавшегося в

ходе биосинтеза антибиотика;

IV стадия включает в себя операции, связанные с концентрацией

антибиотика, его стабилизацией и получением готового продукта.

Биотехнологический процесс получения антибиотиков можно

представить в виде следующей схемы (рис. 4.7).

Производство пенициллинов

В 1871 г. В .А. Манасеиным было установлено, что зеленая плесень

Penicillium glaucum при своем росте уничтожает бактерии, попадающие

146

в культуральную среду. Это свойство Penicillium было тогда же исполь-

зовано врачом А. Г. Полотебневым, применившим смоченные этой пле-

сенью повязки при лечении гнойных ран и язв.

Выдающееся открытие русских ученых не получило широкой из-

вестности, и в 1928 г. англичанин Александр Флеминг вторично обна-

ружил способность плесневого грибка Penicillium угнетать рост микро-

организмов. Было показано, что вызываемая плесенью гибель микробов

обусловлена образованием неизвестного органического вещества, на-

званного пенициллином. Однако выделение пенициллина в чистом виде

в то же время осуществлено не было, так как он оказался веществом

очень лабильным, а применявшиеся методы очистки были несовершен-

ны.

В годы Второй мировой войны огромная практическая потребность

в эффективных антибактериальных препаратах привлекла к пеницилли-

ну внимание широкого круга специалистов, и примерно с 1939 г. начал-

ся период интенсивных исследований. Благодаря этому в относительно

короткий срок (3–5 лет) англичанами Х. Флори и А. Чэттеном были раз-

работаны способы промышленного получения и очистки пенициллина,

изучены его лечебные свойства и методы клинического применения, а

также установлена его химическая структура.

К пенициллинам относится группа близких по химическим свойст-

вам соединений, содержащих в своей структуре b-лактамное и тиазоли-

диновые кольца:

COOH

R-COHN

R может иметь различные значения, в зависимости от типа пени-

циллина. Например, при R = –CH

- это бензилпенициллин; R = –

–О–C

- это феноксиметилпенициллин и т. д. Наличие карбок-

сильной группы придает молекуле пенициллина сильные кислотные

свойства, поэтому пенициллин легко образует соли со щелочами (Na,

K), а также с органическими основаниями, например с дибензилэтилен-

диамином (препарат – бициллин).

Для практических целей медицины пенициллин получают в про-

мышленности путем биосинтеза. Процесс биосинтеза складывается из

следующих стадий: 1) выращивания посевного материала (микроорга-

низмов) в аппаратах малой емкости – инокуляторах; 2) выращивания

посевного материала в больших посевных аппаратах; 3) процесса фер-

ментации; 4) выделения антибиотика из культуральной жидкости и его

очистки.

147

Важное значение имеет также селекционный подбор высокопроиз-

водительных штаммов плесени, подготовка и стерилизация питательной

среды и аппаратуры.

Очень важное значение для высокого выхода пенициллина имеет

питательная среда, примерный состав которой (в %) следующий:

Кукурузный настой – 3 (по объе-

му)

Сульфат цинка – следы

Лактоза (или глюкоза) – 2 (по ве-

су)

Карбонат кальция – 0,25

Нитрат натрия – 0,6 Магний сернокислый гептагидрат –

0,05

Калий фосфорнокислый (одноза-

мещенный) – 0,15

Вода ~ 90

Вместо какурузного настоя успешно применяется мука из хлопко-

вых семян или мясные гидролизаты.

Приготовленную питательную среду подвергают стерилизации.

Процесс ведут в колоннах непрерывного действия. Далее питательная

среда поступает в аппарат-выдерживатель, где охлаждается в течение

определенного времени до температуры 23–25

С.

Первая стадия процесса – выращивание стандартной колонии

штаммов плесени Penicillium chrysogenum – проводится в инокуляторах

на питательной среде, где процесс идет ~30 часов. Подготовленный

инокулят передают в посевной аппарат, объем которого ~ в 10 раз

больше объема инокулятора. В посевном аппарате находится также сте-

рилизованная питательная среда. Процесс роста здесь идет ~15–20 ча-

сов, и далее посевной материал передается на ферментацию в большие

реакторы – ферментаторы объемом до 100 м

на питательную среду.

Процесс ферментации идет ~70 часов при температуре 23–24

С, рН

среды 6–6,5 и постоянной аэрации воздуха – 1 л воздуха/1 литр пита-

тельной среды/1 мин по всему объему ферментатора.

148

Рис. 4.7. Схема производства антибиотиков в процессе микробного синтеза

149

Основная задача этого процесса – создание оптимальных условий

для развития продуцента и накопления антибиотика. Биосинтез анти-

биотика – двухфазный процесс. В течение первой фазы происходит бы-

стрый рост и размножение мицелия или бактериальных клеток. Культу-

ральная жидкость в этот период богата углеводами, азотом и неоргани-

ческим фосфором. Продукты обмена веществ микроорганизмов, в том

числе и антибиотики, находятся в малых количествах.

Вторая фаза начинается с момента замедления роста культуры.

Протекает она в культуральной жидкости, обогащенной продуктом

жизнедеятельности организма с небольшим количеством углеводов и

фосфора. В начале этой фазы мицелий обладает максимальной способ-

ностью к синтезу антибиотика. Фазы отличаются характером и интен-

сивностью биохимических реакций. С учетом этих различий подбирают

условия, благоприятные для первой и второй фаз развития продуцента.

Для увеличения выхода антибиотика в питательную среду вводят

«предшественники», т. е. химические вещества, способствующие целе-

направленному синтезу антибиотика. Так, в питательную среду при

биосинтезе пенициллина вводят «предшественник» фенилацетамид –

это увеличивает выход антибиотика более чем в 2 раза.

По окончании процесса ферментации культуральную массу пере-

дают на процесс выделения антибиотика.

Большинство продуцентов при биосинтезе выделяют антибиотик в

водную фазу, поэтому процесс выделения антибиотика начинается с

разделения твердой и жидкой фаз.

Твердая фаза, кроме массы мицелия, содержит значительное коли-

чество коллоидных примесей, затрудняющих фильтрование, поэтому

культуральную массу предварительно подвергают различным типам

коагуляции (электролитической, тепловой, кислотной и т. д.). Наиболее

эффективным методом коагуляции культуральной массы является ее

обработка флокулянтами (высокомолекулярными полиэлектролитами),

например, поли-(4-винил)-N-бензилтриметиламмонийхлоридом. Ос-

тавшийся от фильтрации мицелия водный раствор антибиотика направ-

ляют на химическую очистку и выделение. Таким образом, водный рас-

твор пенициллина направляют после фильтрации на экстракцию бутил-

ацетатом при рН водной среды, равной 2. При таком значении кислот-

ности среды подавляет кислотная ионизация пенициллина в водной фа-

зе и он переходит в органическую фазу (в бутилацетат). Реэкстракцию

пенициллина из бутилацетата проводят слабыми растворами щелочей.

Широко применяются сорбционные методы выделения и очистки

антибиотиков. В качестве сорбентов широко используются синтетиче-

ские ионообменные смолы.

150

Сушат пенициллины методом сублимации или распыления.

Угроза резистентности

Успехи применения бензилпенициллина в лечении болезней, вы-

званных различными бактериями, были поистине сенсационными. Чув-

ствительными к нему оказались и стафилококки, являющиеся возбуди-

телями очень серьезных заболеваний. Статистические данные показы-

вают, что в 1944 г. число инфекционных больных, вылеченных бензил-

пенициллином, было около 99,8 %, однако, уже в 1956 г. этот процент

снизился до 65 %, особенно большой процент инфицированных боль-

ных, не поддававшихся лечению бензилпенициллином, наблюдался сре-

ди работников предприятий, производящих антибиотики, и работников

хирургических клиник, широко использующих антибиотики для лече-

ния больных.

Почему же именно эти заведения стали рассадниками болезнетвор-

ных организмов, устойчивых к действию пенициллина? Уже со времени

первого применения пенициллина стало известно, что некоторые ста-

филококки невосприимчивы к нему. Чувствительные к пенициллину

штаммы стафилококков погибают при лечении, остаются резистентные

стафилококки, которые начинают размножаться и заполнять опустев-

шую нишу. И, таким образом, применение пенициллина для лечения за-

болеваний, вызванных резистентными формами стафилококка, не при-

ведет к положительному результату.

Каким же путем избегают гибели стафилококки, резистентные к

пенициллину? Было установлено, что они способны обезвредить моле-

кулу пенициллина, изменив его структуру в самом слабом месте. Устой-

чивые стафилококки вырабатывают фермент, который может разрушить

молекулу пенициллина при добавлении к ней молекулы воды. При этом

процессе (гидролизе) образуется соединение, безвредное для микробов.

Фермент, способствующий реакции «обезвреживания», называется

пенициллиназой. Его возникновение вызывается присутствием в среде

пенициллина. С 1969 г. стала известна и химическая структура пени-

циллиназы, вырабатываемой стафилококками. В построении ее молеку-

лы участвуют 257 структурных единиц двадцати аминокислот, соеди-

ненных в различной последовательности.

Другие бактерии образуют ферменты (ацилазы), которые разрыва-

ют связь между основным ядром молекулы бензилпеницилина и ее бо-

ковой ацильной группой, образуя биологически неактивную 6-

аминопеницилановую кислоту