Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

Подождите немного. Документ загружается.

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 31 из 40

Занятие 7

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРИРОДНЫХ ОБЪЕКТОВ:

ПОЧВЫ, ВОДЫ, ВОЗДУХА.

КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ МИКРОФЛОРЫ

Цель занятия - определение степени обсемененности бактериями изу-

чаемого объекта; оценка чистоты воды, воздуха, рук, предметов обихода;

изучение культуральных и морфологических свойств микробов, выделенных

из исследуемых объектов; ознакомление с понятиями «смешанная» и «чис-

тая» культура, задачами и методами выделения

чистых культур.

Вопросы для обсуждения:

1. Способы подсчета колоний, выросших в чашках Петри.

2. Признаки колоний, учитываемые при изучении культуральных свойств

бактерий.

3. Определение понятий «смешанная» и «чистая» культура.

4. Задачи и методы выделения чистых культур микроорганизмов.

5. Принцип выделения чистых культур по методу Коха.

6. Определение чистоты культуры бактерий

План работы:

1. Ознакомиться с понятиями «смешанная» и «чистая» культура и методами

выделения чистых культур.

2. Самостоятельная работа.

Содержанием этого занятия является продолжение работы по опреде-

лению микробной обсемененности объектов, а именно, подсчет выросших на

твердой питательной среде колоний, изучение культуральных свойств коло-

ний, морфологических свойств бактерий, преобладающих в

объекте, и выде-

ление чистой культуры этих бактерий.

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 32 из 40

Выделение чистой культуры бактерий

Для выявления микроорганизмов, находящихся в изучаемом объекте,

определения их систематического положения (семейство, род, вид) и изуче-

ния их свойств необходимо, прежде всего, изолировать отдельные виды мик-

робов и вырастить их в виде так называемых чистых культур, а затем иден-

тифицировать - установить идентичность найденных видов микроорганизмов

видам, описанным

ранее в литературе.

Чистой культурой микроорганизмов называют культуру одного вида,

выращенную как потомство одной клетки.

Микроорганизмы чистых культур широко используются в технологии

при производстве антибиотических веществ, аминокислот, ферментов, мно-

гих пищевых продуктов (хлеб, вино, пиво, сыры и т. п.). Применение культур

микробов с известными свойствами дает возможность эффективнее исполь-

зовать

их деятельность - получать высокий выход и надлежащее качество

продукции.

В естественных условиях различные объекты (почва, вода, пищевые

продукты) содержат, как правило, смешанную микрофлору. Потому при изу-

чении состава микрофлоры того или иного объекта бактериологическое ис-

следование начинают с выделения микроорганизмов в виде чистых культур.

Существует несколько методов получения чистых культур. Отличают

ся они между собой приемами выделения из популяции одной-единственной

клетки. Чаще других используют метод, предложенный Кохом, это так назы-

ваемый чашечный метод или метод истощающего посева на плотной пита-

тельной среде.

Самостоятельная работа

1. Подсчет колоний, выросших на питательной среде в чашках Петри, и оп-

ределение микробного числа.

Изучение культуральных свойств колоний, выросших на МПА и СА.

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 33 из 40

3. Изучение морфологических свойств бактерий и грибов, преобладающих в

исследуемом объекте, путем микроскопирования фиксированных препара-

тов.

4. Выделение чистой культуры бактерий, преобладающих в исследуемом

объекте.

Методические указания

1. Подсчет колоний, выросших на питательной среде в чашках Петри и

определение микробного числа

Колонии бактерий подсчитывают обычно через 2 суток, колонии гри-

бов и

дрожжей - через 5-7 суток. Колонии, как правило, подсчитывают с по-

мощью лупы, не открывая чашек Петри. Для удобства отмечают просчитан-

ную колонию точкой на наружной стороне дна чашки, пользуясь стеклогра-

фом или чернилами по стеклу. Колонии подсчитывают следующими спосо-

бами: если они изолированы друг от друга, крупные и в небольшом количе-

стве

, то обычно их считают по всей поверхности чашки; при большом коли-

честве выросших колоний дно чашки Петри делят на секторы (4-6-8 и т. д.).

Подсчитывают в 2-3 секторах, находят, среднее арифметическое на один сек-

тор, а затем умножают на количество секторов. Или подсчитывают количест-

во колоний в каждом секторе и результаты суммируют;

если колонии очень

мелкие и их много, то следует пользоваться счетным аппаратом Вольфхюге-

ля. Аппарат состоит из черной: доски и стеклянной пластинки, разделенной

на квадраты площадью 1 см

. Чашки необходимо поставить на доску вверх

дном, покрыть стеклянной пластинкой и подсчитать колонии в квадратах по

диагонали (10-12), затем рассчитать среднее арифметическое на один квадрат

и пересчитать на площадь всей чашки, используя формулу S = πr

Очень удобны для подсчета колоний полуавтоматические счетчики.

Для подсчета колоний чашку Петри помещают на специальный столик, под-

свечиваемый снизу, и подсчитывают колонии пером с пружинным острием.

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 34 из 40

Острием пера касаются стекла в участке, где расположена колония, и нажи-

мают на перо. В результате на стекле остается метка, а держатель поднимает-

ся вверх, замыкая цепь, и показания счетчика увеличиваются на единицу.

Лучшее разведение то, при высеве из которого на плотной питательной

среде вырастает от 50 до 100 колоний.

Чтобы определить степень

обсемененности изучаемого объекта (мик-

робное число) необходимо результат подсчета количества колоний в чашках

Петри, помножить на знаменатель соответствующего разведения и вычис-

лить среднее арифметическое число из полученных цифр. Среднее арифме-

тическое число высчитывается только из цифр одного порядка. Например,

при анализе посева получили следующее количество колоний в чашках Пет-

ри: I - 150, II - 95, III - 8.

Полученные цифры умножаем на знаменатель соот-

ветствующего разведения:

I − 150х100 = 15000

II − 95х1000 = 95000

III − 7х10000 = 70000

180000:3= 60000

Следовательно, во взятой навеске исследуемого продукта содержится

60000 бактерий. По полученным результатам рассчитывают количество бак-

терий в 1 г или 1 см

исследуемого продукта. Основные этапы исследования

оформляются в таблицу.

При оценке микробной обсемененности поверхностей рабочих столов

санитарное состояние считается отличным, если общее количество микроор-

ганизмов на 1 см

от 0 до 100, хорошим - от 100 до 1000, удовлетворитель-

ным - более 1000, плохим - более 10000. Воздух нестерильных помещений

считается чистым при микробном числе до 1500, загрязненным - свыше 2500.

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 35 из 40

2. Изучение культуральных свойств колоний микроорганизмов,

выросших в чашках Петри на МПА

Для изучения качественного состава микрофлоры исследуемых объек-

тов необходимо, прежде всего, изолировать отдельные виды микробов и вы-

растить их в виде так называемых чистых культур, а затем, изучив их свойст-

ва (культуральные, морфологические и биохимические), определить система-

тическое положение (

семейство, род, вид) с помощью специальных опреде-

лителей микроорганизмов.

Чистой культурой называется масса клеток, состоящая из микроорга-

низмов одного вида, или потомство одной клетки.

Каждая изолированная колония, как правило, являясь потомством од-

ной клетки, будет чистой культурой.

Большое значение для идентификации бактерий (семейство, род, вид)

имеют культуральные признаки - это характер роста

бактерий на плотных и

жидких средах.

Для изучения культуральных свойств бактерий необходимо выбрать на

чашках Петри три хорошо обособленные колонии, причем наиболее типич-

ные, то есть преобладающие в посеве. Затем, не открывая чашек, приступить

к описанию внешних свойств колоний, обратив внимание на следующие при-

знаки:

а) форма (круглая, корневидная, неправильной

формы, амебовидная, ри-

зоидная и т. д.);

б) окраска (бесцветная, грязно-белые колонии относятся к бесцветным,

или пигментированная - белая, желтая, золотистая, красная, черная);

в) поверхность колоний (гладкая, шероховатая, бороздчатая, складчатая,

морщинистая, концентрически или радиально-исчерченная и т. д.);

г) профиль колонии (плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовид-

ный и т. д.);

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 36 из 40

д) блеск и прозрачность (колония блестящая, матовая, тусклая, мучни-

стая, прозрачная);

е) размер колонии (диаметр) измеряют с помощью обычной линейки и

указывают ее величину в миллиметрах. Точечными называют колонии менее

1 мм в диаметре; мелкие имеют 1-2 мм, средние - 2-4 мм и крупные - более 4

мм в диаметре;

ж) край колонии (ровный, волнистый, зубчатый,

бахромчатый и т. д.) оп-

ределяют при малом увеличении микроскопа или с помощью лупы. Чашку

помещают на предметный столик микроскопа;

з) структура колонии (однородная, мелкозернистая, крупнозернистая,

струйчатая и т. д.) определяется при малом увеличении микроскопа или с

помощью лупы;

и) консистенцию колонии определяют, прикасаясь к ее поверхности бак-

териологической петлей. Колония

может легко сниматься с агара, быть плот-

ной, мягкой или врастающей в агар; слизистой (прилипает к петле), тягучей,

хрупкой (легко ломается при прикосновении петлей).

Колонии, отличающиеся хотя бы по одному из указанных признаков,

следует рассматривать как разные типы. Каждому виду бактерий свойстве-

нен определенный характер колоний, по числу типов колоний

в чашках мож-

но иметь представление о разнообразии видового состава бактерий иссле-

дуемого объекта.

Описанные колонии (2-3) следует зарисовать в тетрадь.

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 37 из 40

3. Установление чистоты и морфологических свойств бактерий,

преобладающих в исследуемом объекте.

Микроскопия бактерий, окрашенных простым способом

Морфологическая характеристика бактерий включает форму клеток, их

сочетание и размер, подвижность, спорообразование. Изучение морфологи-

ческих свойств проводят, используя методы микроскопии. Для этого готовят

препараты живых и фиксированных окрашенных клеток.

Фиксированный окрашенный препарат готовят по способу «

простой

окраски». На готовый окрашенный препарат наносят каплю иммерсионного

масла и микроскопируют объективом с увеличением в 90 раз.

В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения

остается совершенно светлым и чистым, а окрашенными оказываются только

клетки микроорганизмов. При микроскопировании окрашенных препаратов

споры бактерий не прокрашиваются. Бактерии следует зарисовать. Убедиться

в чистоте

культуры. О чистоте культуры судят по однородности клеток. При

микроскопировании различных участков препарата необходимо сравнить

клетки бактерий. Сходство формы и размера клеток и спор (при их наличии)

служит доказательством чистоты культуры.

4. Выделение чистой культуры бактерий,

преобладающих в исследуемом объекте

Основным методом выделения чистых культур микроорганизмов явля-

ется метод, предложенный Кохом

. Принцип метода заключаются в получе-

нии чистой культуры из отдельной колонии, которую считают результатом

развития одной клетки.

Чтобы выделить чистую культуру из исследуемого объекта, необходи-

мо из описанных нами колоний выбрать одну, растущую наиболее изолиро-

ванно и преобладающую в посеве. Затем с помощью стерильной бактериоло-

гической петли взять небольшое количество

бактериальной массы из вы-

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 38 из 40

бранной колонии, слегка к ней прикасаясь. Необходимо внимательно сле-

дить, чтобы не задеть иглой близлежащие колонии. Петлю с бактериями вве-

сти в пробирку с «косым» мясопептоновым агаром, коснуться поверхности в

его нижней части и повести петлю вверх, скользя по поверхности агара (не

взрыхляя его) в виде штриха. При отвивке необходимо соблюдать

правила

асептики. На пробирку наклеить этикетку с указанием фамилии студента и

поставить пробирку в термостат.

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 39 из 40

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Гусев М.В. Микробиология : учебник. 4-е изд. / М.В. Гусев, Л.Н. Ми-

неева. М. : Издательский центр «Академия», 2003. 464 с.

2. Шлегель Т. Общая микробиология / Т. Шлегель М. : Мир, 1987. 566 с.

3. Практикум по микробиологии. Учебное пособие / Под. ред.

Н.С.Егорова. М. : изд-во Моск. ун-та, 1976. 308 с.

4. Лерина И.В., Педенко А.И. Лабораторные работы по микробиологии /

И.В. Лерина, А.И. Педенко. М. : Экономика, 1986. 128 с.

5. Елинов Н.П., Заикина Н.А., Соколова И.П. Руководство к лаборатор-

ным занятиям по микробиологии / Н.П. Елинов, Н.А. Заикина, И.П.

Соколова. М. : Медицина, 1988. 208 с.

6. Мудрецова

-Висс К.А., Колесник С.А., Гринок Т.И. Руководство к ла-

бораторным занятиям по микробиологии / К.А. Мудрецова-Висс, С.А.

Колесник, Т.И. Гринок М. : Экономика, 1975. 152 с.

7. Промышленная микробиология / под ред. Н.С. Егорова. М. : Высшая

школа, 1989. 688 с.

Учебное электронное текстовое издание

Сакович Галина Степановна

Безматерных Максим Алексеевич

ФИЗИОЛОГИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ УЧЕТ

МИКРООРГАНИЗМОВ

Редактор Е.А. Ишунина

Компьютерная верстка А.А. Шолина

Рекомендовано РИС ГОУ ВПО УГТУ-УПИ

Разрешен к публикации 10.11.05.

Электронный формат – PDF

Формат 60х90 1/8

Издательство ГОУ-ВПО УГТУ-УПИ

620002, Екатеринбург, ул. Мира, 19

e-mail: sh@uchdep.ustu.ru

Информационный портал

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ

http://www.ustu.ru