Санагурський Д.І. Об’єкти біофізики: монографія

Подождите немного. Документ загружается.

381

Більш виразне збільшення в [3H]-ГАМК зв’язуванні з

мембранами гідри спостерігали за наявності загальних анестетиків.

Пропофол (100 пМ) та синтетичний стероїд, похідний

альфаксалону (10 пМ), збільшили зв’язування на 38 та 30 %

відповідно. Ці препарати також збільшували [3H]-ГАМК зв’язу-

вання з мембранами кори головного мозку щура (A. Concas et al.,

1991; N. Harrison et al., 1987).

Отже, кишковопорожнинні, особливо представники роду

Hydra, мають найпростішу та, ймовірно, еволюційно найстарішу

нервову систему серед тварин. У гідри нервова система

організована як нервова мережа, що пронизує тіло тварини, із

підвищеною концентрацією нейронів біля гіпостома та підошви

(J.A. Westfall, 1996). Нейропептиди, катехоламіни та ацетилхолін

були виявлені в цих тварин (M. Calberg, 1992; P. Castano, S. Rossi,

1978; G. Kass-Simon, L. Passano, 1978; A. Spenser, 1989), але їхні

біологічні функції вивчені набагато менше в гідри, ніж у гідроїдних

поліпів та медуз (A.N. Spenser, 1989). Завдяки роботам деяких

авторів (S. Bellis et al., 1991; G. Venturini, A. Carolei, 1992) з’явилася

нова інформація про фізіологічну роль цих нейротрансмітерів.

Доведено, що ГАМК збільшує тривалість харчової реакції у Hydra

vulgaris, а вплив ГАМК опосередкований популяцією ГАМК-

рецепторів при впливах бензодіазепінів (P. Pierobon et al., 1995).

Більше того, біохімічні дослідження засвідчили участь ГАМК у

пейсмекерних координаційних системах гідри (A. Pannacione et al.,

1996). Висновки, зроблені цими авторами, про те, що ГАМК-

рецептори Hydra vulgaris потенційно модулюються нейросте-

роїдами, дають можливість переконатися, що ця фармакологічна

382

властивість є давньою, і, що ці рецептори збереглися впродовж

еволюції.

Вивчали вплив бікукуліну – блокатора ГАМК-рецепторів –

на зміни електричної активності клітин гідри, початково фіксуючи

контрольні серії пачкової електричної активності (n = 7), коли

МПС становив –35,7 ± 2 мВ, амплітуда ПД 19,4 ± 0,5 мВ, кількість

ПД у середньому становила 7 в пачці, а тривалість пачки – 80 мс,

міжпачковий інтервал тривав 140 ± 0,3с.

Як виявилось, дія на клітини гідри зовнішнім розчином, в

якому наявний бікукулін у концентрації 5 мкмоль/л, призводила

до значних змін спонтанної електричної активності (рис. 10.5).

Протягом 10 хв від початку дії бікукуліну спостерігали

деполяризацію мембрани: від –39 ± 0,2 до –32 ± 0,4 мВ. Амплітуда

ПД зростала від 18,8 ± 0,3 до 28 ± 0,2 мВ. Далі настав розлад

пачкової активності та відбувалося генерування, переважно,

поодиноких ПД. Увагу привертає брак фази спокою між пачками

ПД, яка становила у контролі 140 ± 0,3 с, що може бути наслідком

усунення гальмівної дії ГАМК-рецепторів на генерування ПД з

частотою 7 за хвилину.

Рис. 10.5. Зміна пачкової електричної активності клітин ектодерми

гідри під впливом бікукуліну (5 мкмоль/л).

Примітка. Точкою позначено величину потенціалу спокою (–39 мВ). Стрілки

вказують на час дії блокатора

383

Дія бікукуліну в концентрації 10 мкмоль/л спричинювала

розлад ПЕА та збільшувала амплітуду ПД (рис. 10.6).

Простежувалася деполяризація мембрани: від –37 ± 0,2 до –25 ± 0,4

мВ, амплітуда ПД становила від 19,5 ± 0,2 до 35 ± 0,3 мВ.

Рис. 10.6. Зміна пачкової електричної активності клітин

ектодерми гідри під впливом бікукуліну (10 мкмоль/л).

Примітка. Точкою позначено величину потенціалу спокою (–38 мВ).

Стрілки вказують на час дії блокатора

Слід відзначити, що при дії бікукуліну зростала рухова

активність гідри. Такий ефект дії бікукуліну вдавалось усунути

шляхом його відмивання протягом 35 хв. Через 20 хвилин після

початку відмивання бікукуліну спостерігали відновлення ПЕА,

кількість ПД у пачках водночас зменшувалася, порівняно з

контролем. Через 30–35 хв повністю відновлювалося ПЕА.

Характерні зміни параметрів ПЕА при дії бікукуліну

спостерігали в концентрації 15 мкмоль/л (рис. 10.7). Через 5 хв від

початку впливу бікукуліну нами відмічено значне зростання

амплітуди ПД від 19,1 ± 0,2 до 39 ± 0,3 мВ та брак міжпачкового

інтервалу. Нормальна пачкова електрична активність клітин

з’являлася через 30–35 хв після відмивання.

384

Рис. 10.7. Зміна пачкової електричної активності клітин ектодерми гідри

під впливом бікукуліну (15 мкмоль/л).

Примітка. Точкою позначено величину потенціалу спокою (-39 мВ). Стрілки

вказують на час дії блокатора

Оскільки аплікація бікукуліну спричиняє розлад ПЕА та

збільшує амплітуду ПД, можна стверджувати про наявність ГАМК-

рецепторів, які відповідають за процеси гальмування електричної

активності, на зовнішній поверхні плазматичної мембрани клітин

ектодерми прісноводної гідри.

Іншою серією досліджень стала зміна електричної активності

клітин ектодерми гідри при дії конкурентних антагоністів

глютаматних рецепторів. Відомо, що NMDA- та нe-NMDA-

рецептори співіснують на постсинаптичній мембрані нейронів

спинного мозку та гіпокампа хребетних тварин (В. Edmonds et al.,

1995; С. Hammond, 1996; C. McBain, M. Mayer, 1994). Оскільки

відомості про наявність таких рецепторів у нервовій системі

кишковопорожнинних фрагментарні, метою чергової серії наших

досліджень було виявлення глютаматних рецепторів на

плазматичній мембрані клітин ектодерми Hydra oligactis Pallas з

використанням їхніх специфічних блокаторів.

Доведено, що селективні йонотропні глютаматні АМРА-

рецептори складаються з чотирьох близькоспоріднених

385

субодиниць: від GluR-1 до GluR-4 (або від GluR-A до GluR-D)

(С. Hammond, 1996). Чотири передбачені поліпептидні порядки,

кожен приблизно довжиною 900 амінокислот, засвідчили майже 70

% схожість (підрозділи GluR-1 та GluR-2) і 73 % (GluR-2 та GluR-3).

Ці субодиниці, виражені in vitro, є більш споріднені до АМРА та

менш споріднені до типу каїнатного рецептора глютаматних воріт

іонних каналів. За даними досліджень гібридизації in situ доведено,

що ці субодиниці достатньо та по-різному виражені в мозку вищих

тварин. Хоча ці різні субодиниці GluR здатні формувати

гомомеричні канали, коли вони виражені в ооцитах Xenopus або у

культивованих клітинах ссавців, вважають, що канали формуються

in vivo різними комбінаціями субодиниць. Отже, з чотирма

підрозділами рецептора вже є дуже велика кількість комбінацій

потенціалу, навіть якщо ще не відомо точної стехіометрії зв’язків

(природних угрупувань) субодиниці.

Відповідь струму на глютаматне використання

гомомеричних GluR каналів, виражених у трансфектованих

клітинах, вивчають у внутрішньоклітинному середовищі, яке

містить катіони Na

та Са

. У клітинах, які виражають лише GluR-

2 субодиницю, струм, спричинений глютаматом, наявний у

натрієвому розчині, але його майже немає у кальцієвому розчині.

Цей гомомеричний канал має низьке відношення дво- або

одновалентної проникності. Більше того, зв’язок гетеромеричного

GluR-2(R)+GluR-3 субодиниць формує непроникні олігомеричні

канали катіонів Са

в ооцитах. Ситуація інша в разі браку

субодиниці GluR-2(R), оскільки гомомеричні GluR-1 i GluR-2, або

гетеромеричні GluR-1 + GluR-3 канали відкриті для катіонів Са

Тому наявність позитивно зарядженого ланцюга однієї

386

амінокислоти (R) буде визначати відношення дво- або

одновалентної проникності і, отже, GluR-2(R) домінуватиме над

особливостями входу йона через гетеромеричний канал GluR (С.

Hammond, 1996).

NMDA-рецептори є проникні для одновалентних іонів та

катіонів Са

: вони блокуються катіонами Mg

при потенціалі

спокою, залежного від струму. Канали NMDA-рецепторів

активуються кількома агоністами, з яких NMDA є найбільш

ефективним. Вони формують катіон-селективні канали з високою

проникністю катіонів Са

, з винятковою чутливістю до катіонів

і залежністю від струму, а їхня діяльність модулюється

гліцином.

Для виявлення глютаматних рецепторів in vivo у клітинах

прісноводної гідри, ми використали специфічні блокатори NMDA-

peцепторів – Dl-APV у концентраціях 5, 10 та 15 мкмоль/л та

блокатор АМРА-рецепторів – CNQX у концентраціях 5, 10 та

15 мкмоль/л.

Дія CNQX у концентрації 5 мкмоль/л веде до поступового

припинення генерування пачкової електричної активності (рис.

10.8).

Рис. 10.8. Зміни ПЕА клітин гідри під дією CNQX (5 мкмоль/л).

Примітка. Точкою позначено величину потенціалу спокою (-39 мВ). Стрілки

вказують на час дії блокатора

387

Разом з тим МПС не зазнавав істотних змін. Повільні

коливання МПС, які у контролі супроводжують ПЕА, також не

простежувалися у разі дії концентрації CNQX. Однак спостерігали

поодинокі ПД, амплітуда яких становила 9,2 ± 0,4 мВ. Відновлення

ПЕА з контрольними параметрами відбувалося через 25 хв від

початку відмивання. CNQX у концентрації 10 мкмоль/л спричиняє

зворотне блокування генерування потенціалів дії повністю (рис.

10.9). Під час дії блокатора на клітини гідри рухова активність

об’єкта досліджень суттєво не змінювалася. Пачкова електрична

активність відновлювалася через 20 хв. Під час відмивання

зменшувалася кількість ПД: від 7 до 4,1.

Рис. 10.9. Зміни ПЕА клітин гідри під дією CNQX (10 мкмоль/л).

Примітка. Точкою позначено величину потенціалу спокою (–41 мВ).

Стрілки вказують на час дії блокатора

Рис. 10.10. Зміни ПЕА клітин гідри під дією CNQX (15 мкмоль/л).

Примітка. Точкою позначено величину потенціалу спокою (–45 мВ).

Стрілки вказують на час дії блокатора

388

Зі збільшенням концентрації CNQX до 15 мкмоль/л ми

спостерігали через 2 хв після введення розчину миттєве зникнення

пачкової електричної активності (рис. 10.10). Дія блокатора трива-

а 5 хв. Генерування ПД з’явилося через 30 хв після відмивання.

Отже, блокування ПЕА під дією CNQX дає змогу зробити

припущення про наявність функціональних глютаматних

рецепторів у системі, що генерує збудження епітеліально-м’язових

клітин гідри. Повне припинення генерування ПД під впливом

CNQX свідчить про те, що активування АМРА-рецепторів на

клітинах гідри є необхідною умовою виникнення та проведення

збудження між епітеліально-м’язовими клітинами гідри.

Дія D1-APV у концентрації 5 та 10 мкмоль/л спричиняла

блокування генерування ПД частково (рис. 10.11), однак

спостерігали серію поодиноких ПД, амплітуда яких становила 16 ±

0,3 мВ. Відновлення нормальної пачкової електричної активності

після початку відмивання відбувалося протягом 20 хв.

Рис. 10.11. Зміни ПЕА клітин гідри під впливом D1-APV (10 мкмоль/л).

Примітка. Точкою позначено величину потенціалу спокою (–39 мВ). Стрілки

вказують на час дії блокатора

Вплив D1-APV у концентрації 15 мкмоль/л, а також спільна

дія з блокатором АМРА-рецепторів CNQX призводить до повного

389

блокування генерування потенціалів дії з дальшим відновленням

після відмивання.

Отже, проведені нами дослідження дають можливість

стверджувати про наявність глютаматних рецепторів на рухових

нейронах клітин Hydra oligactis Pallas L., вважаючи, що АМРА- та

NMDA-рецептори гідри беруть участь у процесах збудження.

10.11. Åëåêòðîííî-

ì³êðîñêîï³÷íå äîñë³äæåííÿ

íåðâîâî-ì'ÿçîâèõ ñèíàïñ³â

ïð³ñíîâîäíî¿ ã³äðè

Для цього фіксують зразки клітин гідри в

1,5 % розчині глютарового альдегіду приготовленому в 0,2 М

розчині кокадилату Na

(рН=7,2) протягом 2 год при температурі

4 °С. Післяфіксацію проводять в 2 % розчині OsO

на цьому ж

буфері протягом 2 год. Зразки обезводнюють у зростаючих

концентраціях етилового спирту і поміщають в епоксидну смолу

Epon – 812 (J.H. Luft, 1961). Зрізи готують на ультрамікротомі

УМТП-6 за допомогою алмазного ножа; контрастували солями

свинцю за Рейнольдсом (E.S. Reynolds, 1963). При перегляді та

фотографуванні зразків вдалося отримати зображення

синаптичного контакту між закінченням нервової клітини та

епітеліально-м’язовими клітинами (рис. 10.12).

Припускаємо, що ГАМК- та глютаматні рецептори можуть

бути розміщені на постсинаптичній мембрані епітеліальних клітин

гідри, підставою є біохімічні та морфологічні докази наявності

390

синаптичних контактів між нервовими клітинами гідри (A. Jane et

al., 1997; J. Westfall, 1996) і між нервовими та епітеліально-

м'язовими клітинами (Andereson P.A. 1985), про що свідчать

виконані нами електронно-мікроскопічні дослідження (рис. 10.12).

Рис. 10.12. Синаптичний контакт між нервовою та епітеліально-

м'язовою клітинами гідри: 1 – епітеліально-м'язова клітина; 2 – нервова

клітина; 3 – синаптичний контакт.

Примітка. Біла лінія рівна шкалі 2,17 мкм